王麗麗 趙思明 林親錄 程云輝 周夢(mèng)舟 張賓佳

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070；2.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；3.長沙理工大學(xué)，湖南 長沙 410114；4.湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430068)

隨著冷鏈物流行業(yè)的迅速發(fā)展，冷鏈?zhǔn)称芬颜紦?jù)中國食品市場的25%以上[1]。作為簡便經(jīng)濟(jì)、即開即食、食用人群廣泛的冷鏈產(chǎn)品，冷鏈米飯是將蒸煮后米飯的中心溫度迅速降低至10 ℃以下，并在后續(xù)的各個(gè)流通環(huán)節(jié)中使米飯中心溫度保持在10 ℃以下的方便主食。感官品質(zhì)及營養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良的冷鏈米飯具有十分廣泛的市場需求，但冷鏈米飯中的淀粉往往呈現(xiàn)較高的消化速率及快消化組分含量，致使餐后血糖水平高，易于加劇肥胖、糖尿病等代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。因而，適宜降低淀粉的消化速率對(duì)生產(chǎn)低血糖指數(shù)的高品質(zhì)冷鏈米飯具有重要意義。

米飯主要是由淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)組分構(gòu)成的凝膠體系，組分分子在不同尺度組裝形成短程有序結(jié)構(gòu)、結(jié)晶結(jié)構(gòu)、納米結(jié)構(gòu)和凝膠網(wǎng)絡(luò)，決定著米飯中淀粉的消化特性。前期研究顯示，米飯中淀粉長鏈比例的增加，有利于降低淀粉的消化速率[4]，而且其有序晶體含量越多、非周期性結(jié)構(gòu)越致密，慢消化淀粉的含量越高[5-6]。實(shí)際上，冷鏈米飯?jiān)诹魍ㄅc消費(fèi)過程中往往歷經(jīng)3 d以內(nèi)的低溫貯藏；且已有研究[7-8]表明貯藏過程可誘導(dǎo)蒸煮后的凝膠態(tài)淀粉鏈段組裝形成螺旋、結(jié)晶等結(jié)構(gòu)，從而改變淀粉的消化速率、慢消化組分含量等特征。據(jù)此分析，控制冷鏈米飯的貯藏時(shí)間等條件因素可修飾米飯的多尺度結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)控冷鏈米飯中淀粉的消化特性。然而，目前關(guān)于冷鏈米飯的研究多集中于加工及配送過程中的產(chǎn)品品質(zhì)的變化[9-13]，仍未系統(tǒng)揭示冷藏過程如何影響米飯的多尺度結(jié)構(gòu)及淀粉消化特性。

試驗(yàn)擬以冷鏈秈米飯為研究對(duì)象，利用體外消化方法考察冷藏時(shí)間對(duì)米飯的淀粉消化速率和慢/抗消化淀粉含量的影響，綜合運(yùn)用掃描電鏡、小角X射線散射、X射線衍射、紅外光譜等技術(shù)，研究冷鏈貯藏過程中米飯的微觀質(zhì)地、納米結(jié)構(gòu)、結(jié)晶結(jié)構(gòu)、短程有序結(jié)構(gòu)等不同尺度結(jié)構(gòu)的變化。在此基礎(chǔ)上，從米飯多尺度結(jié)構(gòu)水平探討短期貯藏(時(shí)間為1 d)如何強(qiáng)化米飯中慢消化淀粉組分的形成，為冷鏈米飯的淀粉消化特性調(diào)控及營養(yǎng)品質(zhì)提升建立了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大米：桃花香米，淀粉含量為83.98%(干基)，襄陽賽亞米業(yè)有限公司；

消化酶：A3176型α-淀粉酶(活性25 U/mg)和10115型葡萄糖苷酶(活性64 U/mg)，美國Sigma-Aldrich公司；

F006-1-1型葡萄糖試劑盒：南京建成生物有限公司；

其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電飯煲：CFXB50FC5-85型，浙江蘇泊爾股份有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，武漢科爾儀器設(shè)備有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：FD-1A-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

生物掃描電鏡：JSM-6390型，日本NTC公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：IS50型，美國Thermo Scientific公司；

