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        益氣養(yǎng)陰活血中藥對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠血ET-1及VEGF含量的影響*

        2021-07-05 00:45:38曹興偉李群英吳榆可楊國琴
        光明中醫(yī) 2021年11期
        關(guān)鍵詞:內(nèi)皮細胞活血視網(wǎng)膜

        曹興偉 李群英 吳榆可 方 琳 楊國琴

        糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最為常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,致盲率很高,是導(dǎo)致糖尿病患者失明的主要眼病[1]。研究顯示,糖尿病視網(wǎng)膜病變的新生血管形成與生長因子密切相關(guān),血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)就是其中之一[2]。血內(nèi)皮素1(ET-1)是一種血管活性多肽,可反映DR的危險程度[3]。本實驗觀察益氣養(yǎng)陰活血中藥方對糖尿病大鼠血清ET-1、VEGF含量及視網(wǎng)膜組織病理學(xué)的影響,明確益氣養(yǎng)陰活血中藥方對糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物雄性SD大鼠,80只,SPF級,體質(zhì)量180~220 g,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2011—0003;實驗動物質(zhì)量合格證號:NO43004700004233;實驗動物使用許可證號:SYXK(湘)2010—0008。實驗期間環(huán)境溫度20~26℃,濕度40%~70%。

        1.2 藥物、試劑益氣養(yǎng)陰活血中藥方:黃芪、葛根、枸杞子、生地黃、丹參、三七、蒲黃、牛膝、茺蔚子,由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。鏈脲佐菌素(批號:131211,Sigma公司)取鏈脲佐菌素0.625 g置于250 ml量瓶中,用0.1 mol/L pH 4.0的枸櫞酸緩沖液溶解;GLU測定試劑盒(批號:306529,日本和光純藥工業(yè)株式會社產(chǎn)品);胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒(批號:201409,RB公司);高脂飼料(基礎(chǔ)飼料59.5%,膽酸鈉0.5%,豬油10%,蛋黃粉10%,蔗糖20%)購于武漢市萬千佳興生物科技有限公司;ET-1(批號:182303,美國RD公司產(chǎn)品);VEGF Elisa試劑盒(批號:181104,美國RD公司產(chǎn)品)。

        1.3 主要儀器AUY分析天平,日本島津公司產(chǎn)品;LABOSPECT003型自動生化分析儀,日本日立公司產(chǎn)品;MR-96A酶標(biāo)儀,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品。

        1.4 方法

        1.4.1 造模分組雄性SD大鼠80只,體質(zhì)量180~220 g,每日給予高脂飼料飼喂(基礎(chǔ)飼料59.5%,膽酸鈉0.5%,豬油10%,蛋黃粉10%,蔗糖20%),另取10只大鼠作為空白對照,給予普通飼料飼喂,連續(xù)飼喂45 d,飼喂高脂飼料動物禁食不禁水16 h,模型動物按60 mg/kg劑量一次性靜脈注射鏈脲佐菌素,注射體積為0.1 ml/100 g,造模后4 d,采用大鼠尾靜脈采血,檢測血糖。選取血糖值≥16.7 mmol/L的大鼠判定為2型糖尿病大鼠動物模型,結(jié)合動物多飲、多食、多尿,高膽固醇等癥狀,根據(jù)血糖指標(biāo)兼顧體質(zhì)量隨機分為5組,分別為空白對照組、模型對照4周組、12周組、給藥4周組、12周組,每組10只。模型對照組、空白組灌胃給予蒸餾水,益氣養(yǎng)陰活血方組每天上午灌服用蒸餾水稀釋的益氣養(yǎng)陰活血方,給予體積為18 g生藥/kg,10 ml,分別于給藥后4周,于干預(yù)治療后第4周末,模型對照4周組及益氣養(yǎng)陰活血方4周組進行標(biāo)本采集,模型12周組和給藥12周組給藥12周后于第12周末用同樣的方法進行標(biāo)本采集。

        1.4.2 標(biāo)本采集實驗期間觀察各組大鼠的一般情況,包括毛色、精神狀態(tài)、攝食、飲水、尿量、體質(zhì)量及日?;顒?。藥物干預(yù)4周和12周后,禁食6~8 h,用采血針尾靜脈及穿刺心臟收集全血,以檢測大鼠血清ET-1、VEGF的含量。立即摘取大鼠雙眼球,一部分眼球使用19G穿刺刀穿刺前房后固定于4%多聚甲醛溶液中24 h以上,常規(guī)石蠟包埋后用于HE染色。

        1.4.3 檢測指標(biāo)及檢測方法①采用ELISA法檢測給藥后4周、12周血清胰島素、ET-1、VEGF含量。②分別于給藥后4周、12周取大鼠眼球,進行HE染色,數(shù)字共焦顯微鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu),并采集圖像。

        2 結(jié)果

        2.1 益氣養(yǎng)陰活血方DM模型大鼠血清胰島素的影響與空白對照組比較,造模后4周、12周大鼠血清胰島素水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

        表1 益氣養(yǎng)陰活血方對DM模型大鼠血清胰島素的影響 (只,

        2.2 益氣養(yǎng)陰活血方對DM模型大鼠血清ET-1、VEGF含量的影響與空白對照組比較,造模后4周、12周大鼠血清ET-1、VEGF水平均明顯升高(P<0.01或P<0.05);益氣養(yǎng)陰活血方給藥12周能明顯降低糖尿病模型大鼠血清ET-1、VEGF水平,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

