黃添就 閉海龍 陳芳艷 林碧敏 何鏡新 劉武林 陳金聯(lián) 鐘楊生 林健榮

（1.陽山縣興達蠶業(yè)有限公司 廣東清遠 513100；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 廣東廣州 510642；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)實驗與實踐訓(xùn)練中心 廣東廣州 510642）

植物中的單寧和凝集素是飼料中的主要抗營養(yǎng)因子。單寧是一種具有較強生物學(xué)特性和藥理活性的多酚類物質(zhì)，會抑制腸道微生物的生長，阻止其對鈣、鐵等離子的吸收，影響畜禽的正常發(fā)育[1]。當畜禽日糧中單寧含量過高時，會影響畜禽對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，導(dǎo)致其代謝紊亂，降低畜禽對飼料的吸收率和進食量。凝集素是一種非免疫原性、與糖專一結(jié)合，并能凝集細胞和（或）沉淀含糖高分子的蛋白質(zhì)或糖蛋白。凝集素會降低腸道內(nèi)某些酶的活性，改變腸道微生物環(huán)境，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。大量的植物凝集素進入血液循環(huán)系統(tǒng)會導(dǎo)致動物體重下降，甚至中毒死亡。另外，植物凝集素對免疫球蛋白有抑制作用[2]。

我國桑樹資源豐富，適種范圍廣，桑葉的營養(yǎng)成分全面而且豐富。為了拓寬其用途，充分、全面提高桑葉的利用價值，相關(guān)研究人員近年來對桑葉在畜禽飼料中的添加量做了大量研究。王亞男等（2019）在育肥豬飼糧中添加6%的發(fā)酵桑葉能有效提高豬的日增重、降低料重比，提高其生長性能，并且能提高其肌肉中不飽和脂肪酸和氨基酸含量[3]。飼料中添加2%桑葉粉時可增加揚州鵝胸肌厚度，加入4%時開始下降；添加6%和8%的桑葉粉則會顯著降低平均日增重，增加料重比[4]。對蛋雞的研究表明，只有低含量的桑葉粉（添加3%）能夠顯著提高蛋雞產(chǎn)蛋率[5]。王永昌（2016）研究了桑葉粉對清遠鵝生長性能、屠宰性能、器官發(fā)育等指標的影響，發(fā)現(xiàn)桑葉粉添加量≥3%時，對肉鵝生長不利[6]。張英（2019）對獺兔的研究表明，飼料桑在獺兔日糧中替代比例為6%[7]。這些研究結(jié)果均顯示，桑葉或桑葉粉在畜禽飼料中的添加量高時，其應(yīng)用效果則不理想。一些研究認為是桑葉中含有的抗營養(yǎng)因子所致，因此，有必要篩選抗營養(yǎng)因子含量低的桑樹品種。

目前，對桑葉中單寧及凝集素的研究大多集中在其提取方法和活性功能檢測方面，對桑樹不同品種及葉位中單寧和凝集素含量的研究報道較少[8-9]。本研究檢測不同品種和葉位中桑葉單寧和凝聚素的含量，以期為桑葉在畜禽飼料領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

桑葉采摘于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)桑園基地，包括桐鄉(xiāng)青、倫109、梧桐桑、抗青10、睦州青、沙2×109、紅頂桑、甜桑、倫教40、粵桑11、荷葉白11個品種，采集葉位為從上往下數(shù)第5 葉位至第10 葉位之間，獲得11 個桑葉樣品。選擇桑41、桑19、化稀這3 個品種，采集上葉位（從頂端往下數(shù)第1 片到第5 片）、中間葉位（桑樹中間位置取5 片葉）和下葉位（從底端往上數(shù)第1 片至第5 片）的葉片，獲得3 個品種上、中、下葉位共9 個樣品。

1.1.2 試劑

鎢酸鈉、磷鉬酸、磷酸、碳酸鈉、單寧酸、95%乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、葡萄糖、檸檬酸鈉、檸檬酸、氯化鈉、凝集素等均為市售分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葉粉的制備

新鮮桑葉用自來水清洗干凈表面，去除泥沙等雜物后，再用蒸餾水洗凈，甩干水分，置于恒溫烘箱中60 ℃干燥，然后用植物粉碎機粉碎，過40目篩，得到桑葉粉樣品，做記錄后置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 桑葉單寧的提取

參見丁曉雯等（2013）的方法提取單寧[10]。取桑葉粉樣品1 g，加入濃度為65%乙醇25 mL，在65 ℃恒溫水浴15 min后，超聲破碎提取15 min，提取完成后過濾，收集濾液。余下的殘渣再加入濃度為65%的乙醇25 mL提取，方法同第一次。反復(fù)提取3 次后，合并3 次濾液，并用濃度為65%的乙醇定容至100 mL。每個品種樣品重復(fù)3 次。