X射線衍射儀：D8 ADVNCE型，德國布魯克AXS有限公司；

小角X射線散射儀：NanoSTAR型，德國Bruker-AXS公司。

1.2 方法

1.2.1 冷鏈米飯的制備 稱取300 g大米于電飯煲的內(nèi)鍋中，用蒸餾水淘洗一遍，按照m米∶V水=1.0∶1.3(g/mL)加入去離子水，利用“精煮模式”進(jìn)行蒸煮，經(jīng)蒸煮后米飯的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55.04%。將米飯冷卻至37 ℃，稱取30 g新鮮米飯置于液氮中冷凍并進(jìn)行冷凍干燥，將其余米飯按照30 g/份的量分別置于4 ℃ 的冷鏈環(huán)境中貯藏1～3 d，利用液氮冷凍后進(jìn)行冷凍干燥。凍干后的米飯保留部分完整的米飯粒，其余樣品粉碎并過40目篩，置于干燥器中備用。

1.2.2 掃描電子顯微鏡(SEM) 利用鑷子將待測的凍干米飯粒掰開，橫斷面向上置于粘貼有雙面導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，并將樣品臺(tái)置于離子濺射鍍膜儀中鍍金，取出樣品臺(tái)并置于樣品室中進(jìn)行觀察和拍照，儀器工作電壓為15 kV，樣品的放大倍數(shù)為2 000倍和5 000倍。

1.2.3 小角X射線散射(SAXS) 參照文獻(xiàn)[14]并適當(dāng)改動(dòng)，以含水量80%的粉碎米漿為測試樣品，測試前將樣品在26 ℃平衡2 h，然后將樣品置于樣品臺(tái)上，采用Pilatus 1M檢測器采集樣品的散射數(shù)據(jù)，檢測時(shí)間為10 s。以水作為背景，對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行背景扣除和歸一化處理。樣品數(shù)據(jù)散射角度q的范圍為0.1～5.0 nm-1。

1.2.4 X射線衍射(XRD) 參照文獻(xiàn)[15]，將預(yù)先平衡好水分的米飯粉末置于樣品池中，利用X射線衍射儀檢測樣品的衍射數(shù)據(jù)，掃描區(qū)域?yàn)?°～35°、步長0.02°、步速1 s，光源為0.154 2 nm波長的單色Cu-Kα X射線，測試管壓30 mV、管流20 mA。

1.2.5 傅里葉變換紅外光譜(FTIR) 將樣品置于傅里葉紅外光譜儀的衰減全反射附件上，在4 cm-1的分辯率下采集樣品在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍的譜圖，掃描次數(shù)為32次。以空氣作為背景，使用OMNIC軟件對(duì)所獲得的紅外光譜圖進(jìn)行基線校正、歸一化處理以及去卷積處理(增強(qiáng)因子為1.9、半峰寬為19 cm-1)，然后計(jì)算995 cm-1和1 022 cm-1處峰強(qiáng)度的比值。

1.2.6 體外消化特性 參照文獻(xiàn)[7]，稱取含有90 mg淀粉的米飯粉末并置于含有6 mL醋酸鈉緩沖溶液(pH 6)和6 mL蒸餾水的離心管中。在37 ℃的條件下，添加5 mL 的混合酶溶液(42 U/mL的α-淀粉酶和42 U/mL葡萄糖苷酶)，開始消化。分別在0，5，10，15，30，45，60，90，120 min等時(shí)間節(jié)點(diǎn)，取0.1 mL消化溶液并加入至0.9 mL 無水乙醇中以終止反應(yīng)。將混合溶液在4 000 r/min 下離心10 min。以1.0 mg/mL的葡萄糖溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，用葡萄糖試劑盒(GOPOD試劑)測定消化液的吸光值，根據(jù)式(1)計(jì)算淀粉消化量隨時(shí)間的變化。

(1)

式中：

SD——淀粉消化率，%；

Asample——樣品吸光值；

Aglucose——葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值；

10×210——21 mL的消化液中取0.1 mL并與0.9 mL 無水乙醇混合所涉及的換算系數(shù)；

162/180——淀粉葡萄糖單元與游離葡萄糖的質(zhì)量比。

通過一階動(dòng)力學(xué)方程[式(2)]和LOS方法[the logarithm of the slop；式(3)]進(jìn)一步轉(zhuǎn)換分析米飯淀粉的消化特性。

Ct=C∞(1-e-k×t)，

(2)

(3)

