岳彩霞 陳 磊 王文魁 李桂蘭 胡永婷

(山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西 太谷 030801)

山楂酸(maslinic acid，MA)屬于三萜酸類物質(zhì)，存在于多種可食用的天然植物中，如山楂、紅棗、油橄欖和枇杷葉等[1-3]，具有抗炎、抗氧化和抗2型糖尿病等多種生物學活性[2,4-6]。已有研究[2]表明，山楂酸在體內(nèi)具有抑制急性炎癥的作用，對角叉菜膠誘導的大鼠足腫脹有保護作用。體外研究[3,7]也發(fā)現(xiàn)，MA的抗炎機制與抑制白介素6(Interleukin-6，IL-6)、白介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)等細胞因子的分泌有關(guān)。誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)是NO合成的調(diào)控因子，受細胞因子的誘導表達和調(diào)節(jié)[8-9]。Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)是重要的炎癥信號轉(zhuǎn)導途徑之一，能夠介導免疫應(yīng)答[10]。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性調(diào)控因子[11]。

目前，MA調(diào)控炎癥的研究主要集中于體外動物模型中抗炎效果的觀察及細胞模型中抑制炎癥因子的表達[2-3,12]。王樂旬等[7]研究發(fā)現(xiàn)MA可抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)機制可能與調(diào)控NF-κB、STAT3和AKT的活性相關(guān)，然而，MA在LPS誘導的RAW264.7細胞中是否通過調(diào)控STAT3的磷酸化發(fā)揮抗炎作用的具體分子機制尚不明確，研究擬利用課題組[13]前期建立的LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型，在體外細胞水平觀察MA對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)的影響，進一步探討MA能否通過調(diào)控STAT3的磷酸化來減輕LPS誘導的RAW264.7細胞的炎性反應(yīng)，為揭示MA的抗炎機制、綜合開發(fā)利用MA作為天然抗炎藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

RAW264.7細胞：中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.1.2 藥品與試劑

MA(CAS：4373-41-5)：純度≥98%，美國Sigma公司；

脂多糖(LPS)和DCFH-DA：美國Sigma公司；

DMEM培養(yǎng)基：美國gibco公司；

標準胎牛血清：杭州四季青生物技術(shù)有限公司；

核蛋白提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；

NO測試試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所；

IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA試劑盒：上海江萊生物技術(shù)有限公司；

β-actin抗體：北京中杉金橋生物公司；

STAT3和iNOS抗體：武漢三鷹技術(shù)有限公司；

p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)、JAK2、p-JAK2和SOCS3抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；

辣根過氧化物標記山羊抗鼠和山羊抗兔IgG：北京康為世紀生物科技技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5.0% CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2 給藥及分組 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，參照課題組[13]前期建立的LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型進行分組，分為對照組(以含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng))、LPS模型組(以含1 μg/mL LPS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)和山楂酸組(不同濃度的山楂酸預(yù)處理2 h后，再用含1 μg/mL LPS和相應(yīng)濃度山楂酸的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h)，每組至少設(shè)3個重復。

1.2.3 NO含量的測定 取對數(shù)生長期的細胞接種至96孔板，以不同濃度的LPS單獨刺激RAW264.7細胞24 h，并以不同濃度的山楂酸預(yù)作用細胞2 h后，再用含1 μg/mL LPS繼續(xù)培養(yǎng)進行試驗，每組設(shè)6個重復孔。培養(yǎng)結(jié)束后，按照試劑盒說明書進行NO含量的測定。

1.2.4 ELISA檢測相關(guān)的細胞因子 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，藥物作用培養(yǎng)結(jié)束后，吸取每組細胞的上清液，加入96孔板，按照ELISA試劑盒的操作說明，分別測定細胞因子IL-6、IL-1β和IL-10的含量，并進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 蛋白提取及Western blot試驗 按照試驗分組培養(yǎng)結(jié)束后，用現(xiàn)配的RIPA細胞裂解液裂解細胞30 min，提取各組RAW264.7細胞總蛋白，并按照核蛋白提取試劑盒說明書提取相應(yīng)的核蛋白。取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗(HRP標記)室溫孵育1 h后，暗室內(nèi)ECL顯色法曝光，進行蛋白條帶定量分析。

1.2.6 ROS的測定 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞接種于12孔板，按試驗分組進行細胞爬片，作用結(jié)束后，吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗，每組加入含10 μmol/L DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育細胞30 min，棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗。取出細胞爬片，在熒光顯微鏡(200×)下觀察熒光強度并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差，所有數(shù)值使用mean±SD表示，并設(shè)置多個重復，P<0.05、P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MA對RAW264.7細胞NO生成量的影響

