許麗麗，陳艷，陳征宇，葛衛(wèi)紅，江程，張險峰

(1.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院藥學部，南京 210008；2.中國藥科大學基礎醫(yī)學與臨床藥學學院，南京 210009；3.國際藥學聯(lián)合會，荷蘭海牙 999025；4.中國藥科大學藥學院，南京 210009；5.湖北省疾病預防控制中心，武漢 430070)

疫苗一詞是“疫苗之父”巴斯德(Louis Pasteur)為紀念先驅者琴納(Edward Jenner)發(fā)明牛痘苗(vaccine)而創(chuàng)造，指由減毒或滅活微生物制成、能夠針對疾病產生免疫力的生物制品。隨著生物技術的發(fā)展，疫苗的概念被不斷拓展。世界衛(wèi)生組織(WHO)將疫苗定義為“含有免疫原性物質，能夠誘導機體產生特異性、主動性和保護性宿主免疫，能夠預防感染性疾病的一類異源性藥學產品，包括預防和治療性疫苗”[1]。

回顧人類歷史，疫苗作為人類與疾病斗爭的有力武器，消滅或控制了許多傳染病。接種疫苗是當前人類預防傳染病最有效、最經濟的措施之一。通過大范圍接種疫苗，1979年WHO宣布全球范圍內消滅了天花。脊髓灰質炎、鼠疫、麻疹、狂犬病、百日咳、破傷風、乙型病毒性肝炎(乙肝)等發(fā)病率也通過接種疫苗大幅降低。

1 疫苗發(fā)展簡史

將異物引入人體以防止病原體入侵的做法始于我國11世紀，當時人們將天花痊愈者皮膚痘痂研磨成粉，吹入健康兒童鼻腔以預防天花[2]。該技術傳到歐洲后，英國醫(yī)生琴納于18世紀末對其進行了改進，用毒性明顯減小的牛痘代替人痘。疫苗的研發(fā)也以此為開端，進入了漫長的的發(fā)展歷程。

疫苗從誕生至今，其技術發(fā)展經歷了3次革命[3]。第一次始于19世紀末，巴斯德研制成功雞霍亂疫苗、羊炭疽疫苗和狂犬疫苗，并利用生物傳代和物理化學方法處理病原體，得到減毒和滅活疫苗；第二次發(fā)生在20世紀80年代，其標志是以酵母制造乙肝疫苗。這一階段，以重組DNA技術為代表的分子生物學技術的發(fā)展，使疫苗的研究從整體病原體水平進階到分子水平；第三次是20世紀90年代研制成功核酸疫苗，該技術最早由美國的沃夫(Wolff)等發(fā)明。

截至2017年底，全球共有預防性疫苗77種，可預防疾病41種[4]。人類疫苗發(fā)展概況見表1[5]。

表1 人類疫苗發(fā)展概況Tab.1 Outline of the development of human vaccines

2 疫苗的種類

疫苗種類繁多，根據(jù)研制技術、疫苗性質、國家規(guī)劃、預防種類、使用方法及用途等分類，見表2。筆者在本文簡要介紹按研制技術分類的主要疫苗。

表2 疫苗分類Tab.2 Classification of vaccines

2.1傳統(tǒng)疫苗

2.1.1減毒活疫苗 減毒活疫苗是將細菌、病毒等病原體及其代謝物，通過培養(yǎng)繁殖或接種于培養(yǎng)物(如動物宿主、雞胚、組織、細胞等)生長繁殖等處理后，使其毒性減弱，接種到人體，引發(fā)免疫反應的疫苗[6]。減毒活疫苗是傳統(tǒng)疫苗，尤其是病毒性疫苗的主要研制方向，其研發(fā)關鍵是選擇和培育毒性適合、致敏性低、遺傳性質穩(wěn)定的菌種或毒種。常用的減毒方法有體內/外傳代減毒法、低溫培養(yǎng)篩選法和誘變法[1]。

2.1.2滅活疫苗 滅活疫苗是采用適宜的培養(yǎng)方法繁殖大量病原體后，再用物理(高溫)或者化學(甲醛水溶液或β-丙內酯等)方法滅活，保留其免疫原性而制得的疫苗。一般選用抗原性廣、穩(wěn)定性高的菌種或毒種，因其毒性較強。

