鄭家春，熊正罡*，趙洋洋，蔣緒峰

（1.山東大學(xué)第二醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，山東濟(jì)南250033；2.山東大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南250033）

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是一種慢性的、由免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病。AS患者最終殘疾的原因與病理性新骨形成機(jī)制密切相關(guān)，韌帶、滑膜骨化以及附近組織纖維化是主要的病理基礎(chǔ)［1］。研究顯示骨化過(guò)程受到多種途徑的調(diào)節(jié)，p38MAPK通路不但調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡，也參與免疫炎性反應(yīng)的調(diào)控［2］，研究顯示p38MAPK會(huì)引起腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α為代表的炎性因子的大量表達(dá)，最終參與AS［3］。丹皮酚（paeonol,Pae）是在中藥牡丹皮的根皮中鑒定出的藥理活性化合物，最新的研究顯示Pae可以有效的緩解AS模型小鼠的炎性反應(yīng)，并緩解滑膜細(xì)胞損傷［4］，但是其具體功效和作用機(jī)制尚不清楚。本文主要分析Pae對(duì)AS小鼠模型跟腱組織及滑膜組織病理學(xué)變化的影響，并通過(guò)分析其對(duì)p38MAPK信號(hào)通路的影響探究作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

48只BALB/c小鼠，雄性，清潔級(jí)，（16.2±3.2）周齡，體重（20.3±3.2）g。隨機(jī)分為4組，每組12只，分別為正常組、AS組、AS+陽(yáng)性藥組和AS+Pae組。

1.2 AS模型建立

根據(jù)參考文獻(xiàn)方法建立AS模型［5］，建模方法簡(jiǎn)述如下：將100 μl的CFA和100 μl的PG混合，腹腔注射，分別在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第0、3、6周進(jìn)行注射，正常組腹腔注射等量的溶劑。

1.3 藥物干預(yù)

AS+陽(yáng)性藥組在第7周使用柳氮磺吡啶（濃度為0.9 mg/ml）灌胃，劑量為 9 mg/（kg· d）。AS+Pae組使用Pae（濃度為0.3 mg/ml）灌胃，劑量為3 mg/（kg·d）。正常組使用溶劑（無(wú)菌水）灌胃，每日1次，連續(xù)干預(yù)3周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 ELISA檢測(cè)

通過(guò)尾靜脈采集血液樣本，將血液樣本2 000 rpm下離心20 min收集上層血清，按照ELISA說(shuō)明書(shū)加入試劑，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α的濃度。

1.4.2 電鏡觀察

小鼠通過(guò)腹腔注射過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉后處死，采集骶髂關(guān)節(jié)面標(biāo)本，在0.1 mol/L的椰油酸酯緩沖液中洗滌然后通過(guò)多聚甲醛溶液（pH 7.3）固定，固定后樣本再次通過(guò)椰油酸酯緩沖液洗滌，并用2%戊二醛在-4℃下保存固定12 h，然后加入1%的鋨酸繼續(xù)孵育2 h固定。固定后使用丙酮脫水，將脫水后的樣本通過(guò)環(huán)氧樹(shù)脂包埋，然后使用切片機(jī)做超薄切片，并在JEM 1010透射電子顯微鏡中進(jìn)行檢查，在80 kV的加速電壓下使用AMT成像系統(tǒng)獲得數(shù)字圖像。

1.4.3 組織學(xué)觀察

將跟腱組織經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水、透明處理后包埋至蠟塊中，冷凍后切成4 μm厚切片。然后將組織脫蠟并再水化，使用3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。使用蒸鍋在95°C下于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中對(duì)切片進(jìn)行熱誘導(dǎo)的抗原回收。通過(guò)HE染色試劑盒加入蘇木紫和伊紅染料染色觀察跟腱組織病變情況。然后根據(jù)參考文獻(xiàn)對(duì)跟腱組織纖維骨化程度進(jìn)行觀察［6］，分為1～5分，1～5分別提示炎性浸潤(rùn)、纖維樣浸潤(rùn)、軟骨形成、骨形成和強(qiáng)直。

