喬永杰，張呂丹，李旭升，張浩強(qiáng)，甄 平，許瑞嶺，葉 鑠，周勝虎*，李 鵬，曹國定

（聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院a.關(guān)節(jié)外科；b.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，甘肅蘭州730050）

感染性骨缺損的治療是骨科領(lǐng)域的一大難點(diǎn)，目前應(yīng)用于治療感染性骨缺損的骨替代材料很多，主要包括有機(jī)和無機(jī)兩種。前者包括聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥、聚乳酸/聚羥乙酸共聚物及聚羥乙酸等；后者包括載抗生素鍛石膏、羥基磷灰石、磷酸三鈣（tricalcium phosphate,TCP） 等［1，2］。研究表明，多孔 β-TCP支架復(fù)合抗菌藥物不僅能控制感染，還能有效修復(fù)骨缺損［3，4］。慢性骨髓炎治療周期長，材料在體內(nèi)吸收溶解與新骨形成不平衡，致使緩釋藥物在局部濃度較低，因此臨床治療效果不佳。

慢性骨髓炎通常為金黃色葡萄球菌引起［5，6］，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA）感染引起的慢性骨髓炎逐漸增多，萬古霉素作為治療MRSA的經(jīng)典藥物，細(xì)菌的耐藥性顯著增強(qiáng)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，利福平、異煙肼具有較好的抗細(xì)菌生物膜作用［8］。為此，本研究旨在采用利福平、異煙肼制備一種在其余抗生素?zé)o效情況下使用的抗生素緩釋系統(tǒng)。

3D打印技術(shù)可構(gòu)建與缺損骨組織相匹配的支架材料，還可精確調(diào)控支架內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)，從而獲得理想的骨修復(fù)效果［9］。本研究采用CAD軟件設(shè)計(jì)并3D打印制備多孔β-TCP支架，并負(fù)載利福平、異煙肼/聚乳酸-羥基乙酸共聚物緩釋微球，于動物實(shí)驗(yàn)中觀察其抗菌作用及成骨作用。

1 材料與方法

1.1 材料制備與觀察

1.1.1 支架制備

采用復(fù)乳化溶劑揮發(fā)法制備利福平、異煙肼/聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid,PLGA）緩釋微球［10，11］。使用CAD計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)多孔 β-TCP 支架模型［12］，孔隙 400 μm，孔徑 400 μm，小梁400 μm。采用離心震蕩法制備負(fù)載利福平、異煙肼/PLGA緩釋微球的多孔β-TCP支架［11，13］。

取冷凍后的復(fù)合支架，于掃描電鏡下觀察微球及支架表面形態(tài)、微球填充情況等，測定總孔隙率。取6個(gè)復(fù)合支架，采用萬能材料力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測量最大負(fù)荷及最大強(qiáng)度。

1.1.2 細(xì)菌制備

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（ATCC33591）由聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，使用前采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄖ苽涑蓾舛葹?0×107CFU/ml的菌液。

1.2 動物分組與處理

成年雄性新西蘭白兔75只，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科提供。隨機(jī)分為5組，每組15只。其中15只設(shè)為正常對照組，不接受骨髓炎模型制備處理；其余4組，共60只動物，參照邵隴龍等［14］的實(shí)驗(yàn)方法制備股骨下段慢性骨髓炎模型。4周時(shí)行鉬靶X線片檢查、細(xì)菌培養(yǎng)及病理學(xué)檢查，觀察模型制備是否成功［14，15］。

造模成功后，15只動物給予單純清創(chuàng)（清創(chuàng)組）；15只動物給予清創(chuàng)后，骨缺損處分別植入利福平/異煙肼/PLGA緩釋微球（藥物組）；15只動物給予清創(chuàng)后，骨缺損處置入多孔β-TCP支架（支架組）；15只動物給予清創(chuàng)后，骨缺損處植入利福平/異煙肼/PLGA緩釋微球/多孔 β-TCP支架（復(fù)合組）。分別于術(shù)后4、8、12周取材進(jìn)行觀測。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 鉬靶X線檢查

