郭思男 冉瑞雪 王銀松

天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室300070

0 引 言

中空銅基硫?qū)偌{米材料因其可調(diào)的物理化學(xué)性質(zhì)、表面可修飾化、均勻性、單分散性和強(qiáng)大的載藥能力，廣泛應(yīng)用于生物傳感、成像、診斷和醫(yī)療、催化及藥物遞送等生物學(xué)領(lǐng)域[1-5]。與其他銅基納米材料相比，中空硒化銅（Cu2-xSe）納米材料不僅具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)，而且銅和硒均為人體中重要的微量元素[6-7]。中空Cu2-xSe的制備方法主要采用犧牲模板法，即先合成氧化亞銅（Cu2O）或氫氧化銅[Cu（OH）2]等前驅(qū)體，再以前驅(qū)體為犧牲模板，在硒離子溶液中根據(jù)Kirkendall效應(yīng)制備出中空硒化銅結(jié)構(gòu)[8-9]。相對(duì)于傳統(tǒng)的硬模板法，犧牲模板法無(wú)需去除模板，可避免在去除模板過(guò)程中可能發(fā)生的殼層破裂問(wèn)題[10]。Pang和Zeng[11]以Cu2O為犧牲模板，再與以硒粉和硼氫化鈉（NaBH4）為原料配制的硒離子溶液進(jìn)行反應(yīng)，將Cu2O轉(zhuǎn)化為中空CuSe納米球。Wang等[12]亦以Cu2O為犧牲模板，再與以亞硫酸鈉（Na2SO3）、硒粉和氫氧化鈉（NaOH）為原料配制的硒離子溶液進(jìn)行反應(yīng)，將Cu2O轉(zhuǎn)化為Cu2-xSe納米立方盒。Zhou等[13]先采用銅箔氧化法制備Cu（OH）2納米棒作為前驅(qū)體，再利用NaBH4和硒粉配制硒離子溶液，最后通過(guò)犧牲模板法將Cu（OH）2納米棒轉(zhuǎn)化為CuSe納米管。然而目前這些研究主要集中于形貌方面，對(duì)粒徑控制研究鮮有報(bào)道，且無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)研究溶液中的溶解氧對(duì)中空結(jié)構(gòu)形成的影響。

本研究以聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）為包覆劑，水合肼為還原劑，異丙醇和水的混合溶劑為反應(yīng)介質(zhì)來(lái)制備Cu2O納米粒子（Cu2O nanoparticles，Cu2ONPs），并通過(guò)改變反應(yīng)溶劑的體積比制備不同尺寸的Cu2ONPs。再進(jìn)一步以Cu2O為犧牲模板，以硒粉為硒源制備中空Cu2-xSe NPs，并探討溶液中溶解氧對(duì)制備中空結(jié)構(gòu)的影響。最后對(duì)中空Cu2-xSe NPs表面修飾甲氧基聚乙二醇巰基（methoxy polyethyleneglycol thiol，mPEG-SH），以提高納米粒子穩(wěn)定性，增強(qiáng)其生物相容性，并研究Cu2-xSe-PEGNPs的放射治療（放療）增敏和光熱性能，以期為腫瘤的光熱和放療聯(lián)合治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

PVPK30（上海勝沛新材料科技有限公司），二水合氯化銅（CuCl2·2H2O）、異丙醇（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），硒粉、NaBH4（天津希恩思生化科技有限公司），NaOH（天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司），水合肼（天津泰默生物科技有限公司）。

HT7700透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司），Zetasizer Nano ZS激光粒度儀（英國(guó)Malvern公司），UV-1510紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Sientific公司），808 nm近紅外激光器（長(zhǎng)春鐳仕光電科技有限公司），T640紅外熱成像儀（美國(guó)FLIR公司），RS2000生物學(xué)X射線輻照儀（美國(guó)Rad Source公司）。