1.4.4 Western blot檢測(cè)

收集滑膜組織，在-80°C下研磨后通過(guò)RIPA試劑裂解獲得總蛋白，并使用BCA法測(cè)量濃度量。將等量的總蛋白通過(guò) SDS-PAGE分離（120 V，90 min），然后轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上（50 V，120 min），在含有5%脫脂牛奶的封閉溶液中封閉。然后將PDVF 膜與 anti-MKK3/6、anti-p-MKK3/6、anti-p38、anti-p-p38（1∶500稀釋?zhuān)┰?°C孵育過(guò)夜，然后加入1∶5 000稀釋的HRP偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，β-actin作為內(nèi)參，并使用ImagePD軟件對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行定量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清TNF-α水平

建模前各組小鼠血清TNF-α差異無(wú)顯著意義（P＞0.05），建模后TNF-α均顯著升高。干預(yù)后AS組的TNF-α顯著高于正常組（P＜0.05），AS+陽(yáng)性藥組和 AS+Pae組的 TNF-α顯著低于 AS組（P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 各組血清TNF-α水平與比較（ng/ml）

2.2 骶髂關(guān)節(jié)滑膜超微結(jié)構(gòu)比較

透射電鏡（TEM）所見(jiàn)如圖1所示，正常組滑膜的細(xì)胞層和內(nèi)膜下層均清晰，并可以觀察到膠原纖維和絨毛，且細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常；AS組的細(xì)胞排列紊亂，并且細(xì)胞內(nèi)膜厚度明顯增加，細(xì)胞質(zhì)分布不均勻，細(xì)胞器出現(xiàn)異常；AS+陽(yáng)性藥組和AS+Pae組細(xì)胞內(nèi)膜厚度有增厚，細(xì)胞質(zhì)分布基本均勻，細(xì)胞器有部分腫大，提示Pae和柳氮磺吡啶均可以緩解AS滑膜細(xì)胞損傷。

圖1 透射電鏡觀察Pae對(duì)AS小鼠模型骶髂關(guān)節(jié)滑膜微結(jié)構(gòu)的影響（×5 000） 1a:正常組，滑膜的細(xì)胞層和內(nèi)膜下層均清晰，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常 1b:AS組，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞內(nèi)膜厚度明顯增加，細(xì)胞質(zhì)分布不均勻，細(xì)胞器出現(xiàn)異常1c,1d:AS+陽(yáng)性藥組和AS+Pae組，細(xì)胞內(nèi)膜有增厚，細(xì)胞質(zhì)分布基本均勻，細(xì)胞器有部分腫大

2.3 跟腱組織骨化情況比較

組織切片HE染色見(jiàn)圖2，正常組的細(xì)胞排列有序、緊密，未發(fā)現(xiàn)炎性浸潤(rùn)和纖維樣浸潤(rùn)。AS組觀察到炎性浸潤(rùn)、纖維樣浸潤(rùn)，并有部分出現(xiàn)軟骨形成，并且AS組的骨化評(píng)分（2.81±0.64）分顯著高于正常組（P＜0.05）；AS+陽(yáng)性藥組觀察到炎性浸潤(rùn)，部分合并的纖維樣浸潤(rùn)，骨化評(píng)分（1.52±0.48）分顯著低于AS組（P＜0.05）；AS+Pae組僅觀察到炎性浸潤(rùn)和少量的纖維樣浸潤(rùn)，骨化評(píng)分（0.94±0.31）分顯著低于AS組（P＜0.05）。

圖2 HE染色觀察Pae對(duì)AS小鼠模型跟腱組織骨化情況的影響（×40） 2a:正常組，細(xì)胞排列有序、緊密 2b:AS組，觀察到炎性浸潤(rùn)、纖維樣浸潤(rùn)，部分有軟骨形成 2c:AS+陽(yáng)性藥組，觀察到炎性浸潤(rùn)，部分合并的纖維樣浸潤(rùn) 2d:AS+Pae組，僅觀察到炎性浸潤(rùn)和少量的纖維樣浸潤(rùn)