由圖1(a)可知，與正常對照組相比，NO生成量隨LPS刺激濃度的升高顯著增加(P<0.01)；由圖1(b)可知，與LPS模型組相比，5，10，15，20，25 μmol/L MA干預(yù)后NO含量依次顯著降低(P<0.01)，且呈一定的劑量依賴性，而30 μmol/L MA作用后NO含量有所增加，可能與MA的劑量較大有關(guān)。綜上，MA可以明顯抑制由LPS引起的RAW264.7細胞的NO生成量增加。

1.空白組 2.LPS組 3.5 μmol/L MA+LPS 4.10 μmol/L MA+LPS 5.15 μmol/L MA+LPS 6.20 μmol/L MA+LPS 7.25 μmol/L MA+LPS 8.30 μmol/L MA+LPS ##.與對照組相比P<0.01 **.與LPS組相比P<0.01

2.2 MA對RAW264.7細胞因子釋放和iNOS蛋白表達的影響

由圖2(a)～圖2(c)可知，LPS刺激RAW264.7細胞后IL-6、IL-1β和IL-10釋放顯著增加，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，MA可不同程度地拮抗RAW264.7細胞中IL-6和IL-1β的釋放，而與LPS模型組相比，MA作用可顯著增加RAW264.7細胞中IL-10的含量(P<0.01)，且呈一定的劑量依賴性。研究表明，受LPS刺激的巨噬細胞會產(chǎn)生大量的炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等，導致炎癥細胞浸潤，與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]，而IL-10是巨噬細胞產(chǎn)生的一種重要的抗炎細胞因子，其表達對于炎癥在進行免疫干預(yù)治療方面十分關(guān)鍵[15]。研究結(jié)果顯示，MA能明顯抑制LPS誘導的RAW264.7細胞IL-1β、IL-6的釋放，增加IL-10的含量，從而可以較好地抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應(yīng)。

iNOS是重要的炎癥因子，在LPS的刺激下iNOS表達增加進而誘導NO的大量產(chǎn)生[16]。采用Western blot法檢測了LPS誘導后RAW264.7細胞中iNOS的表達，如圖2(d)和圖2(e)所示，10，15，20 μmol/L MA可劑量依賴性地抑制LPS誘導的iNOS蛋白的表達(P<0.05)，而20 μmol/L MA單獨刺激細胞，iNOS蛋白的表達與對照組無顯著差異(P>0.05)。NO是iNOS的產(chǎn)物，炎癥疾病發(fā)生時iNOS通常表達增加，因此抑制iNOS的表達對減輕炎癥反應(yīng)很重要[8-9,16]。在試驗中，可以得出MA能通過抑制LPS誘導的iNOS表達，進而抑制NO的釋放。

1.空白組 2.LPS組 3.10 μmol/L MA+LPS 4.15 μmol/L MA+LPS 5.20 μmol/L MA+LPS 6.20 μmol/L MA ##.與對照組相比P<0.01 #.與對照組相比P<0.05 **.與LPS組相比P<0.01 *.與LPS組相比P<0.05

2.3 MA濃度對RAW264.7細胞STAT3的影響

STAT3在調(diào)控iNOS過程中發(fā)揮了重要的作用[17]，利用Western blot檢測MA對LPS誘導的RAW264.7細胞STAT3的Y705和S727位點磷酸化產(chǎn)生影響，結(jié)果如圖3(a)所示，LPS刺激能快速誘導胞內(nèi)STAT3的酪氨酸和絲氨酸磷酸化，而經(jīng)不同濃度(5，10，15，20 μmol/L)的MA處理細胞后，胞內(nèi)p-STAT3(Y705)和p-STAT3(S727)蛋白的表達明顯被抑制(P<0.01)，且呈劑量依賴性。已有研究[18]表明，STAT3的磷酸化有助于STAT3的二聚化并促進其核轉(zhuǎn)位并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，由此猜測MA是否也抑制STAT3的入核，通過提取細胞核蛋白進行檢測，結(jié)果如圖3(b)所示，LPS刺激后STAT3快速入核，細胞經(jīng)MA處理后核內(nèi)p-STAT3(Y705)和p-STAT3(S727)蛋白表達顯著下降(P<0.05)，并且呈劑量依賴性。由此得出，MA能下調(diào)LPS誘導的RAW264.7細胞p-STAT3的表達并抑制STAT3的核轉(zhuǎn)位，p-STAT3的表達量與MA濃度具有明顯的量效關(guān)系。

1.空白組 2.LPS組 3.10 μmol/L MA+LPS 4.15 μmol/L MA+LPS 5.20 μmol/L MA+LPS 6.20 μmol/L MA+LPS ##.與對照組相比P<0.01 **.與LPS組相比P<0.01 *.與LPS組相比P<0.05

