劉芳，季良，陳男男，姜海燕，陳志赫，杜寧

1.佳木斯市中心醫(yī)院感染科，黑龍江佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江佳木斯 154002

乙型肝炎病毒（Hepatitis B vi-rus，HBV）大量復(fù)制是乙肝肝硬化發(fā)生的危險(xiǎn)因素，而乙肝肝硬化又可進(jìn)展為肝癌［1-2］。甲胎蛋白異質(zhì)體-3（α-fetoprotein，AFP-L3）是一種糖蛋白，血清AFP-L3水平隨著肝細(xì)胞癌的生長而呈線性增加，對(duì)肝癌具有高度特異性［2］。超敏C反應(yīng)蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）是由肝臟產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，它是一種敏感的急性期反應(yīng)蛋白，與炎癥程度，感染和身體組織損傷有關(guān)［3］。肝癌患者的hs-CRP水平明顯高于其他良性肝病。HBV感染者部分發(fā)展成肝炎，部分為正常攜帶者，也有部分發(fā)展成肝硬化和肝癌。相關(guān)報(bào)道［4］表明高水平乙肝病毒載量（HBV-DNA）是HBV感染者發(fā)生肝硬化和原發(fā)性肝癌的危險(xiǎn)因素。研究報(bào)道［5］，血清HBV DNA負(fù)荷可預(yù)測感染HBV的肝硬化患者。目前，聯(lián)合使用HBV DNA、AFP－L3和hs-CRP等指標(biāo)診斷乙肝肝硬化與乙肝相關(guān)性肝癌的研究鮮見報(bào)道，本研究探討這三種指標(biāo)在診斷乙肝肝硬化與乙肝相關(guān)性肝癌中的價(jià)值。

1資料與方法

1.1 一般資料

選取佳木斯市中心醫(yī)院確診的80例乙肝肝硬化患者（肝硬化組）、80例乙肝相關(guān)性肝癌患者作為肝癌組，研究對(duì)象納入時(shí)間2018年7月—2020年7月。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）乙肝患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2018年中國《慢性乙型肝炎防治指南》中的標(biāo)準(zhǔn)；（2）肝硬化、肝癌的診斷依據(jù)CT、MRI、穿刺活檢證實(shí)；（3）肝硬化、肝癌患者均具有明確的乙肝病史；（4）本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，獲得研究對(duì)象的知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有膽道、胃腸道及全身其他部位腫瘤；（2）合并全身感染性疾病；（3）合并其他類型病毒肝炎；（4）酒精性肝硬化；（5）近6個(gè)月內(nèi)具有胃腸道手術(shù)史、腦血管病史、外傷病史等。

肝硬化組，年齡52～77歲，平均年齡（65.7±8.3）歲，其中男性51例、女性29例；乙肝病史（11.3±4.2）年；Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)28例、B級(jí)52例。肝癌組，年齡46～79歲，平均年齡（65.1±10.3）歲，其中男性47例、女性33例；乙肝病史（12.0±3.8）年；Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)33例、B級(jí)47例。兩組患者的年齡、性別、乙肝病史、Child-Pugh分級(jí)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

取兩組患者空腹時(shí)的靜脈血，在室溫下20 min后，以3 000 r/min離心15 min。留取血清保存于-80℃冰箱中待測。定量q RT-PCR檢測HBV DNA：制備PCR反應(yīng)液（35.6μlHBV反應(yīng)混合物+0.4μl Taq酶），加入2μl待測樣品，每管中陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，混勻并離心，放入q RT-PCR儀中，在95℃下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增3 min，在94℃下進(jìn)行15 s，在60℃下進(jìn)行30 s，收集FAM和HEX通道熒光信號(hào)，并記錄檢測結(jié)果。電化學(xué)發(fā)光法檢測AFP-L3，取400μl患者血清，加入600μl洗滌液混合。將親和吸附離心管的上部離心管置于離心管外管中，通過以3 000 r/min，離心30 s除去保護(hù)液。將稀釋的血清600μl移液到上部離心管中，在室溫下靜置10 min，加入清洗液1 ml再以相同條件離心，棄去上清液，加入600μl洗脫液，再離心，收集離心柱外管中的液體，即樣本，通過電化學(xué)發(fā)光法檢測AFP-L3含量。采用乳膠增強(qiáng)免疫透射比濁法檢測hs-CRP水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝硬化組和肝癌組患者的AFP-L3、hs-CRP及HBV-DNA水平比較