1.2.3 單寧含量的測定方法

參見鐘雨珅等（2015）的方法測定[8]，簡述如下。

首先制作標準曲線，準確稱取單寧酸0.010 0 g，用純水溶解并定容至100 mL，得到濃度為0.10 mg/mL的標準溶液。分別準確吸取單寧酸標準溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于50 mL容量瓶中，加Folir-Denis試劑（鎢酸鈉10 g，磷鉬酸2.5 g，用70 mL的蒸餾水溶解后，再加5 mL的磷酸，混勻后放置沸水浴回流2.5 h，待冷卻后用蒸餾水定容至100 mL）2.5 mL及飽和碳酸鈉溶液5 mL，加水稀釋至刻度并充分混合，靜置30 min后，以試劑空白調(diào)零，在750 nm波長處測其吸光度。以單寧濃度（μg/mL）為橫坐標、吸光度值A(chǔ)750nm為縱坐標繪制標準曲線并作回歸方程，得到的回歸方程為Y=0.057 8X+0.005 7，回歸系數(shù)為R2=0.998 5。取桑葉單寧提取液0.2 mL提取待測樣品中的單寧，并根據(jù)標準曲線計算出各品種桑葉的單寧含量。

1.2.4 凝集素的提取

參照孫東等（2008）的方法提取凝集素[11]。取桑葉粉2 g，加入40 mL濃度為0.01 mol/L、pH7.2的磷酸緩沖溶液（PBS，內(nèi)含0.15 mol/L NaCl），在常溫（25 ℃）下水浴搖床浸提16 h，得到的浸提液在4 000 r/min離心10 min，取上清液得到桑葉凝集素提取液。

1.2.5 凝集素含量的測定方法

參照戴大章等（2002）的方法測定凝集素含量[12]。首先，取植物血球凝集素PHA-P 20 mg溶于20 mL濃度為0.01 mol/L、pH7.2的PBS中，制成濃度1 mg/mL的凝集素標準溶液。

然后，紅細胞懸液制備。用注射器在采血管中加入1 mL阿氏液（制備方法：將葡萄糖4.10 g、檸檬酸鈉1.6 g、檸檬酸0.11 g、氯化鈉0.84 g溶于200 mL蒸餾水中，配制完成后滅菌，置于4 ℃左右保存），從兔耳朵采血2 mL～3 mL，輕輕倒轉(zhuǎn)兩次與阿氏液混勻，然后3 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液，在沉淀中再加入適量濃度為0.01 mol/L、pH7.2的PBS輕輕打勻。同樣條件離心，反復(fù)兩次。棄上清后用沉淀的血塊制作成實驗中所需要的濃度為2.5%的血細胞懸液。方法是用膠頭滴管取血塊，并加入0.8%的生理鹽水，1∶32比例制成2.5%的紅細胞懸液。

最后，凝集素檢測。在V型凝血板中每孔先加20 μL濃度為0.01 mol/L、pH7.2的PBS，然后在第一列中，取凝集素標準品20 μL，加入第一孔，充分混勻后取20 μL加入第二孔，以此類推往后加。第二列為空白組，取濃度為0.01 mol/L、pH7.2的PBS 20 μL，加入第一孔，充分混勻后取20 μL加入第二孔，以此類推往后加。第三列往后的待測樣品的加樣與凝集素標準品的相同。最后在每個孔中都加入20 μL 2.5%紅細胞懸液，混勻后，放室溫靜置1.5 h～2 h，觀察凝集現(xiàn)象。將觀察到的現(xiàn)象分為5個不同的級別，分別用0、1、2、3、4來表示。根據(jù)凝集效價的比較和已知標準品的濃度計算出被測樣品中凝集素的含量，公式如下。

C（mg/g）=S0×F×V÷f0÷W

式中：S0表示標準樣的濃度（mg/L）；F表示待測樣品溶液的凝集效價；V表示待測樣品的體積（mL）；f0表示標準樣品溶液的凝集效價；W表示待測樣品的質(zhì)量（g）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗所得數(shù)據(jù)用Excel軟件進行處理，用SPSS22.0和Design-Expert.V8.0.6.1軟件對結(jié)果（平均數(shù)±標準誤）進行單因素方差分析以及LSD檢驗和Duncan檢驗。顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種桑葉單寧和凝集素含量的比較