2.4 MA刺激時間對RAW264.7細胞STAT3的影響

選用20 μmol/L的MA預(yù)孵細胞2 h，1 μg/mL LPS分別作用細胞0，1，2，4，8 h后，檢測細胞和核內(nèi)p-STAT3的蛋白表達變化。如圖4所示，LPS刺激4～8 h時，MA能顯著降低胞內(nèi)STAT3的酪氨酸和絲氨酸磷酸化水平(P<0.05)，且呈一定的時間依賴性，在LPS刺激8 h時，MA能顯著降低核內(nèi)p-STAT3(Y705)和p-STAT3(S727)的表達(P<0.01)，由此表明，LPS誘導的RAW264.7胞內(nèi)p-STAT3的表達與MA濃度之間具有一定的時間依賴性。

1.空白組 2.LPS 1 h 3.LPS 2 h 4.LPS 4 h 5.LPS 8 h 6.空白組 7.20 μmol/L MA+LPS 1 h 8.20 μmol/L MA+LPS 2 h 9.20 μmol/L MA+LPS 4 h 10.20 μmol/L MA+LPS 8 h **.與LPS組相比P<0.01 *.與LPS組相比P<0.05

研究[19]表明，STAT3在增殖、生長、凋亡、免疫等重要的生理過程中發(fā)揮調(diào)控作用，而STAT3的異常活化可導致炎癥反應(yīng)與多種疾病相關(guān)。已有研究[20-21]證實，STAT3作為典型的炎癥信號通路可以調(diào)節(jié)iNOS及相關(guān)促炎因子包括IL-1β、IL-6和TNF-α等的表達。由此可以推測，MA可以通過對STAT3磷酸化的影響抑制其合成iNOS及對炎癥因子IL-1β和IL-6的釋放。

2.5 MA對RAW264.7細胞p-JAK2和SOCS3表達的影響

如圖5所示，與對照組相比，LPS模型組JAK2的磷酸化水平顯著升高(P<0.05)，SOCS3蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)；與LPS模型組相比，不同濃度的MA可抑制p-JAK2的蛋白表達(P<0.05)，而激活SOCS3蛋白表達(P<0.05)，并均呈一定的劑量依賴性。結(jié)果表明，MA能抑制JAK2的磷酸化水平，激活SOCS3的蛋白表達，與其抗炎機制相關(guān)。

1.空白組 2.LPS組 3.5 μmol/L MA+LPS 4.10 μmol/L MA+LPS 5.15 μmol/L MA+LPS 6.20 μmol/L MA+LPS ##.與對照組相比P<0.01 **.與LPS組相比P<0.01 *.與LPS組相比P<0.05

STAT3的激活依賴于JAK的活化，且有研究[22]表明，SOCS蛋白可以抑制JAK的活性。故檢測了MA對RAW264.7細胞中p-JAK2和SOCS3表達的影響，進一步確定MA對JAK/STAT通路的作用，試驗結(jié)果表明，MA可以通過調(diào)控JAK2/STAT3通路抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)。

2.6 MA對RAW264.7細胞ROS水平的影響

細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生對于炎癥信號傳導發(fā)揮著重要的作用。采用DCFH-DA檢測山楂酸對RAW264.7細胞中ROS水平的變化。熒光顯微鏡(200×)下觀察如圖6所示，與對照組相比，LPS刺激后熒光強度顯著增強(P<0.01)，不同劑量的山楂酸干預(yù)后，熒光強度依次減弱，表明ROS水平顯著被抑制(P<0.01)，提示山楂酸可能通過降低RAW264.7細胞胞內(nèi)ROS的釋放發(fā)揮抗炎作用。

圖6 MA對LPS誘導RAW264.7細胞ROS水平的影響

在巨噬細胞中，ROS可以作為第二信使參與細胞的增殖、分化和成熟，但在致病因子作用下，ROS在機體中迅速大量表達，通過激活胞內(nèi)多條信號通路包括JAK-STAT來誘導促炎因子的釋放和大量炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[23]。故測定了MA對RAW264.7細胞中ROS水平的影響，試驗結(jié)果顯示，MA能抑制LPS誘導的RAW264.7細胞ROS的釋放，與李桂蘭等[5]發(fā)現(xiàn)的MA具有一定的抗氧化功能相一致。

由此，根據(jù)研究結(jié)果和之前的相關(guān)研究，提出山楂酸發(fā)揮抗炎保護作用可能的分子機制如圖7所示。

圖7 山楂酸發(fā)揮抗炎保護作用的分子機制

3 結(jié)論

在脂多糖誘導的RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)模型中，山楂酸能通過抑制一氧化氮的生成、抑制白介素6和白介素1β釋放，增加白介素10的含量發(fā)揮抗炎保護作用，研究結(jié)果表明山楂酸可能通過抑制Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子3信號通路發(fā)揮抗炎作用，其機制還與抑制胞內(nèi)活性氧的釋放相關(guān)。但山楂酸如何通過活性氧調(diào)控Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子信號通路，山楂酸是否還可以通過其他一些方式來抑制Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子信號通路，相關(guān)的機制研究還有待進一步的深入。