式中：

Ct——t時(shí)刻米飯淀粉的水解量，%；

C∞——消化結(jié)束時(shí)淀粉消化量的估算值，%；

k——消化速率常數(shù)，min-1。

根據(jù)計(jì)算出的消化數(shù)據(jù)(ln[(Ci+2-Ci)/(ti+2-ti)])和除最后兩點(diǎn)外的時(shí)間點(diǎn)[(ti+2+ti)/2]獲得LOS圖。根據(jù)ln(dCt/dt)與時(shí)間t數(shù)據(jù)的斜率變化反映消化速率不同的階段，并根據(jù)一階動(dòng)力學(xué)方程的非線性曲線的擬合得到相應(yīng)階段的淀粉消化速率k。同時(shí)，按照Englyst方法[16]，計(jì)算快消化淀粉(rapidly digestible starch，RDS)、慢消化淀粉(slowly digestible starch，SDS)以及抗消化淀粉(resistant starch，RS)的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

采用Excel 2010和SAS 9.2 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，顯著性分析水平為P<0.05，樣品數(shù)據(jù)均表述為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 微觀形貌

圖1為冷藏前后米飯斷面形貌的SEM圖片。由圖1可知，新鮮米飯(0 d)中不存在大米原料的淀粉顆粒，在丁毅等[17]的研究中也有類似現(xiàn)象。樣品呈三維多孔樣的疏松質(zhì)地，表明蒸煮過程中的水熱效應(yīng)充分破壞了淀粉及蛋白質(zhì)自身的有序結(jié)構(gòu)，促使淀粉糊化和蛋白質(zhì)變性從而成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)狀質(zhì)地。在冷藏環(huán)境中存放1 d能夠降低米飯質(zhì)地中孔洞的尺寸，這是由于貯藏過程中米飯的淀粉與蛋白質(zhì)分子逐漸從凝膠網(wǎng)絡(luò)壁中溶出，致使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)部分塌陷，從而形成更為均一的微觀質(zhì)地。延長貯藏時(shí)間進(jìn)一步弱化了米飯的多孔樣質(zhì)地，但程度相對(duì)較小。

圖1 不同冷藏時(shí)間米飯的掃描電子顯微鏡圖片

2.2 納米結(jié)構(gòu)

圖2為不同冷藏時(shí)間米飯的小角X射線散射圖譜。由圖2(a)可知，蒸煮后的新鮮米飯未呈現(xiàn)天然淀粉層狀結(jié)構(gòu)的散射峰[18-19]，但在0.5 nm-1附近出現(xiàn)了強(qiáng)度較低的寬散射峰，這是由于蒸煮過程中的水熱效應(yīng)完全破壞了大米原料中的天然淀粉層狀結(jié)構(gòu)[20]，但新鮮米飯中仍存在少量由淀粉及蛋白質(zhì)分子組裝形成的有序結(jié)構(gòu)，此類有序結(jié)構(gòu)在納米尺度上與無定型區(qū)域組裝構(gòu)成了非周期性的納米結(jié)構(gòu)[6]。

由圖2(b)可知，冷藏1 d后米飯散射峰的位置向小角度偏移至0.3 nm-1處，且其強(qiáng)度明顯增加，表明淀粉及蛋白質(zhì)分子在貯藏過程中形成了更多的有序結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)結(jié)合無定型區(qū)域形成了尺寸更大且更為規(guī)整的非周期性結(jié)構(gòu)[21]。同時(shí)，與新鮮米飯不同，冷藏后的米飯?jiān)?.9 nm-1也出現(xiàn)了明顯的散射峰，這是由于淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)(雙螺旋)與36個(gè)水分子借助氫鍵組裝形成了B型淀粉晶體的六方晶胞[7]。延長冷藏時(shí)間適度增加了兩個(gè)散射峰的強(qiáng)度，但并未明顯改變散射峰的位置。由此可知，增加冷藏時(shí)間促使米飯形成了更為規(guī)整的結(jié)晶結(jié)構(gòu)及非周期性結(jié)構(gòu)，但變化程度較低且非周期性結(jié)構(gòu)的尺寸未能進(jìn)一步增加。

圖2 不同冷藏時(shí)間米飯的小角X射線散射圖譜及洛倫茲校正后的圖譜

2.3 結(jié)晶結(jié)構(gòu)

圖3為不同冷藏時(shí)間米飯的X射線衍射圖譜。新鮮米飯(0 d)未呈現(xiàn)大米原料的A型淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)衍射峰[22-23]，主要以非晶態(tài)的形式存在，僅在2θ衍射角度20°附近呈現(xiàn)十分微弱的衍射峰。因此，蒸煮過程中的水熱效應(yīng)大幅破壞了大米結(jié)構(gòu)中的分子水平氫鍵網(wǎng)絡(luò)，致使大米中原有的A型淀粉晶體消失，僅存在少量的熱穩(wěn)定性較高的V型淀粉晶體[8]。