肝硬化組患者的AFP-L3、hs-CRP及HBV-DNA水平顯著低于肝癌組患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 肝硬化組和肝癌組患者的AFP-L3、hs-CRP及HBV-DNA水平比較（±s）

表1 肝硬化組和肝癌組患者的AFP-L3、hs-CRP及HBV-DNA水平比較（±s）

組別肝硬化組（n=80）肝癌組（n=80）tP AFP-L3（μg/L）101.7±33.0 311.8±86.4-20.318 0.000 hs-CRP（mg/L）1.78±0.70 5.33±1.84-16.129 0.000 HBV-DNA（log copies/ml）4.28±1.04 5.18±1.40-4.616 0.000

2.2 AFP-L3、hs-CRP及HBV-DNA水平鑒別診斷肝癌、肝硬化的價(jià)值

血清AFP-L3水平鑒別診斷肝癌、肝硬化的靈敏度為96.13%、特異度為87.04%、ROC曲線下面積AUC值為0.928；hs-CRP檢測鑒別診斷肝癌、肝硬化的靈敏度為88.14%、特異度為81.17%、ROC曲線下面積AUC值為0.852；HBV-DNA檢測鑒別診斷肝癌、肝硬化的靈敏度為54.27%、特異度為76.84%、ROC曲線下面積AUC值為0.694（表2、圖1）。

表2 AFP-L3、hs-CRP及HBV-DNA水平鑒別診斷肝癌、肝硬化的價(jià)值

圖1 AFP-L3、hs-CRP及HBV-DNA水平鑒別診斷肝癌、肝硬化的ROC曲線

3 討論

目前，最常用的肝癌血清標(biāo)志物是甲胎蛋白，但其敏感性僅為40%～65%。也有部分肝癌患者血清中沒有高水平的甲胎蛋白，用來區(qū)分肝癌和肝硬化存在很大誤差［6］。近年來，AFP-L3作為肝癌的新腫瘤標(biāo)志物逐漸引起人們的關(guān)注［7］。AFP-L3是肝癌細(xì)胞獨(dú)有的，是肝癌檢測的新腫瘤標(biāo)志物之一。美國食品和藥物管理局于2005年批準(zhǔn)AFP-L3用于肝癌的診斷和早期預(yù)警，并協(xié)助診斷肝癌。AFP-L3可有效判斷肝臟疾病的良惡性病變，并與肝癌的惡性程度有關(guān)［8］。然而，肝硬化患者血清中不同肝癌腫瘤AFP-L3的表達(dá)，特別是由不同原因引起的肝硬化患者血清中的AFP-L3表達(dá)很少報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示肝硬化組患者的AFP-L3水平顯著低于肝癌組患者，許多研究表明［9］，即使在甲胎蛋白水平較低的患者中，AFP-L3也高表達(dá)，AFP-L3也是甲胎蛋白陰性早期肝癌的良好標(biāo)志物。AFP-L3具有高特異性，可用于肝癌患者的術(shù)后隨訪。如果手術(shù)后沒有轉(zhuǎn)為陰性，AFP-L3往往會(huì)導(dǎo)致預(yù)后失敗。