為保證遺傳穩(wěn)定性，需要對病原微生物進一步純化，如挑選單個菌落或病毒空斑，經傳代增殖后與原始病原體比較，確保純化前后重要保護區(qū)域核苷酸或氨基酸序列不變[7]。接種滅活疫苗后病原體不在體內繁殖，只誘導機體產生記憶性B淋巴細胞，不產生T淋巴細胞，故免疫作用弱，需要多次接種并加強免疫。且由于滅活制備的疫苗混有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液等雜質，接種反應較重。

2.1.3亞單位疫苗 通過化學分解或有控制性的蛋白質水解方法，提取病原體上的特異性免疫原成分(肽、蛋白質或多糖)，篩選出具有免疫活性的片段制成的疫苗稱為亞單位疫苗，也稱組分疫苗[8]。與滅活疫苗相比，其成分簡單，不良反應減少，但免疫原性較低，需要加入佐劑來增強免疫原性。例如，無細胞百日咳疫苗由百日咳桿菌中的保護性抗原(百日咳毒素、絲狀血凝素等)制得，免疫效果與全細胞百日咳相似，但安全性大大增強[9]。目前廣泛使用的傷寒Vi多糖疫苗、23價肺炎球菌多糖疫苗和腦膜炎球菌多糖疫苗等采用細菌莢膜中的長鏈或短鏈糖分子制備，這種多糖是T細胞非依賴型抗原，接種后T細胞不被活化，并且不形成免疫記憶，只會刺激B細胞反應，主要產生IgM抗體，因此多糖疫苗對不滿2歲的嬰幼兒、老年人及一些免疫缺陷的患者缺乏有效免疫效應[10]。

為解決上述問題，有研究發(fā)現(xiàn)通過將多糖和蛋白質耦聯(lián)后的多糖結合疫苗能夠啟動T淋巴細胞免疫應答，產生高親和力的多糖特異性IgG 抗體及免疫記憶，令免疫效果變得持久[11]。此外，部分多糖結合疫苗也可以作為二聯(lián)疫苗，同時預防兩種疾病，如b型流感嗜血桿菌-白喉聯(lián)合疫苗。

2.2基因工程疫苗

2.2.1基因工程亞單位疫苗 基因工程亞單位疫苗是利用DNA重組技術，將編碼病原微生物的保護性抗原基因克隆并導入表達系統(tǒng)，使之高效表達后通過純化制得的疫苗，又稱重組亞單位疫苗[9]。目前使用的表達系統(tǒng)有細菌、病毒、酵母和哺乳動物細胞等。

這種疫苗接種后由單一蛋白誘導免疫反應，安全性較高，而且成本低廉，易于生產，但和傳統(tǒng)亞單位疫苗一樣，免疫原性低，往往需要改變抗原構象和展示方式或添加合適的佐劑提高免疫原性，如制成病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)疫苗和納米顆粒(nanoparticle，NP)疫苗[12]。第一個成功研發(fā)的基因工程亞單位疫苗是1986年上市的以酵母為表達系統(tǒng)的重組乙肝疫苗，目前已取代血源乙肝疫苗(傳統(tǒng)亞單位疫苗)，成為乙肝疫苗的主要應用類型[7]。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)、戊型肝炎病毒由于難以人工培養(yǎng)，無法采用傳統(tǒng)技術研制疫苗，而基因工程技術很好地攻克了這一難題。

2.2.2基因工程活載體疫苗 基因工程活載體疫苗又稱重組活載體疫苗，是指把外源基因重組到用基因工程技術構建的細菌或病毒載體上，表達保護性抗原基因的活疫苗[8]。載體疫苗根據(jù)在人體內的繁殖特點，可分為復制型和復制缺陷型(即非復制型)[13]。為保證疫苗的安全性，載體通常使用特定微生物的疫苗株，如痘病毒、腺病毒、皰疹病毒、沙門菌、乳酸菌以及李斯特菌等，脂質體、病毒樣顆粒和免疫刺激復合物亦可用于疫苗傳遞系統(tǒng)[14]。

該類疫苗可誘導多重免疫應答，包括體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫，免疫效果接近自然產生，載體自身可以增強免疫原性，不需要添加佐劑。基因工程活載體疫苗同時具有活疫苗免疫效果好、成本低廉以及滅活疫苗安全穩(wěn)定的優(yōu)勢，還易于構建多價、多聯(lián)疫苗，取得一針預防多病的作用，并且用量小，免疫作用時間持久，是目前疫苗研究的熱點方向[15]。目前，該技術已經應用到埃博拉病毒、人類免疫缺陷病毒、流感病毒等的疫苗研發(fā)當中[16]。

