陳書程，陳 炯，酈特軍，鄭林燕，姚 瑤，王彩霞*

0 引言

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是常見的內(nèi)分泌疾病，影響了10%～25%的育齡婦女[1]，目前尚不清楚其病因和發(fā)病機制。近年來，胰島素抵抗在PCOS的發(fā)展中也發(fā)揮了作用。由于雄激素水平升高，PCOS患者的卵泡生成受損，可能出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)、多毛癥、痤瘡、脫發(fā)、不育或反復流產(chǎn)[2]。研究表明，PCOS患者的睪丸激素和黃體生成素濃度較高[3]。此外，大多數(shù)PCOS患者的肥胖和胰島素抵抗指數(shù)風險較高[4]。洋甘菊是南歐和東歐最常見的藥用植物之一，其主要活性成分包括酚類、類黃酮和植物雌激素[5-6]。洋甘菊提取物(Chamomile extract)具有抗炎、抗氧化、抗肝毒性、抗病毒、保護血管和解痙作用[7]。本研究觀察洋甘菊提取物對多囊卵巢綜合征大鼠的子宮內(nèi)膜組織、胰島素抵抗和瘦素、血脂水平的影響，進一步探討其作用機制，為臨床治療多囊卵巢綜合征提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 60只成年雌性Wistar大鼠(SPF級，180～200 g)購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心[實驗動物許可證號:SCXK(渝) 2019-0004]。實驗大鼠飼養(yǎng)于標準動物房中，自由飲食和進水，實驗動物設計嚴格經(jīng)過我院倫理委員會審查。大鼠適應環(huán)境2周后進行實驗。

1.1.2 試劑 洋甘菊提取物(HPLC≥98%)購自南京道斯夫生物科技有限公司，人絨毛促性腺激素(HCG)購自麗珠集團麗珠制藥廠，胰島素購自武漢優(yōu)爾生科技有限公司，黃體生成素、卵泡刺激素、睪丸激素、孕酮和雌二醇放射免疫分析試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，胰島素放射免疫分析試劑盒購自北京原子能生物研究所，瘦素、三酰甘油、膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白試劑盒購自深圳依諾金生物科技有限公司，HE染色試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多囊卵巢綜合征大鼠模型制備 按照文獻[8]進行造模，每只大鼠皮下注射HCG 30 U，每日1次，共22 d；同時每天注射1次胰島素，第1～11天皮下注射0.5 U，之后逐漸增加劑量為6.0 U，并按此劑量維持至第22天。每天藥物注射結(jié)束后，進行陰道涂片檢查，連續(xù)20 d，若大鼠完全失去動情周期性變化，提示造模成功。

1.2.2 分組及給藥 ①分組：Wistar大鼠分為4組，假手術組(sham組)、多囊卵巢綜合征組(PCOS組)、洋甘菊提取物低劑量組(PCOS+CHA-L組)和洋甘菊提取物高劑量組(PCOS+CHA-H組)，每組15只，除sham組外,其余3組進行造模。PCOS組、PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠按“1.2.1”進行PCOS模型制作，sham組在相同時間皮下注射無菌生理鹽水，共22 d。選取造模成功的大鼠進行后續(xù)實驗。②給藥方式：灌胃；給藥時間：造模結(jié)束后1 d，連續(xù)給藥30 d；給藥次數(shù)：1次/d。sham組：生理鹽水，4 ml/kg；PCOS組：生理鹽水，4 ml/kg；PCOA+CHA-L組：45 mg/kg的洋甘菊提取物，給藥體積為4 ml/kg；PCOS+CHA-H組：75 mg/kg的洋甘菊提取物，給藥體積為4 ml/kg。

1.2.3 取材 末次給藥2 h后，大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉。待麻醉后，稱取大鼠體重，并于腹主動脈取血，置于離心管中，3 000 r/min 離心15 min，吸取上層血清，于-80 ℃冰箱保存。摘除子宮組織，稱取子宮組織的重量，并于4%多聚甲醛溶液中固定；摘取胰腺組織，測量胰腺組織最寬和最窄部分取平均值，獲得胰島的直徑，并于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.4 血清樣本的檢測 取出-80 ℃保存的血清，置于冰上溶解。采用放射免疫分析法測定各組大鼠血清黃體生成素、卵泡刺激素、睪丸激素、孕酮和雌二醇的表達水平；采用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖的表達水平；采用放射免疫分析法測定胰島素的表達水平，并根據(jù)公式計算胰島素抵抗指數(shù)；ELISA法檢測血清中瘦素、三酰甘油、膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的表達水平。