hsCRP是由肝臟合成的蛋白質(zhì)，當(dāng)人體被微生物入侵或組織損傷感染時(shí)，hsCRP可與血小板活化因子結(jié)合，減少炎癥反應(yīng)。hsCRP還具有激活補(bǔ)體和促進(jìn)粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬作用的功能。當(dāng)發(fā)生炎癥時(shí)，血液中CRP的濃度增加。hsCRP在人體的自然免疫過程中起著重要的保護(hù)作用。當(dāng)身體受到微生物入侵或組織損傷刺激時(shí)，它是肝細(xì)胞合成的急性期蛋白，其在各種肝病中增加。hsCRP主要由白細(xì)胞介素-6，白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α刺激的肝細(xì)胞合成［10］。這些都是重要的主要炎癥因子，并且在損傷反應(yīng)期間由單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)釋放的多肽促進(jìn)hsCRP的合成和釋放，其與脂蛋白組合激活補(bǔ)體系統(tǒng)，補(bǔ)體系統(tǒng)反過來產(chǎn)生大量終末復(fù)合物，導(dǎo)致內(nèi)膜損傷。在急性期反應(yīng)的高峰期，20%的肝臟合成蛋白質(zhì)的能力可以直接轉(zhuǎn)移到hsCRP的合成［11］，因此肝臟疾病患者的hsCRP會(huì)增加。本研究結(jié)果顯示：肝癌組與肝硬化組hsCRP比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肝癌組高于肝硬化組，顯示，隨著肝內(nèi)炎癥程度的增加，肝功能損害程度依次增加，預(yù)后質(zhì)量依次降低。這是因?yàn)槟[瘤本身釋放細(xì)胞因子，巨噬細(xì)胞浸潤或相關(guān)感染或組織壞死。hsCRP水平升高表明預(yù)后不良并且通常表明轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散。

研究表明，如果HBV感染的病情得不到有效控制，很容易發(fā)展為對(duì)患者極為有害的肝衰竭，肝硬化和肝癌。目前，在HBV感染的患者中，HBV-DNA檢測具有高度特異性和敏感性，HBV-DNA檢測結(jié)果表明HBV復(fù)制具有傳染性。HBV-DNA檢測結(jié)果越高，病毒復(fù)制越高，感染性越強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，肝硬化組患者的HBV-DNA水平顯著低于肝癌組患者，表明HBV-DNA可作為診斷肝硬化和肝癌的指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)生與DNA損傷密切相關(guān)，幾乎所有HBV誘導(dǎo)的肝癌都可以發(fā)現(xiàn)整合的病毒DNA。HBV DNA復(fù)制水平可能在原發(fā)性肝癌的發(fā)展中發(fā)揮作用，因?yàn)楦咚降腍BV DNA復(fù)制可能導(dǎo)致更多HBV DNA整合到肝細(xì)胞核酸中，增加突變的可能性，并激活癌基因，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。

三種標(biāo)志物的敏感性，特異性均較好，但是，這項(xiàng)研究仍有一定的局限性。這次選擇的樣本量很小，并且容易產(chǎn)生選擇性偏差。同時(shí)，HBV DNA，AFP-L3在肝硬化與肝癌患者中的作用機(jī)制尚未完全明確，需要進(jìn)一步研究。王瑜等［12］通過對(duì)乙型肝炎肝硬化與癌變患者血清中AFP-L3及HBV DNA的聯(lián)合檢測，探討其在肝硬化癌變診斷中的價(jià)值，醫(yī)院也得出類似結(jié)論，但醫(yī)院還對(duì)hsCRP這一驗(yàn)證指標(biāo)進(jìn)行分析，更加全面地探究鑒別肝硬化與肝癌的指標(biāo)。

綜上所述，肝癌患者的AFP-L3、hs-CRP及HBV-DNA水平較肝硬化患者升高更加明顯，根據(jù)上述三項(xiàng)指標(biāo)在乙肝肝硬化、乙肝相關(guān)肝癌的鑒別診斷中有一定的價(jià)值。