各時(shí)間點(diǎn)所有攝鉬靶X線片，觀察骨缺損愈合情況、有無死骨及骨硬化發(fā)生、局部炎癥消散及材料在體內(nèi)的分解情況。

1.3.2 組織學(xué)觀察與評分

各時(shí)間點(diǎn)各組分別取3只動物，處死后取手術(shù)部位股骨髁，置于4%甲醛固定24 h，脫鈣，石蠟包埋，切片，片厚4 μm。取部分切片常規(guī)HE染色，光鏡下觀察新骨生長情況、材料在體內(nèi)變化及局部炎癥情況。

1.3.3 MicroCT檢測

各時(shí)間點(diǎn)各組取3只動物。當(dāng)實(shí)驗(yàn)全部完成后，所有實(shí)驗(yàn)組動物標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT檢查。觀察骨愈合、新骨生長及材料分解情況，并計(jì)算骨體積（bone volume,BV）、骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume fraction,BVF）、骨表面積（bone surface,BS）、骨小梁厚度 （trabecular thickness,Tb.Th） 和骨小梁數(shù)目（trabecular number,Tb.N）。

1.3.4 細(xì)菌培養(yǎng)

將各時(shí)間點(diǎn)組織學(xué)及Micro-CT觀測剩余標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料觀察

掃描電鏡觀察，復(fù)合支架中緩釋微球與支架粘合緊密，微球填充于支架之間的孔隙內(nèi)。生物力學(xué)檢測示，孔徑為400 μm和小梁直徑為400 μm的復(fù)合支架可達(dá)松質(zhì)骨生物力學(xué)強(qiáng)度。

2.2 鉬靶X線檢查

術(shù)后4～12周各組均顯示軟組織腫脹逐漸減輕。清創(chuàng)組：骨缺損處無明顯新骨生長。藥物組：骨缺損處可見死骨塊。支架組：骨缺損處可見少許骨質(zhì)生長。復(fù)合組：復(fù)合支架融合滿意，骨缺損處骨皮質(zhì)連續(xù)，見圖1。

圖1 復(fù)合組鉬靶X線檢查所見 1a:術(shù)后8周，骨缺損開始修復(fù)，感染得到控制 1b:術(shù)后12周可見骨缺損修復(fù)完成，材料分解加速

2.3 組織學(xué)觀察

術(shù)后4周到12周各組均顯示炎癥細(xì)胞浸潤逐漸減輕，清創(chuàng)組：骨缺損處可見纖維組織充填。藥物組：有新骨及血管生長。支架組：有新骨及血管生長。復(fù)合組：有較明顯成骨現(xiàn)象，新生骨及血管生成滿意。見圖2。

2.4 MicroCT檢測

清創(chuàng)組：術(shù)后骨缺損未見愈合傾向，無明顯新骨生長。藥物組：術(shù)后骨缺損仍較明顯，部分局部炎癥有所減輕。支架組：術(shù)后4周可見材料與骨組織融合，可見新生骨長入支架孔隙內(nèi)；8周時(shí)可見材料在體內(nèi)開始分解吸收；12周時(shí)開始快速分解。復(fù)合組：隨時(shí)間延長，復(fù)合支架與骨組織融合滿意，新生骨大量長入材料孔隙內(nèi)，骨修復(fù)效果滿意，見圖3。

圖3 復(fù)合組術(shù)后12周MicroCT掃描 3a:復(fù)合材料具有較強(qiáng)成骨作用，可見新生骨充滿整個(gè)材料孔隙 3b:材料在術(shù)后12周分解加速

Micro-CT檢測結(jié)果見表1。4～12周正常對照組的BV、BVF、BS、Tb.Th和Tb.N比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨時(shí)間推移，4～12周清創(chuàng)組、藥物組、支架組和復(fù)合組上述指標(biāo)均有所增加，其中支架組和復(fù)合組上述指標(biāo)呈線性增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4～12周，BV、BVF、BS、Tb.Th和 Tb.N由高至低均依次為：正常對照組＞復(fù)合組＞支架組＞藥物組＞清創(chuàng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 5組動物不同時(shí)間點(diǎn)股骨MicroCT檢測結(jié)果（n=5，±s）與比較

