劉賓 劉輝 李寶玉

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院胃腸外科300211

0 引言

胰腺癌是全球第七大癌癥致死原因，在美國的惡性腫瘤中，其死亡率高居第三位[1]。根據(jù)美國癌癥協(xié)會的估計，2020年美國有576 00例新發(fā)胰腺癌病例，導致近47 050例死亡[2]。據(jù)預測，胰腺癌將在2030年左右成為美國癌癥相關死亡的第二大原因[3]。胰腺導管腺癌是最常見、最致命的胰腺癌亞型，占總診斷病例的90%以上[3]。由于缺乏顯著的早期癥狀，大多數(shù)胰腺導管腺癌在確診時往往處于晚期（Ⅲ或Ⅳ期），此時治療效果較差。此外，胰腺導管腺癌是一種侵襲性極高的惡性腫瘤，手術后易復發(fā)。并由于化療耐藥性的存在，現(xiàn)有療法對于提高患者預后，效果甚微[4]。靶向治療與免疫治療盡管效果初現(xiàn)端倪，但仍需發(fā)現(xiàn)更多更有效的治療靶點。胰腺癌的早期診斷至關重要，目前的主要標記物包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原199（carbohydrate antigen199，CA199）、CA242等，一定程度上起到了預測胰腺癌的作用，但其特異性仍有待提高[5]。為了提高胰腺癌的早期診斷率，仍需發(fā)現(xiàn)更多且更加特異的胰腺癌生物標記物。

復制因子C（replication factor C，RFC）家族是由RFC1、RFC2、RFC3、RFC4、RFC5亞基組成的復合物，是DNA聚合酶的引物識別因子[6-11]。RFC在多種惡性腫瘤中具有生物活性，可能在癌細胞的增殖、進展、侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用[12-13]。根據(jù)腫瘤的細胞和組織學特征，其可以作為癌基因或抑癌基因。RFC4是一個主要存在于細胞核中，相對分子質(zhì)量為37 000的調(diào)控蛋白[7，14-15]。RFC4主要存在于DNA的RFC復合體中，能夠參與DNA復制復合體的形成，起始DNA的復制過程[7，16-17]。另外，RFC4還參與多種重要的細胞過程，包括DNA鏈延伸、DNA修復、磷酸肌醇相關信號通路等[6，12，18]。

RFC4在腫瘤中的作用已被多項研究證實[12-13]。在此前一項研究中，研究者通過全基因組RNAi篩選，發(fā)現(xiàn)RFC4可通過促進非同源端連接修復介導結直腸癌放療耐受[19]。也有研究結果證實，RFC4的表達水平與結直腸癌進展相關，可用于結直腸癌的預后預測[13]。研究者通過生物信息分析，證實RFC4是肝癌的潛在治療靶點[12]。然而，RFC4對于胰腺癌這種高惡性程度腫瘤的潛在影響仍然未知。

本研究中，旨在探討RFC4在胰腺導管腺癌組織及相應正常組織中的相對表達及其與臨床預后的關系，有助于更好地認識RFC4在胰腺導管腺癌發(fā)展中的作用機制，從而對研究胰腺導管腺癌的治療與預后預測方法有重要意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年6月至2017年9月，天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院收治的經(jīng)手術治療的胰腺導管腺癌患者76例。其中，男性44例，女性32例，年齡57.5歲±3.25歲。全部病例均經(jīng)過病理證實，術前未經(jīng)化療或放療，且具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分級和腫瘤大小等；收集患者的腫瘤組織及癌旁組織標本。在76例病例中，腫瘤分級低級別者35例，高級別者41例；腫瘤大小<4 cm者28例，≥3.5 cm者48例。所有患者均簽署知情同意書，本研究已通過天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院倫理委員會的審核。

1.2 主要材料與儀器

RFC4兔抗人單克隆抗體（a b156780，英國Abcam公司），二抗免疫組化試劑盒（北京中衫金橋生物技術有限公司），二氨聯(lián)苯胺（diamiobenzidine，DAB）顯色試劑盒（美國Cell Signaling Technology公司）。

RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司），BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 免疫組織化學檢測方法