但是，基因工程活載體疫苗存在較大缺陷，如病毒重組后毒性增加或突變?yōu)槠渌虏《?，威脅人體安全；二次免疫時對載體自身易形成排斥反應等，是該類疫苗推廣應用的最大問題。

2.2.3基因缺失疫苗 基因缺失疫苗是用分子生物學技術將病原體的毒素基因全部或部分去除，獲得定向缺失突變的活疫苗，在保留其免疫原性的同時，防止了疫苗株毒性的恢復(即返祖現(xiàn)象)，較傳統(tǒng)活疫苗更安全有效[7]。其誘導的是強大而持久的免疫應答，包括黏膜免疫，適用于局部接種。如刪除狂犬病病毒的磷酸化蛋白基因 (M基因)，制成重組狂犬病病毒活疫苗，注射后可迅速誘發(fā)人體強大的免疫反應[17]。

2.2.4合成肽疫苗 在病原體的抗原決定簇中，對免疫應答起關鍵作用的只有小部分抗原核苷酸序列。利用蛋白質化學技術，將這部分基因序列人工合成出具有免疫活性的保護性多肽或抗原表位制成的疫苗稱為合成肽疫苗[18]。這類疫苗解決了某些病原微生物不能大量體外培養(yǎng)或生長滴度低的問題，還能誘導強烈的細胞反應，免疫時間長。合成肽疫苗不含核酸成分，因此安全性很高，且成本低，易于生產，是目前研發(fā)感染性疾病和惡性腫瘤新型疫苗的熱門方向之一。但其存在免疫原性低、需要合適的載體或佐劑，篩選和組裝抗原表位的技術不夠成熟等問題[19]。

2.3核酸疫苗 核酸疫苗是將抗原基因(DNA或RNA)定向導入機體細胞，使其表達相應抗原，從而獲得對該抗原蛋白免疫應答的疫苗。其特殊之處在于該類疫苗由基因即核酸本身制成，而不是基因表達產物、病原微生物或載體。核酸疫苗分為DNA疫苗和RNA疫苗。

DNA疫苗免疫機體后能誘導MHC I類和II類T細胞反應以及抗體反應，免疫應答全面而持久，可獲得接近自然感染的免疫效果[20]。盡管DNA疫苗需要特定輔助系統(tǒng)復制DNA進入細胞核，但不需要載體或佐劑，性質穩(wěn)定，制備簡單，易于大規(guī)模生產。與傳統(tǒng)疫苗和基因工程疫苗相比，DNA疫苗還具備下列優(yōu)勢：可根據(jù)需要引入特定DNA序列，調控性強；不具有致敏性，接種更安全；同一質粒可導入不同抗原基因獲得多價疫苗；兼具免疫治療和預防功能等[21]。針對一些目前比較主流的烈性傳染病病原體，例如新型冠狀病毒、寨卡病毒、登革熱、埃博拉病毒等，DNA疫苗通常是主要手段，目前多處于Ⅰ期臨床階段。DNA疫苗有潛在致癌風險，其安全性未得到未驗證。

mRNA疫苗技術是最新的第三代疫苗技術，mRNA疫苗注入機體后，在細胞質中翻譯，無需進入細胞核，克服了DNA疫苗遞送系統(tǒng)難題，也不存在整合性突變風險[22]。該技術不僅能全面誘導體液免疫與細胞免疫應答，還可激活免疫應答佐劑，同時具有研發(fā)快、產量高、成本低和更容易實現(xiàn)多聯(lián)多價設計優(yōu)點。針對mRNA疫苗易降解問題，一般用高效mRNA投遞方法來解決，樹突狀細胞、魚精蛋白、高分子載體和脂質納米粒是常用投遞載體[23]。另外，通過mRNA修飾可以改善免疫原性、半衰期和表達穩(wěn)定性。目前，已在臨床試驗階段的mRNA疫苗有流感病毒疫苗、狂犬病毒疫苗、埃博拉病毒疫苗、寨卡病毒疫苗和新型冠狀病毒疫苗。