1.2 方法

1.2.1 納米粒子的制備

（一）Cu2ONPs的制備

在100 ml單頸圓底燒瓶中加入0.017 0 g CuCl2·2H2O和0.2 g PVP，然后加入不同體積比的異丙醇和超純水（總體積為60 ml），常溫700 r/min攪拌至完全溶解；逐滴加入600μl含0.008 0 g/ml NaOH的異丙醇溶液，700 r/min攪拌反應(yīng)10 min；再逐滴加入600μl含0.008 0 g/ml NaOH的異丙醇溶液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min；緩慢加入200μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%的水合肼，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min；反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物離心（29 261×g，20 min），棄上清，即得Cu2O NPs。在本研究中將異丙醇和超純水的體積比設(shè)置了3個(gè)比例，分別為59∶1、58.5∶1.5、58∶2，對(duì)應(yīng)制得的納米粒子分別定義為Cu2O NPs（59∶1）、Cu2ONPs（58.5∶1.5）和Cu2ONPs（58∶2）。

（二）Cu2-xSe NPs的制備

在100 ml三頸圓底燒瓶中加入0.010 0 g硒粉和19 ml超純水，先通入惰性氣體，在惰性氣體保護(hù)下800 r/min攪拌5 min至完全溶解；再加入1 ml 0.0120g/ml NaBH4水溶液，繼續(xù)在惰性氣體保護(hù)下反應(yīng)1 h；取2倍量Cu2ONPs（58∶2）溶于含有0.020 0 g PVP的10ml超純水中，然后將其注入Se2-水溶液中，立即撤掉保護(hù)氣體，暴露于空氣中，700 r/min攪拌反應(yīng)3 h；反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物離心（29 261×g，20 min），棄上清，即得Cu2-xSe NPs，將其分散于7 ml無(wú)水乙醇中4℃保存。在本研究中使用的惰性氣體分別為氬氣（Ar）和氮?dú)猓∟2），對(duì)應(yīng)制得的納米粒子分別定義為Cu2-xSe NPs（Ar）和Cu2-xSe NPs（N2）。

（三）Cu2-xSe-PEGNPs的制備

按照質(zhì)量比Cu2-xSe∶mPEG-SH=1∶1.5將mPEGSH加入Cu2-xSe NPs（N2）水溶液中，600 r/min攪拌反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物離心（29 261×g，20 min），棄上清，即得Cu2-xSe-PEGNPs，將其分散于超純水中4℃保存。

1.2.2 納米粒子的表征

分別取上述各步所得的Cu2ONPs和Cu2-xSe NPs分散液，滴于碳膜銅網(wǎng)上，自然晾干后于透射電子顯微鏡下觀察。采用激光粒度儀檢測(cè)各步所得的納米粒子在溶液中的Zeta電位、粒徑和粒徑分布情況。采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描Cu2-xSe NPs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖。

1.2.3 納米粒子的光熱性能考察

取Cu2-xSe-PEGNPs母液（4 mg/ml）加超純水稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100、200和400μg/ml的Cu2-xSe-PEG NPs溶液，于激光器（808 nm，1.0 W/cm2）下照射10 min。在激光照射過(guò)程中全程用紅外熱成像儀錄像，用軟件IRBIS3 prof對(duì)錄像結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 納米粒子的放療增敏性能考察

取10μl熒光探針2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）溶液（20 mmol/L）加入1.6 ml NaOH溶液（10 mmol/L）中，避光攪拌反應(yīng)30 min，再加入8.4 ml磷酸鹽緩沖液（×1）稀釋至20μmol/L備用。

（一）不同質(zhì)量濃度的Cu2-xSe-PEGNPs經(jīng)X射線照射后產(chǎn)生的活性氧水平

取Cu2-xSe-PEGNPs母液（4mg/ml）加超純水稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為40、60、80、100和200μg/ml的Cu2-xSe-PEGNPs溶液，各取500μl與上述500μl DCFH溶液混合，最終體系中Cu2-xSe-PEGNPs的質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80和100μg/ml。用X射線照射混合物，照射劑量為6 Gy，照射時(shí)間為300 s，之后于恒溫振蕩器中振蕩1 h。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定DCF的熒光強(qiáng)度。