對76例胰腺導管腺癌腫瘤組織及癌旁正常組織行福爾馬林固定，石蠟包埋，包埋后蠟塊標本進行3μm切片，然后行RCF4免疫組化染色。將切片在75℃環(huán)境中孵育30 min，隨后用二甲苯脫蠟，并用梯度乙醇溶液（100%，100%，95%，85%，75%）水合。水合完畢后使用檸檬酸緩沖液孵育20 min修復抗原，并阻斷內(nèi)源性過氧化物酶5 min。隨后用質(zhì)量濃度為50 g/L的牛血清白蛋白（b ovine serum albumin，BS A）封閉液封閉30 min。封閉后使用RFC4抗體孵育2 h。然后，切片用生物素化的二抗孵育1.5 h，通過DAB法顯色，蘇木素染色細胞核。免疫組化切片于顯微鏡下觀察，觀察倍率為100和200倍，期間拍照并采集圖像。根據(jù)腫瘤細胞陽性染色百分率和染色強度綜合評價免疫組化結果。

染色結果表明，RCF4蛋白呈顯著的核定位。每例患者的腫瘤組織及癌旁組織切片選取6個視野進行檢測，結果采用雙盲法判斷，依照陽性細胞在總細胞數(shù)中的比例進行評定。陽性細胞比例評分標準：腫瘤細胞陽性百分數(shù)<10%時，記0分；10%～30%時，記1分；30%～60%時，記2分；>60%時，記3分。陽性染色強度評分標準：陰性染色記0分；弱陽性染色記1分；中陽性染色記2分；強陽性染色記3分。以陽性細胞百分比評分和染色強度評分的和判斷表達情況，總分為0～2分為RFC4低表達，3～6分為RFC4高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad 6.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。通過基因表達譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫分析RCF4的mRNA在胰腺導管腺癌組織中的表達。通過ProteinAtlas數(shù) 據(jù) 庫（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000104738-RCF4/tissue）分析不同腫瘤組織中RCF4的表達與患者預后的相關性，并通過GEPIA數(shù)據(jù)庫比較RCF4不同表達組胰腺導管腺癌患者的總生存及無病生存率差異（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=RCF4）。符合正態(tài)分布的計量資料采用均值±標準差（Mean±SD）表示，通過卡方檢驗比較臨床病理特征與患者胰腺導管腺癌組織RFC4表達之間的相關性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RFC4的生物信息學分析結果

通過ProteinAtlas數(shù)據(jù)庫分析了RCF4的mRNA水平在不同腫瘤中與患者生存率間的相關性。結果表明，RCF4的mRNA水平與多種腫瘤患者的生存期之間具有相關性，包括腎癌、肝癌、胰腺癌及宮頸癌，提示RCF4可作為多種腫瘤預后的預測因子（圖1）。

圖1 復制因子C4（RCF4）在不同腫瘤組織中與患者預后間的關聯(lián)

通過GPEIA數(shù)據(jù)庫分析了RCF4的mRNA水平在179例人胰腺導管腺癌組織及171例對應的正常組織中的差異，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中RCF4的mRNA呈顯著高表達（圖2，P<0.05）。此外，通過GPEIA數(shù)據(jù)庫分析探討了RCF4的表達與胰腺導管腺癌患者預后的潛在關聯(lián)。結果表明，RCF4的表達與胰腺導管腺癌患者的總生存率（P=0.046）及無病生存率（P=0.042）均具有顯著的相關性（圖3）。該結果提示，RCF4的表達與患者的預后顯著相關。

圖2 胰腺導管腺癌中復制因子C4（RCF4）的mRNA表達

圖3 復制因子C4（RCF4）表達與胰腺導管腺癌患者生存率的相關性

2.2 RFC4在胰腺導管腺癌組織中的表達

通過免疫組織化學染色方法檢測了RFC4在76例行手術切除的胰腺導管腺癌患者的腫瘤組織及對應癌旁正常組織中RFC4蛋白表達情況。結果顯示，RFC4呈顯著核定位，且與癌旁組織相比，RFC4蛋白在胰腺導管腺癌組織中呈顯著高表達（圖4）。

圖4 胰腺導管腺癌組織和癌旁正常組織中復制因子C4（RCF4）的免疫組化結果

2.3 RFC4蛋白表達與胰腺導管腺癌患者的臨床病理特征相關性

為了進一步明確RFC4在胰腺導管腺癌患者中的臨床意義，分析比較了RFC4與胰腺導管腺癌患者的臨床病理特征之間的相關性。比較了RFC4低表達組與高表達組胰腺導管腺癌患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分級及腫瘤大小。結果表明，RFC4的表達水平與胰腺導管腺癌患者的腫瘤大?。≒=0.038）顯著相關，而與年齡（P=0.642）、性別（P=0.804）、腫瘤分級（P=0.902）的相關性無統(tǒng)計學意義（表1）。