        表2 益氣養(yǎng)陰活血方對DM模型大鼠血清ET-1、VEGF含量的影響 (只,

        2.3 益氣養(yǎng)陰方對DM模型大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)的影響正常大鼠視網(wǎng)膜:內(nèi)界膜清楚;神經(jīng)纖維層較稀疏;神經(jīng)節(jié)細胞呈單層排列,胞核較大,呈圓形或橢圓形,染色較淡排列整齊;內(nèi)叢狀層較厚、疏松,呈明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);內(nèi)核層由4~5層細胞構(gòu)成,胞核稍大,染色稍深;糖尿病大鼠模型4周組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層結(jié)構(gòu)排列紊亂,神經(jīng)節(jié)細胞層可見血管內(nèi)皮細胞腫脹,管腔擴張。給藥4周后可見視網(wǎng)膜外叢狀層和內(nèi)核層結(jié)構(gòu)排列紊亂,神經(jīng)纖維層和神經(jīng)節(jié)細胞層輕度水腫,個別細胞核固縮;給藥12周后視網(wǎng)膜外叢狀層和內(nèi)核層結(jié)構(gòu)排列紊亂,神經(jīng)纖維層和神經(jīng)節(jié)細胞層無明顯水腫,少量細胞核固縮。見圖1。

        A:空白對照組;B模型4周組;C模型12周組;D給藥4周組;E給藥12周組圖1 益氣養(yǎng)陰活血方對DM模型大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)的影響

        3 討論

        糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇, 其病程長、慢性并發(fā)癥多、癥狀復(fù)雜, 臨床危害很大。所致眼部并發(fā)癥DR被稱為“消渴目病”。現(xiàn)代中醫(yī)根據(jù)糖尿病的發(fā)病過程,認為消渴的基本病機經(jīng)歷了從陰虛燥熱→氣陰兩虛→陰陽兩虛這一基本證候演變過程;氣滯、痰凝、血瘀作為致病因素及病理產(chǎn)物始終存在于這一基本病理過程中,對糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展起重要作用[4,5]。通過多年的臨床觀察,我們認為:糖尿病視網(wǎng)膜病變的基本病機為本虛標(biāo)實,以氣陰兩虛為本,瘀血阻絡(luò)為標(biāo)。所謂“氣虛”是指脾腎氣虛,“陰虛”是指肝腎陰虛。由于氣虛則血行乏力,陰虛則血行滯澀,因而“瘀血”在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病過程中既是最主要的病理產(chǎn)物又是最關(guān)鍵的致病因素。根據(jù)這一基本病理機制,我們采用“標(biāo)本同治”原則,用益氣養(yǎng)陰活血法治療糖尿病視網(wǎng)膜病變,取得了較好的臨床療效?,F(xiàn)代藥理研究表明[6]:益氣養(yǎng)陰類代表藥物(如黃芪、葛根、枸杞子、生地黃等)以及活血養(yǎng)血止血類的代表藥物(丹參、三七、蒲黃、牛膝等),除了具有降血脂,降血糖、抗血栓、擴血管、抗血小板聚集、降低血液黏度、改善微循環(huán)、增加視網(wǎng)膜的血流量等作用外,還具有增強細胞免疫和體液免疫、抗炎、抗菌、降壓、利水、消腫等作用。

        現(xiàn)代研究顯示,糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)槲⒀懿∽?,與其他糖尿病血管病變一樣,血管內(nèi)皮細胞損傷被認為是糖尿病微血管病變發(fā)生的主要環(huán)節(jié)。一旦發(fā)生血管內(nèi)皮損傷,血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生及分泌血漿內(nèi)皮素(ET-1)就會增加,影響血管張力,改變血流動力學(xué),破壞血-視網(wǎng)膜屏障,增加血漿成分的管壁滲透,致局部微循環(huán)功能障礙,造成一系列病理改變。視網(wǎng)膜血管強烈持久收縮,管腔狹窄,可誘發(fā)微血栓形成;局部毛細血管脆性和通透性增加,引起視網(wǎng)膜出血和滲出病變;反復(fù)的內(nèi)皮細胞損傷和再生可引起血管基底膜增厚和形成微血管瘤;大片毛細血管閉塞和無灌注導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血、缺氧,刺激血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)釋放,內(nèi)皮細胞增殖,產(chǎn)生大量的無結(jié)構(gòu)新生血管,促進DR的發(fā)展[7]。由此可見,ET-1與VEGF這2種細胞因子在DR的發(fā)生發(fā)展過程中起著極為關(guān)鍵的作用。針對以上發(fā)病機制,尋找一種能有效抑制ET-1與VEGF這2種細胞因子的過度表達,維持血管內(nèi)皮細胞相對穩(wěn)定,保護血視網(wǎng)膜屏障,防止DR發(fā)生或阻止DR病程進展,降低致盲率的藥物,至關(guān)重要。

        本實驗結(jié)果表明,益氣養(yǎng)陰活血中藥,對給藥12周組糖尿病大鼠血清ET-1、VEGF水平明顯下調(diào)作用。視網(wǎng)膜組織病理學(xué)顯示,益氣養(yǎng)陰活血中藥方對給藥12周組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜具有減輕組織水腫作用。本實驗研究結(jié)果提示,益氣養(yǎng)陰活血中藥可通過下調(diào)血清VEGF及ET-1水平,預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展,無升高血清胰島素作用,糖尿病視網(wǎng)膜病變運用益氣養(yǎng)陰活血中藥治療糖尿病視網(wǎng)膜病變,需要長期服用,短期服用治療效果不明顯。本研究僅是益氣養(yǎng)陰活血中藥治療糖尿病視網(wǎng)膜病變治療機制的初步探索,在觀察指標(biāo)的選擇方面尚需進一步完善,如增加血脂、視網(wǎng)膜組織免疫組化等指標(biāo)的觀察。

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