2.4 各組p38MAPK通路比較

各組p38MAPK通路比較標(biāo)志物Western blot檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖 3、表2。AS組的p-MKK3/6/MKK3/6、p-p38/p38水平顯著高于正常組（P＜0.05），AS+陽(yáng)性藥組和AS+Pae組的p-MKK3/6/MKK3/6、p-p38/p38水平顯著低于AS組（P＜0.05），見(jiàn)圖3和表2。

表2 各組p38MAPK通路蛋白水平比較

圖3 Western blot檢測(cè)Pae對(duì)AS小鼠模型跟腱滑膜組織中p38MAPK通路中MKK3/6和p38蛋白磷酸化水平的影響

3 討論

AS是高度家族性且可遺傳的，盡管抑制炎癥和改善癥狀可在一定程度上緩解癥狀，但是目前臨床上尚無(wú)能夠有效減緩強(qiáng)直性反應(yīng)和疾病進(jìn)展的治療方法［7］。

Pae是2'-羥基-4'-甲氧基苯乙酮，是來(lái)自中藥牡丹的一種酚類(lèi)化合物，在過(guò)去的十年中，研究證實(shí)了Pae具有鎮(zhèn)靜、解熱、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化的作用［7］。研究顯示Pae還具有抗纖維化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用［9］。最新研究顯示Pae具有緩解關(guān)節(jié)炎小鼠模型滑膜細(xì)胞炎性反應(yīng)和骨化的作用［10］。本研究，對(duì)AS小鼠模型使用Pae進(jìn)行灌胃，明顯抑制了血清中TNF-α的水平，并且可以保護(hù)骶髂關(guān)節(jié)滑膜，緩解跟腱組織炎性反應(yīng)和骨化，其效果與陽(yáng)性藥物柳氮磺吡啶相似?，F(xiàn)階段關(guān)于Pae對(duì)于AS的影響的研究有限，有研究發(fā)現(xiàn)Pae可能通過(guò)抑制促炎因子的表達(dá)改善大鼠關(guān)節(jié)炎［11］。Pae也可以通過(guò)抑制白細(xì)胞介素-1β的表達(dá)抑制人成纖維樣滑膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［12］。這說(shuō)明Pae可以抑制AS模型小鼠炎性反應(yīng)，保護(hù)滑膜細(xì)胞損傷，抑制骨化，提示Pae可能成為治療AS的新藥物。

為進(jìn)一步分析Pae抑制炎性反應(yīng)和骨化的機(jī)制，本研究初步分析了Pae對(duì)滑膜細(xì)胞p38MAPK通路的影響。p38MAPK是調(diào)控免疫炎性反應(yīng)的重要通路，并且研究顯示p38MAPK通路可促進(jìn)滑膜細(xì)胞的纖維化，從而參與 AS的發(fā)生［13］。而有效的抑制p38MAPK通路可以緩解滑膜細(xì)胞的炎性反應(yīng)和損傷［14］。本次研究結(jié)果顯示AS模型小鼠滑膜組織中p38MAPK通路被激活，MKK3/6和p38蛋白磷酸化水平顯著升高。而Pae可以顯著抑制MKK3/6和p38蛋白磷酸化水平。Jin等［15］的研究結(jié)果顯示Pae可通過(guò)調(diào)節(jié)JNK/ERK/p38MAPK途徑減弱異氟烷麻醉引起的海馬神經(jīng)毒性。Tang等［16］研究發(fā)現(xiàn)Pae可通過(guò)抑制p38MAPK通路抑制炎性反應(yīng)并緩解哮喘，而哮喘模型也是由CFA誘導(dǎo)，這提示在AS模型中，Pae會(huì)通過(guò)抑制p38MAPK通路緩解跟腱組織炎性反應(yīng)和骨化。

綜上所述，Pae可通過(guò)調(diào)節(jié)p38MAPK通路抑制AS模型小鼠的滑膜細(xì)胞損傷、跟腱炎性反應(yīng)和骨化，從而起到治療AS的作用。