表1 復制因子C4（RFC4）蛋白表達與胰腺導管腺癌患者臨床病理特征的相關性分析

3 討論與結論

胰腺癌的發(fā)病率及死亡率均居高不下，主要原因是其缺乏顯著的早期癥狀，進展迅速，且缺乏有效的治療手段[20]。因此，胰腺癌的早期診斷至關重要。近年來發(fā)現(xiàn)的一系列胰腺癌靶點，如CA199、CA242等，在一定程度上提高了胰腺癌的早期診斷率，但這些生物標記物均仍有一定的局限性[21]。部分胰腺癌患者的CA199水平并未升高，主要由于少數(shù)人群不表達CA199，并且在部分情況下CA199會與體液中的某些抗體形成免疫復合物，導致CA199無法檢測[19]。CA242的敏感性較CA199略低。這兩種指標雖然可作為胰腺癌的預測依據(jù)，但仍需結合影像學檢查加以確診[22]。為了提高胰腺癌的早期診斷率，仍需發(fā)現(xiàn)更有效、更敏感的胰腺癌生物標記物。在本研究中，發(fā)現(xiàn)RFC4在人胰腺導管腺癌組織中顯著高表達，并與患者的預后及腫瘤大小顯著相關，提示RFC4可作為胰腺導管腺癌的預后預測因子和生物標記物。

通過對76例人胰腺導管腺癌組織和癌旁正常組織RFC4染色強度的免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)相較于癌旁正常組織，RFC4在腫瘤組織中高表達。臨床病理分析顯示，RFC4表達與腫瘤大小密切相關，提示RFC4在胰腺導管腺癌的增殖及進展中發(fā)揮重要作用。RFC4除了在胰腺導管腺癌組織中異常表達外，其高表達也發(fā)生在一些實體瘤中，如結直腸癌及肝癌等，并與不良預后密切相關[13]。RFC4通過促進DNA非同源末端連接修復，降低結直腸癌患者的放療敏感性[2]。而到目前為止，RFC4對腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用尚未被廣泛揭示，它是否在大多數(shù)腫瘤中具有功能，及其對預后的影響尚不明晰。在本研究中，初步分析了RFC4在胰腺導管腺癌中的表達，并分析了其與胰腺導管腺癌患者臨床特征的關系及其對預后的影響，提示RFC4可能是胰腺導管腺癌的獨立預后因子和潛在的治療靶點。但是，上述結論需要利用體外細胞實驗加以驗證，分析RFC4對胰腺導管腺癌相關細胞功能的影響。

研究結果表明，RFC4對于細胞內(nèi)的DNA雙鏈斷裂（double strand break，DS B）有重要影響[7，23-24]。細胞內(nèi)存在兩種主要的DSB修復方式：非同源末端鏈接（non-homologous end joining,NHE J）和同源重組（homologous recombination，HR）[25]。而在針對結直腸癌的體外細胞實驗中，研究者發(fā)現(xiàn)敲低RFC4顯著降低了NHEJ的活性[13]。在本項研究中，證實了RFC4在胰腺導管腺癌組織中存在高表達，并提示不良預后，其極有可能參與腫瘤進展。因此，需要進一步開展機制研究，研究RFC4是否可通過對DSB的修復，影響胰腺導管腺癌的進展。

RFC4對于DNA復制具有重要的調(diào)控作用，而這進一步會影響細胞的周期及增殖進程[8]。RFC4的異常表達會導致DNA復制的異常，進一步導致細胞的異常增殖并引發(fā)腫瘤[26]。因此，在未來的研究中需要闡明在胰腺導管腺癌中，RFC4的下調(diào)是否會導致DNA復制及細胞增殖的異常，從而闡明RFC4對于腫瘤發(fā)展及患者預后影響的調(diào)控機制。已有多項研究結果證實了RFC4作為腫瘤治療靶點的可能性，結合本研究成果，進一步提示了RFC4可作為多種腫瘤的潛在治療靶點。

本研究的結果表明，RFC4的mRNA在胰腺導管腺癌組織中顯著高表達，且其表達與患者的總生存率與無病生存率相關；RFC4蛋白在胰腺導管腺癌組織中高表達，并與患者的腫瘤大小顯著相關。本研究結果提示，RFC4可作為胰腺導管腺癌的預后預測因子和潛在的生物標記物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突