1.2.5 HE染色 取子宮組織和胰腺組織，并將其固定在4%多聚甲醛溶液中，在乙醇中脫水，二甲苯中透明，并制成5 μm的石蠟切片。切片放入蘇木素染液中5 min，自來水清洗后，置于1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，并用流水沖洗。切片放入伊紅染液中染色3 min，流水稍洗。之后切片置于梯度酒精中脫水，各5 min，再放入二甲苯I、II中透明，分別5 min。將切片取出，用濾紙輕輕拭干切片上殘余的二甲苯，在組織上滴加中性樹膠封片，使用萊卡顯微鏡進行拍攝。

2 結(jié)果

2.1 洋甘菊提取物對各組大鼠體重和子宮指數(shù)的影響 如表1所示，與sham組相比，PCOS組大鼠體重和子宮指數(shù)明顯升高(P<0.01)；與PCOS組相比，PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠的體重和子宮指數(shù)下降(P<0.05)。

表1 各組大鼠體重和子宮指數(shù)的變化(n=15)

2.2 洋甘菊提取物對各組大鼠血清中促性腺激素和性激素表達的影響 如表2所示，與sham組相比，PCOS組大鼠血清中黃體生成素表達水平和睪丸激素表達水平顯著上升(P<0.001)，卵泡刺激素表達水平和雌二醇表達水平明顯下降(P<0.01，P<0.05)；與PCOS組相比，PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠血清中黃體生成素表達水平和睪丸激素表達水平下降(P<0.05)，卵泡刺激素表達水平和雌二醇表達水平上升(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清中促性腺激素和性激素的表達水平(n=15)

2.3 洋甘菊提取物對各組大鼠子宮組織病理變化的影響 大鼠子宮組織的病理學觀察見圖1，sham組中，子宮內(nèi)膜腺體正常，乳頭狀排列，被單層柱狀上皮覆蓋；細胞核排列整齊，未見核固結(jié)或核碎裂。PCOS組中，子宮內(nèi)膜腺體增生，鏡下可見假塑性柱狀上皮，細胞核突出但大部分為碎片，在視野中可以看到炎性細胞如嗜中性粒細胞；PCOS+CHA-L組中，子宮內(nèi)膜腺體輕度增生，腺體多為乳頭狀和管狀，細胞核排列整齊，但核仁不明顯，可見少量炎癥細胞；PCOS+CHA-H組中，子宮內(nèi)膜腺體正常，乳頭狀排列，未見炎性細胞。

圖1 HE染色觀察各組大鼠子宮組織的病理變化(200×)

2.4 洋甘菊提取物對各組大鼠胰島組織病理變化的影響 大鼠胰島組織的病理觀察見圖2，在sham組中，大鼠胰島組織的形狀和結(jié)構(gòu)正常，并且細胞以緊湊和有序的方式排列；在PCOS組中，胰島組織出現(xiàn)異常病變，細胞排列疏松；與PCOS組相比，PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠胰島組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)趨于正常，細胞排列緊密。

圖2 HE染色觀察各組大鼠胰腺組織的病理變化(200×)

2.5 洋甘菊提取物對各組大鼠胰島素、葡萄糖表達水平和胰島素抵抗指數(shù)的影響 如表3所示，與sham組相比，PCOS組大鼠血清胰島素含量、葡萄糖含量和胰島素抵抗指數(shù)明顯升高(P<0.01，P<0.05，P<0.01)；與PCOS組相比，PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠血清胰島素含量、葡萄糖含量和胰島素抵抗指數(shù)降低(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。

表3 各組大鼠胰島素、葡萄糖表達水平和胰島素抵抗指數(shù)的變化(n=15)

2.6 洋甘菊提取物對各組大鼠血清瘦素水平的影響 如表4所示，與sham組相比，PCOS組大鼠血清瘦素水平增加(P<0.05)；與PCOS組相比，PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠血清瘦素水平下降(P<0.05)。