圖3 不同冷藏時(shí)間米飯的X射線衍射圖譜

與新鮮米飯相比，冷藏1 d后米飯的V型結(jié)晶峰適度增強(qiáng)，并在衍射角度17°附近呈現(xiàn)微弱的衍射峰；由此可知，米飯中的淀粉鏈段在冷藏過程中重組裝形成了B型淀粉晶體及V型淀粉晶體，這與前期研究中貯藏前后熱加工淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律相近[21]。然而，冷藏前后衍射圖譜中B型晶體特征峰強(qiáng)度的變化幅度，明顯低于小角散射圖譜中B型晶體特征峰強(qiáng)度的變化。這與以下原因有關(guān)：同步輻射裝置的小角散射圖譜對(duì)結(jié)構(gòu)的測試分辨率明顯優(yōu)于實(shí)驗(yàn)室裝置的衍射圖譜，而且淀粉分子具有十分典型的液晶特性[24]，其鏈段可在小角散射測試的水環(huán)境中轉(zhuǎn)化為近晶態(tài)，從而使冷藏過程中淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)的變化易于被觀測到。延長冷藏時(shí)間對(duì)米飯X射線衍射圖譜特征的影響較小，這與小角X射線散射結(jié)果的變化規(guī)律相似，即進(jìn)一步增加冷藏時(shí)間并未大幅度強(qiáng)化米飯的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。

2.4 短程有序結(jié)構(gòu)

圖4為冷藏不同時(shí)間米飯?jiān)?00～1 200 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜圖，此范圍的圖譜與C—O及C—C伸縮振動(dòng)有關(guān)，可用于表征淀粉構(gòu)象及其與水分子的相互作用[25]。研究證實(shí)，淀粉紅外譜圖中1 022 cm-1附近的吸收強(qiáng)度與無定型態(tài)淀粉的相對(duì)含量呈正相關(guān)，995 cm-1附近的吸收強(qiáng)度與淀粉螺旋等短程有序結(jié)構(gòu)的含量具有正相關(guān)關(guān)系[26-27]，相應(yīng)紅外吸收峰強(qiáng)度之比(R995 cm-1/1 022 cm-1)可用于表征淀粉類樣品中短程有序結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量[28-29]。

經(jīng)蒸煮后米飯的R995 cm-1/1 022 cm-1明顯降低，即蒸煮過程的水熱效應(yīng)亦明顯破壞了淀粉的螺旋內(nèi)氫鍵作用，從而大幅減少米飯中淀粉短程有序結(jié)構(gòu)的含量。課題組[6]近期研究也表明，蒸煮作用能夠明顯破壞糙米飯中淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)比例。較之新鮮米飯，貯藏1 d后米飯的R995 cm-1/1 022 cm-1明顯升高(見圖4)，即冷藏過程促進(jìn)了淀粉分子重組裝及短程有序結(jié)構(gòu)的形成。進(jìn)一步延長冷藏時(shí)間未能明顯增加R995 cm-1/1 022 cm-1的數(shù)值，該結(jié)果與結(jié)晶結(jié)構(gòu)及納米尺度結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律相近，即增加冷藏時(shí)間主要是提升短程有序結(jié)構(gòu)的規(guī)整程度但對(duì)其相對(duì)含量的影響較小。

2.5 消化特性

冷藏前后米飯的淀粉消化數(shù)據(jù)及其擬合曲線與LOS數(shù)據(jù)見圖5，樣品的消化特征參數(shù)如表1所示。新鮮米飯呈現(xiàn)消化速率明顯不同的兩個(gè)階段(階段一的消化速率k1高于階段二的消化速率k2)。前期研究也證實(shí)提取后的淀粉在消化過程中也可能呈現(xiàn)單個(gè)階段、兩個(gè)階段或3個(gè)階段[30-33]。由表1可知，冷藏過程降低了米飯的消化速率k1，促使米飯中的部分快消化淀粉RDS轉(zhuǎn)化為慢消化淀粉SDS，但未明顯改變階段二的消化速率k2及抗消化淀粉RS含量。冷藏1 d后米飯的慢消化淀粉含量達(dá)到40%左右。隨著冷藏時(shí)間延長至2 d，米飯的消化速率k1與k2、快消化淀粉RDS含量等特征參數(shù)未發(fā)生明顯改變，但其部分慢消化淀粉SDS轉(zhuǎn)化為抗消化淀粉RS；進(jìn)一步延長冷藏時(shí)間則未明顯改變米飯的消化特征參數(shù)。由此可見，改變冷鏈米飯的貯藏時(shí)間能夠調(diào)控冷鏈米飯的消化特性，1 d的短期冷藏能夠明顯降低米飯的消化速率k1，并顯著提升其慢消化淀粉SDS含量。該現(xiàn)象的形成機(jī)制可基于冷鏈米飯多尺度結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律以及淀粉消化的理論進(jìn)行探討。