3 新型冠狀病毒疫苗研究進展

2019年暴發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(簡稱新冠肺炎)疫情，給全球公共衛(wèi)生和經濟帶來巨大負擔。截至2021年3月17日，全球已累計確診1.2億例，死亡266萬例。新冠肺炎由新型β冠狀病毒株SARS-CoV-2所致，該病毒利用其刺突蛋白與肺泡細胞表面血管緊張素轉換酶-2(ACE2)特定受體相互作用，從而感染宿主[24]。目前尚未研制出治療新冠肺炎的特效藥，因此通過接種疫苗來應對新冠肺炎是最有效、最經濟的手段。我國在該病毒的疫苗研發(fā)中布局了滅活疫苗、基因工程亞單位疫苗、腺病毒載體疫苗、流感病毒載體疫苗以及核酸疫苗5條較為成熟的技術路線[25]。除上述技術路線外，國外尚在研制減毒活疫苗。

據(jù)WHO統(tǒng)計，目前全球新冠病毒臨床候選疫苗共82款，中國參與開發(fā)了13款[26](表3)。

表3 臨床候選新型冠狀病毒疫苗開發(fā)狀況Tab.3 Development status of clinical canditate COVID-19 vaccines 款

4 疫苗的發(fā)展前景

傳統(tǒng)疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗均基于巴斯德疫苗學方法研制，需要依次分離并培養(yǎng)病原微生物、鑒定保護性抗原、確定疫苗組方與免疫程序、評價疫苗安全性與有效性。實現(xiàn)上述過程必須提供完整的病原體，并且在體外大量培養(yǎng)以獲得足夠抗原。這種方式研發(fā)周期較長，期間微生物可能發(fā)生抗原漂移或轉移導致疫苗效果下降。這些問題促使科學家們開發(fā)出基于病原體全基因組的新型疫苗學方法，即反向疫苗學。即以基因組信息為基礎，在病原體全基因組中篩選出關鍵抗原，然后將這些抗原高通量克隆、表達、純化出重組蛋白，再對純化后的抗原進行體內外評價，最終篩選出保護性抗原[27]。反向疫苗學使保護性抗原的篩選周期由5～10年縮短到2～5年，大大加快了疫苗研發(fā)進程。B型腦膜炎球菌疫苗的研制是反向疫苗學取得成功的一大里程碑。隨著越來越多微生物基因組測序的完成，反向疫苗學的應用將更加廣泛。

除了開發(fā)更高效的抗原篩選技術，未來疫苗將朝著接種方式更便捷、接種效果更顯著、應用范圍更廣泛的方向發(fā)展。隨著疫苗種類的增加，推廣聯(lián)合疫苗勢在必行。聯(lián)合疫苗接種次數(shù)少、預防疾病種類多、接種率高且不良反應少。歐洲已經在使用含有白喉、破傷風、百日咳、b型流感嗜血桿菌、乙肝和脊髓灰質炎滅活疫苗的六價組合[2]。另外，可通過不同的接種方式擴大免疫途徑。如今大多數(shù)疫苗都是通過腸外注射來接種，誘導的是血液中B細胞和T細胞表達系統(tǒng)免疫反應。近年來發(fā)現(xiàn)，黏膜免疫是人體抵抗病原體的第一道屏障，黏膜疫苗成為疫苗研究新方向。作為黏膜疫苗的主要形式，口服疫苗主要引起腸黏膜免疫，目前取得進展的口服疫苗有減毒活疫苗、DNA疫苗和轉基因植物疫苗。鼻噴疫苗誘導的鼻黏膜免疫反應具有對上呼吸道定向免疫的效果，是上呼吸道傳染病疫苗的首選，且不引起免疫耐受[28]。目前國內已利用減毒流感病毒載體平臺來開發(fā)鼻噴新冠肺炎疫苗。接種疫苗通常被認為是一種預防措施，但近年來，由于新型疾病的不斷出現(xiàn)、微生物持續(xù)感染日益增多以及抗菌藥物耐藥問題日趨嚴重，治療性疫苗引起廣泛關注。其中，對腫瘤的治療性疫苗的研究占據(jù)主導地位。目前，已有上百種治療性腫瘤疫苗處于開發(fā)狀態(tài)，但美國食品藥品管理局(FDA)僅批準了3種上市，治療性腫瘤疫苗仍需進一步研究才能得以推廣應用[29]。

人類使用疫苗已有200余年歷史，在預防和治療多種疾病上取得顯著成效?，F(xiàn)今人類平均壽命較19世紀延長了數(shù)十年，主要得益于對天花和其他傳染病的控制。在面臨突發(fā)重大傳染病如嚴重急性呼吸綜合征、H7N9禽流感、埃博拉以及新冠肺炎時，人類不再坐以待斃，而是利用現(xiàn)代生物技術向病原微生物積極應戰(zhàn)。