表4 各組大鼠血清瘦素水平的變化(n=15)

2.7 洋甘菊提取物對各組大鼠血脂的影響 如表5所示，與sham組相比，PCOS組大鼠三酰甘油、膽固醇和低密度脂蛋白的含量明顯增加(P<0.01，P<0.01，P<0.001)，高密度脂蛋白含量明顯下降(P<0.01)；與PCOS組相比，PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠三酰甘油、膽固醇和低密度脂蛋白的含量明顯下降(P<0.05)，高密度脂蛋白含量增加(P<0.05)。

表5 各組大鼠血脂水平的變化(n=15)

3 討論

西醫(yī)認為，遺傳因素、高黃體生成素、糖脂代謝異常、高胰島素血癥和胰島素抵抗、高雄激素血癥、低度炎癥反應、肥胖、卵巢功能異常和青春期過度是PCOS的病因和發(fā)病機制[9-11]。

洋甘菊為菊科母菊屬德國洋甘菊，為菊科植物洋甘菊干燥的花或全草。洋甘菊具有降低血壓、降低膽固醇、發(fā)汗通便等功效[12]。研究發(fā)現(xiàn)，洋甘菊提取物對小鼠有降血糖作用，并且能改善小鼠糖耐量，可用于臨床治療糖尿病[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，洋甘菊提取物可使大鼠的體重和子宮指數(shù)下降，黃體生成素表達水平和睪丸激素表達水平下降，卵泡刺激素表達水平和雌二醇表達水平上升；也可使子宮內(nèi)膜腺體正常，乳頭狀排列，炎性細胞減少，也使胰島組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)趨于正常，細胞排列緊密。

胰島素抵抗在PCOS中發(fā)揮著重要作用，其中大約有45%～65%的患者均存在不同程度的胰島素抵抗，且PCOS患者患有2型糖尿病的風險顯著增加[14]。研究顯示，黃酮類(如洋甘菊提取物)化合物具有降糖、改善胰島素抵抗、抑制相關葡萄糖代謝酶活性和抗糖尿病氧化損傷等作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS組大鼠血清胰島素含量、葡萄糖含量和胰島素抵抗指數(shù)明顯升高，而洋甘菊提取物使大鼠血清胰島素含量、葡萄糖含量和胰島素抵抗指數(shù)降低，與上述文獻報道一致。

瘦素是一種由OB基因編碼的脂肪細胞衍生的激素，對嚙齒動物的生殖功能有重要影響。循環(huán)中的瘦素水平與肥胖癥直接相關，而肥胖癥通常與PCOS有關，高胰島素血癥和胰島素抵抗通常與瘦素及其受體有關[16]。Rizk等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS與瘦素水平升高有關，表明了瘦素在PCOS發(fā)病機制中的作用。潘愛珍[8]等研究發(fā)現(xiàn)，蒼附導痰湯可通過降低體重、增加胰島素敏感性、調(diào)節(jié)瘦素、脂聯(lián)素和生殖激素的水平，從而改善大鼠生殖功能。本研究發(fā)現(xiàn)，洋甘菊提取物能降低胰島素抵抗指數(shù)，PCOS組大鼠血清瘦素水平增加，洋甘菊提取物使大鼠血清瘦素水平下降。

研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者同時患有高血壓和血脂異常的頻率明顯增加[18]，另一項研究中發(fā)現(xiàn)，患有PCOS的女性比健康女性的冠狀動脈疾病發(fā)生率高63%[19]。因此，應將血脂異常納入PCOS的日常健康治療方案中。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS組大鼠三酰甘油、膽固醇和低密度脂蛋白的含量明顯增加，高密度脂蛋白含量明顯下降，洋甘菊提取物可使大鼠三酰甘油、膽固醇和低密度脂蛋白的含量明顯下降，高密度脂蛋白含量增加。

綜上所述，洋甘菊提取物可通過降低體重、子宮指數(shù)和胰島素抵抗指數(shù)，調(diào)節(jié)性激素、瘦素和血脂水平，從而改善PCOS大鼠的生殖功能。因此，洋甘菊提取物用作治療PCOS的可選藥物，可為臨床上治療PCOS提供新的理論依據(jù)。