（二）不同劑量X射線照射下Cu2-xSe-PEGNPs產(chǎn)生的活性氧水平

取Cu2-xSe-PEGNPs母液（4 mg/ml）加超純水稀釋配制4份質(zhì)量濃度為200μg/ml的Cu2-xSe-PEGNPs溶液，各取500μl與上述500μl DCFH溶液混合，最終體系中Cu2-xSe-PEGNPs的質(zhì)量濃度為100μg/ml。用X射線照射混合物，照射劑量分別為4、6、8 Gy，照射時(shí)間為300 s，之后于恒溫振蕩器中振蕩1 h。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定DCF的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 透射電子顯微鏡表征

采用透射電子顯微鏡對(duì)制備的各種Cu2ONPs和Cu2-xSe NPs進(jìn)行了表征，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可看出合成的Cu2O NPs均為實(shí)心球形結(jié)構(gòu)，粒徑大小均一，且分散性良好；隨著溶液中超純水體積的增大，Cu2O NPs粒徑從（31.5±8.9）nm增至（86.4±5.9）nm（圖1A～1C）。由圖1還可看出以Ar作保護(hù)氣體時(shí)，合成的Cu2-xSe NPs的中空結(jié)構(gòu)不明顯（圖1D），而以N2作保護(hù)氣體時(shí)，中空結(jié)構(gòu)很明顯，空腔大至（45.8±9.6）nm，粒徑大小均一，為（91.9±9.5）nm，分散性良好（圖1E）。

圖1 Cu2ONPs和Cu2-x Se NPs的透射電子顯微鏡圖

2.2 粒徑和電位表征

激光粒度儀測(cè)定結(jié)果如表1所示，Cu2O NPs、Cu2-xSe NPs和Cu2-xSe-PEGNPs的多分散系數(shù)均小于0.180，表明納米粒子分散性良好。Cu2ONPs粒徑為（96.3±4.3）nm，電位為（-9.3±0.6）mV；Cu2-xSe NPs粒徑為（136.9±7.0）nm，電位為（-15.2±1.6）mV；Cu2-xSe-PEG NPs粒徑為（161.5±6.4）nm，電位為（-22.1±1.3）mV。上述結(jié)果表明Cu2-xSe-PEGNPs合成成功。

表1 Cu2ONPs、Cu2-x Se NPs和Cu2-x Se-PEGNPs的粒徑、多分散系數(shù)和Zeta電位（Mean±SD,n=3）

2.3 光學(xué)性質(zhì)表征

如圖2所示，Cu2-xSe NPs在近紅外區(qū)（700～1 000 nm）有一定程度的吸收。

圖2 Cu2-x Se納米粒子的紫外-可見(jiàn)光圖譜

2.4 光熱性能考察

采用紅外熱成像儀記錄808 nm激光照射下Cu2-xSe-PEGNPs在水中的升溫過(guò)程，結(jié)果顯示，隨著Cu2-xSe-PEG NPs質(zhì)量濃度的增加，溫度也逐漸升高，表明其升溫具有一定的濃度依賴(lài)性（圖3A）；隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，200μg/ml Cu2-xSe-PEGNPs溶液較H2O升溫明顯，10 min時(shí)溫度超過(guò)55℃，表明Cu2-xSe-PEGNPs具有良好的光熱性能（圖3B）。

圖3 Cu2-x Se-PEGNPs溶液經(jīng)808 nm激光照射（1.0 W/cm2）10 min后的溫度變化

2.5 放療增敏性能考察

如圖4所示，Cu2-xSe-PEGNPs經(jīng)X射線輻照儀照射后，DCF熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。隨著Cu2-xSe-PEG NPs質(zhì)量濃度的增加，DCF熒光強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，表明Cu2-xSe-PEGNPs產(chǎn)生活性氧的能力具有一定的濃度依賴(lài)性（圖4A）；此外，隨著照射劑量的增加，DCF熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，表明Cu2-xSe-PEGNPs產(chǎn)生活性氧的能力具有一定的放射劑量依賴(lài)性（圖4B）。