表1 5組動物不同時(shí)間點(diǎn)股骨MicroCT檢測結(jié)果（n=5，±s）與比較

images/BZ_61_205_383_535_453.pngBV（mm3）images/BZ_61_535_383_2276_453.pngimages/BZ_61_205_523_2276_593.pngimages/BZ_61_205_663_944_732.pngimages/BZ_61_1240_663_2276_732.pngimages/BZ_61_535_802_694_872.pngimages/BZ_61_944_663_1240_732.pngimages/BZ_61_205_802_535_872.pngBVF images/BZ_61_694_802_2276_872.pngimages/BZ_61_1240_942_1513_1012.pngimages/BZ_61_205_942_535_1012.pngimages/BZ_61_1513_942_1786_1012.pngimages/BZ_61_535_942_944_1012.pngimages/BZ_61_1786_942_2060_1012.pngimages/BZ_61_944_942_1240_1012.pngimages/BZ_61_2060_942_2276_1012.pngimages/BZ_61_694_1082_944_1152.pngBS （mm2）images/BZ_61_535_1082_694_1152.pngimages/BZ_61_944_1082_2276_1152.pngimages/BZ_61_694_1222_1240_1292.pngimages/BZ_61_205_1082_535_1152.pngimages/BZ_61_1240_1222_2276_1292.pngimages/BZ_61_944_1362_1240_1432.pngimages/BZ_61_205_1362_694_1432.pngTb.Th（μm）images/BZ_61_1240_1362_1513_1432.pngimages/BZ_61_694_1362_944_1432.pngimages/BZ_61_1513_1362_1786_1432.pngimages/BZ_61_205_1222_535_1292.pngimages/BZ_61_1786_1362_2276_1432.pngimages/BZ_61_944_1502_1240_1572.pngimages/BZ_61_205_1502_694_1572.pngimages/BZ_61_1513_1502_1786_1572.pngimages/BZ_61_694_1502_944_1572.pngimages/BZ_61_1240_1502_1513_1572.pngimages/BZ_61_1786_1502_2276_1572.pngimages/BZ_61_944_1641_1513_1711.pngimages/BZ_61_535_1222_694_1292.pngimages/BZ_61_535_1641_944_1711.pngimages/BZ_61_1513_1641_1786_1711.png4周12周4周12周4周12周4周12周4周12周images/BZ_61_1786_1641_2276_1711.pngimages/BZ_61_1240_1781_1513_1851.png4.45±0.55 6.63±0.29 0.06±0.01 0.07±0.02 18.86±2.78 21.15±2.41 0.73±0.11 0.93±0.07 0.42±0.05 0.56±0.05images/BZ_61_535_1781_944_1851.png＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001images/BZ_61_205_1641_535_1711.pngTb.N（1/mm）images/BZ_61_944_1781_1240_1851.png＜0.001＜0.001 6.52±0.66 7.91±0.59 0.05±0.01 0.09±0.01 25.69±4.71 30.02±4.30 0.91±0.11 0.93±0.16 0.52±0.10 0.79±0.16 11.78±0.99 22.17±1.01 0.10±0.02 0.20±0.02 39.15±5.31 73.64±9.56 0.89±0.12 1.08±0.17 0.85±0.11 1.89±0.16images/BZ_61_1513_1781_1786_1851.pngimages/BZ_61_205_1781_535_1851.png13.09±0.97 33.45±1.05 0.18±0.02 0.27±0.02 39.99±3.84 103.42±7.87 1.01±0.15 1.01±0.16 1.10±0.11 2.90±0.08images/BZ_61_1786_1781_2060_1851.png36.46±1.73 34.81±1.16 0.31±0.02 0.31±0.02 116.33±6.53 120.69±6.48 1.09±0.20 1.16±0.39 3.20±0.11 3.22±0.09＜0.001 0.429images/BZ_61_2060_1781_2276_1851.png

2.5 細(xì)菌培養(yǎng)

術(shù)后4周，清創(chuàng)組實(shí)驗(yàn)動物均培養(yǎng)到MRSA；藥物組2只動物培養(yǎng)陽性；支架組動物全部培養(yǎng)陽性；復(fù)合組1只動物培養(yǎng)陽性。術(shù)后8周，清創(chuàng)組1只培養(yǎng)陽性；其余3組均未培養(yǎng)到MRSA。術(shù)后12周，4組動物均未培養(yǎng)到細(xì)菌。