表1 不同冷藏時(shí)間米飯的消化特征參數(shù)?

圖5 不同冷藏時(shí)間米飯的淀粉消化曲線、LOS曲線和非線性擬合曲線

米飯中淀粉的消化由α-淀粉酶、葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶等淀粉酶共同完成，酶分子在米飯結(jié)構(gòu)中的遷移及酶—淀粉鏈段復(fù)合物的形成決定著淀粉的消化速率等特征[34-35]。上述結(jié)果顯示，蒸煮過程中的水熱效應(yīng)明顯破壞了大米中的蛋白體和淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)、層狀結(jié)構(gòu)、結(jié)晶結(jié)構(gòu)和短程有序結(jié)構(gòu)，淀粉及蛋白質(zhì)分子從原有的多尺度結(jié)構(gòu)中解組裝，并結(jié)合水分子形成了多孔狀的凝膠體系。與新鮮米飯相比，短期冷藏過程(1 d)能夠降低米飯質(zhì)地中微孔的尺寸，誘導(dǎo)分子重組裝形成規(guī)整程度較低的短程有序結(jié)構(gòu)、B+V型淀粉晶體及尺寸更大的非周期性納米結(jié)構(gòu)，促使米飯中形成了更多的慢消化態(tài)的多尺度結(jié)構(gòu)域，減緩了結(jié)構(gòu)中酶分子的遷移及酶分子—淀粉鏈復(fù)合物的形成，由此降低米飯的淀粉消化速率并增加其慢消化淀粉含量，但未明顯促進(jìn)抗消化淀粉的生成。然而，延長冷藏時(shí)間雖未顯著改變米飯的微觀形態(tài)和其他尺度結(jié)構(gòu)的相對(duì)比例，但提升了米飯中非周期性納米結(jié)構(gòu)、淀粉晶體、短程有序結(jié)構(gòu)等的規(guī)整程度，促使部分慢消化態(tài)結(jié)構(gòu)區(qū)域轉(zhuǎn)化為抗消化態(tài)結(jié)構(gòu)域，抑制了消化酶分子活性位點(diǎn)對(duì)部分淀粉糖苷鏈段的吸附水解，導(dǎo)致慢消化淀粉含量降低和抗消化淀粉含量增加。

3 結(jié)論

試驗(yàn)從多尺度結(jié)構(gòu)變化的角度系統(tǒng)研究了貯藏過程中冷鏈米飯中慢消化淀粉組分形成的機(jī)制。結(jié)果顯示，時(shí)間為1 d的短期冷藏能夠明顯強(qiáng)化米飯中慢消化淀粉組分的形成。由結(jié)構(gòu)分析數(shù)據(jù)可知，短期冷藏過程一方面促使米飯中的分子鏈段重組裝形成短程有序結(jié)構(gòu)(淀粉螺旋等)、長程淀粉晶體以及尺寸更大的非周期性納米結(jié)構(gòu)，另一方面降低了米飯中微米尺度上的孔隙尺寸，即微觀質(zhì)地的均一性提升。此類結(jié)構(gòu)變化強(qiáng)化了米飯中慢消化態(tài)結(jié)構(gòu)域的形成，促使部分快消化淀粉轉(zhuǎn)化為慢消化淀粉并降低米飯中淀粉的消化速率，相應(yīng)米飯的慢消化淀粉比例可達(dá)40%左右。與此不同，更長時(shí)間的冷藏過程則提升了米飯微觀質(zhì)地的均一性和短程有序結(jié)構(gòu)、淀粉晶體以及非周期性納米結(jié)構(gòu)的規(guī)整程度，誘導(dǎo)部分慢消化態(tài)結(jié)構(gòu)區(qū)域轉(zhuǎn)化為抗消化態(tài)結(jié)構(gòu)域。