圖4 Cu2-x Se-PEGNPs溶液經(jīng)X射線照射后產(chǎn)生的活性氧水平

3 討論與結(jié)論

銅基硫?qū)偌{米材料由于具有光熱和放療增敏作用，已被發(fā)現(xiàn)可用于腫瘤的光熱和放療的協(xié)同治療。Zhang等[14]在中空硫化銅上原位沉積Au，再包裹PEG得到了具有光熱和放療增敏功能的CuxS/Au-PEGNPs，該納米粒子可用于腫瘤的第二窗口熱療和放療，有效殺傷腫瘤組織。Huang等[15]在Cu2-xSe納米顆粒基礎(chǔ)上引入高原子序數(shù)元素Au，合成啞鈴型異質(zhì)結(jié)構(gòu)的Cu2-xSe-Au納米晶體，Cu2-xSe和Au具有光熱和放療的協(xié)同作用，可用于腫瘤的熱放療。

目前，中空Cu2-xSe NPs的制備方法已經(jīng)得到了很大發(fā)展。中空結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)機(jī)制主要是基于Kirkendall效應(yīng)、Ostwald熟化和化學(xué)自誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化這3種機(jī)制。其中基于Kirkendall效應(yīng)的犧牲模板法被認(rèn)為是制備中空納米材料的最有效方法[11，16-18]。相對(duì)于傳統(tǒng)的硬模板法，犧牲模板法的模板在反應(yīng)過(guò)程中是一種反應(yīng)前驅(qū)物，故所得產(chǎn)物無(wú)需經(jīng)過(guò)高溫煅燒或強(qiáng)酸強(qiáng)堿刻蝕等后處理過(guò)程即可得到中空結(jié)構(gòu)的納米材料。且由于所用模板大小均一，通過(guò)模板的控制誘導(dǎo)作用，一般可大面積地制備具有規(guī)整結(jié)構(gòu)的中空材料[19-21]。本研究以Cu2O為模板劑和銅源，以硒粉為硒源，采用犧牲模板法制備得到了大小均一、分散良好的Cu2-xSe NPs。

本研究中在異丙醇和超純水的混合溶劑中制備得到粒徑在（96.3±4.3）nm的Cu2ONPs。在前期研究摸索中，筆者曾嘗試單獨(dú)使用超純水作溶劑合成Cu2ONPs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論怎樣更改條件，所得納米粒子的粒徑均在200 nm以上；筆者亦曾嘗試單獨(dú)使用異丙醇作溶劑合成Cu2ONPs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所得納米粒子的粒徑過(guò)小，離心無(wú)法得到產(chǎn)物。這可能是由于在單獨(dú)的超純水相中，無(wú)機(jī)粒子之間的反應(yīng)速度太快，無(wú)法合成較小的納米粒子，而在單獨(dú)的異丙醇溶劑中，黏度過(guò)大，無(wú)機(jī)粒子碰撞機(jī)會(huì)小，無(wú)法得到較大的納米粒子。因此，本研究以異丙醇和超純水的混合溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，經(jīng)多次摸索發(fā)現(xiàn)將異丙醇和超純水的體積比調(diào)整為58∶2時(shí)，所得Cu2ONPs粒徑合適，形貌規(guī)則。在制備Cu2-xSe NPs的過(guò)程中，需在惰性氣體保護(hù)下合成Se2-。若采用Ar作保護(hù)氣體，得到的納米粒子幾乎無(wú)空心，而采用N2作保護(hù)氣體則能得到具有較大空腔結(jié)構(gòu)的Cu2-xSe NPs。有研究結(jié)果表明，Cu2O并非直接形成Cu2-xSe，而是在溶液中溶解氧的作用下Cu2O表面先形成一層CuO薄層，然后再與Se2-作用形成Cu2-xSe[8，11]。若采用密度比空氣大很多的Ar作保護(hù)氣體，即使在加入Cu2O的那一刻撤掉Ar，空氣也無(wú)法進(jìn)入溶液中，導(dǎo)致無(wú)溶解氧，Se2-無(wú)法蝕刻Cu2O模板，故應(yīng)采用密度較小的N2作為保護(hù)氣體。

本研究提供了一種基于犧牲模板法合成中空Cu2-xSe NPs的溫和方法，能獲得粒徑可控的Cu2-xSe NPs。重要的是，Cu2-xSe-PEGNPs同時(shí)具有光熱和放療增敏性能，這為Cu2-xSe-PEGNPs用于腫瘤的熱放療提供了一定的理論基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突