3 討論

PMMA載抗生素骨水泥廣泛應(yīng)用于骨髓炎的治療且療效確切［16，17］。但PMMA不能在體內(nèi)吸收溶解，增加了細(xì)菌再次感染的可能性，而且在局部釋放藥物濃度較低。生物材料如β-TCP、硫酸鈣（CaSO4）、羥基磷灰石（HA）、硅酸鹽生物活性玻璃等，由于與機(jī)體相容性好被廣泛應(yīng)用于骨組織工程［18，19］。β-TCP 支架復(fù)合利福平、異煙肼緩釋微球是一種具有良好生物相容性和機(jī)械性能的材料，且具有良好的抑菌效果，藥物緩釋持續(xù)時(shí)間長可有效殺滅殘存的細(xì)菌，基本能達(dá)到治療慢性骨髓炎的標(biāo)準(zhǔn)。袁景［11］和孟磊［13］研究顯示復(fù)合材料在體內(nèi)對動物無明顯肝腎毒性，具有良好的生物相容性，可作為治療慢性骨髓炎的骨替代材料。

本研究術(shù)后影像學(xué)檢查結(jié)果示：清創(chuàng)組不能控制感染且沒有明顯的新骨生長，可能與清創(chuàng)不徹底及骨質(zhì)缺損較大有關(guān)；藥物組有一定的抗感染作用，但沒有明顯的新骨生長，可能與骨質(zhì)缺損較大，不具有支架橋梁作用，無法完成骨修復(fù)；支架組有一定的骨修復(fù)作用，但因局部沒有抗菌藥物，無法完成抗感染作用；復(fù)合組能觀察到良好的抗感染作用且新骨生長效果良好，進(jìn)一步證明該材料的優(yōu)越性。以往采用羥基磷灰石、硫酸鈣骨水泥、萬古霉素骨水泥等，均能達(dá)到優(yōu)良的抗菌作用，但往往成骨作用較弱［20，21］。分析其原因，可能為：（1）形成復(fù)合材料后微球與介質(zhì)的接觸面積減少，延緩了微球的降解過程；（2）復(fù)合材料無免疫原性且具備良好生物相容性、持續(xù)骨誘導(dǎo)能力，可有效促進(jìn)骨細(xì)胞長入；（3）復(fù)合材料具有藥物緩釋和序貫控釋的特性，同時(shí)具有良好的孔隙率和細(xì)胞相容性。

術(shù)后病理學(xué)觀察，清創(chuàng)組轉(zhuǎn)為慢性感染，無明顯好轉(zhuǎn)現(xiàn)象，因局部無抗感染作用引起；藥物組炎癥較清創(chuàng)組稍好轉(zhuǎn)，但骨缺損無明顯好轉(zhuǎn)，有緩釋微球但無支架橋梁，無法完成骨修復(fù)；支架組轉(zhuǎn)為慢性感染，因無抗菌作用，骨缺損部位有骨質(zhì)生長，但效果不佳；復(fù)合組既有局部抗感染，又有支架橋梁，可見炎癥逐漸消散，并且骨質(zhì)生長良好。細(xì)菌培養(yǎng)也顯示緩釋微球有良好的抗菌作用，證明該抗生素對MRSA療效顯著。研究表明，β-TCP具有良好的成骨作用，但以往均負(fù)載傳統(tǒng)抗生素［4，22］，后期往往產(chǎn)生耐藥，骨髓炎的治療效果不佳。該研究顯示利福平、異煙肼具有優(yōu)良的抗菌及成骨作用，可能和如下因素相關(guān)：（1）復(fù)合材料的利福平、異煙肼降解速率可能與新骨生成具有較好的匹配性，復(fù)合材料具有較好的機(jī)械性能，提供即時(shí)的穩(wěn)定性同時(shí)，利于成骨細(xì)胞增殖，提高骨修復(fù)能力；（2）復(fù)合材料在抗感染的同時(shí)，具有較低的細(xì)胞毒性，宏觀及微觀互相連通的開放孔隙有利于體內(nèi)組織內(nèi)生長；（3）復(fù)合材料的降解能為新骨的形成提供更豐富的鈣離子和磷離子，促進(jìn)新骨形成，并逐步為新骨組織置換。

綜上所述，3D打印β-磷酸三鈣支架復(fù)合利福平、異煙肼緩釋微球構(gòu)成的復(fù)合材料有較好的抗MRSA作用及良好的成骨作用，是一種具有潛力的治療感染性骨缺損的材料。