測定睦州青、沙2×109等11個品種桑葉中單寧和凝集素含量，結(jié)果見表1。單寧含量在18.79 mg/g～28.46 mg/g之間，含量最高的桑品種與最低的桑品種之間相差1.51倍。單寧含量最高的是睦州青，最低的是甜桑。單寧含量最低的3 個品種分別為荷葉白、倫教40、甜桑，含量最多的3個品種分別是睦州青、沙2×109、梧桐桑，利用SPSS22.0軟件對各品種單寧含量進行顯著性分析（α=0.05），大多數(shù)品種間單寧含量差異顯著，只有梧桐桑和抗青10，粵桑11和桐鄉(xiāng)青，以及紅頂桑、倫109和荷葉白之間的含量接近，差異不顯著。

表1 11 個桑品種單寧和凝集素含量的比較

11 個品種桑葉中凝集素含量在0.13 mg/g～2.11 mg/g之間，最高的是沙2×109，最低的是紅頂桑，最高和最低品種間相差16.23 倍。其中，凝集素含量最少的3 個桑品種分別是紅頂桑、倫教40和睦州青，3 個品種之間含量差異不顯著。凝集素含量最高的3 個桑品種分別為沙2×109、甜桑和桐鄉(xiāng)青，甜桑和桐鄉(xiāng)青2 個品種間差異不顯著，沙2×109顯著高于其他品種。11 個品種中有9 個品種均能達到推薦的凝集素在大鼠飼料中的安全限量標準（低于1.25 mg/g）[12]，僅有沙2×109和甜桑2 個桑品種超過此標準。

2.2 不同葉位桑葉單寧和凝集素含量的比較

測定桑41、桑19和化稀3 個桑品種上、中、下葉位單寧和凝集素含量，結(jié)果見表2。3 個桑品種的上葉位的單寧和凝集素含量都是最低的，其次是中葉位，最后是下葉位。3 個桑品種的上、中、下葉位單寧含量存在顯著差異。桑41的不同葉位間凝集素含量差異不顯著，桑19的上葉位與中葉位凝集素含量差異不顯著，化稀的不同葉位凝集素含量差異顯著。

表2 3個品種上、中、下葉位的單寧和凝集素含量

3 討論

植物飼料中單寧的質(zhì)量濃度在0.5 mg/g～349 mg/g之間。當單寧濃度高于60 mg/g時，被認為是飼料的抗營養(yǎng)因子；當單寧濃度低時，反而有益無害。例如，動物體內(nèi)的單寧含量在5 mg/g～55 mg/g時，可以降低蛋白質(zhì)的瘤胃降解率而提高氮的利用率，同時抑制反芻動物膨脹病和寄生蟲病的發(fā)生；單寧含量20 mg/g～40 mg/g時，可以提高動物的平均排卵率、體重、毛產(chǎn)率和產(chǎn)奶率[13]。本研究測定的11 個桑品種單寧含量分布在18.79 mg/g～28.46 mg/g之間，與常規(guī)的植物飼料相比，這11個桑品種的單寧含量均不高，對畜禽的生長不會造成不良的影響。

凝集素普遍存在于植物中，以豆科植物研究得最多，豆類籽中凝集素含量為10 mg/g～30 mg/g[12]。本研究測定的11 個桑品種凝集素含量在0.13 mg/g～2.11 mg/g之間，遠遠低于豆類中的含量。目前，飼料行業(yè)對凝集素并無明確的限量標準，但研究表明，凝集素對動物的生長與代謝會產(chǎn)生影響。當植物凝集素的采食量達到每天220 mg/（kg·bw）時，大鼠的生長明顯受到抑制；當采食量達到每天300 mg/（kg·bw）左右時，大鼠生長完全受到抑制；采食量超過每天300 mg/（kg·bw）時，大鼠體重出現(xiàn)負增長。推薦的凝集素在大鼠飼料中的安全限量應(yīng)該控制在1.25 mg/g[12]。測定的11 個桑品種中，有9 個均能達到此標準，其中紅頂桑的含量最低，沙2×109和甜桑2個桑品種略微超標，但是通過蒸煮、高溫高壓、輻射等處理亦很容易鈍化凝集素的活性，達到推薦的安全限量標準。

植物凝集素和單寧在同一品種的不同成熟階段、同一成熟階段的不同部位含量均不同。對桑41、桑19、化稀3個桑品種上、中、下葉位的桑葉單寧和凝集素含量的測定結(jié)果表明，嫩葉中的含量低于老葉中的含量。

綜上所述，倫教40、荷葉白、倫109等11個桑品種單寧含量在18.79 mg/g～28.46 mg/g之間，單寧含量均不高，因而，從凝集素的含量考慮選擇飼料用桑，其優(yōu)劣次序依次是紅頂桑、倫教40、睦州青、荷葉白、粵桑11、倫109、抗青10、梧桐桑、桐鄉(xiāng)青、甜桑、沙2×109，且嫩桑葉作為畜禽飼料比老熟桑葉有優(yōu)勢。