歐陽慧麗，王帥，陳超，陸溫，鄭霞林，王小云

（廣西農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點實驗室 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 南寧市 530004）

橘小實蠅Bactrocera dorsalis（Hendel）又名東方果實蠅、柑橘小實蠅，俗稱針蜂、柑蛆、果蛆、黃蒼蠅，隸屬雙翅目Diptera，實蠅科Trypetidae，寡毛實蠅亞科Dacinae，果實蠅屬Bactrocera，是一種重要的世界性入侵害蟲[1]。其寄主范圍廣，可危害46科250多種水果蔬菜[2]，雌成蟲將卵產(chǎn)在果皮下，幼蟲潛居果實內(nèi)部，取食果肉獲取生長所需養(yǎng)分，破壞果實內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)，造成果實腐爛或未熟先黃脫落，給水果產(chǎn)業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[3-4]。廣西處于亞熱帶地區(qū)，氣候溫暖，雨水豐沛，適宜多種水果蔬菜的種植，果蔬種類及產(chǎn)量均居全國前列，也是橘小實蠅最早入侵我國的地區(qū)之一[5]，其監(jiān)測和防控尤為重要。

線粒體DNA（mt DNA）是一個閉合環(huán)狀雙鏈DNA，在昆蟲體內(nèi)廣泛分布，其進化速率較核DNA更快，嚴格遵守母系遺傳特點，即遺傳過程不發(fā)生基因重組、倒位、易位等突變。通過堿基的插入、缺失而增加或減少限制性酶切位點，PCR反應(yīng)后測序，便可以得到豐富的核苷酸多樣性、單倍型多樣性等多態(tài)信息[6]。mt DNA序列片段分析已被廣泛用于入侵性果實蠅的種群結(jié)構(gòu)、種群遺傳分化、種群遺傳多樣性和擴散路線研究[7]。Li等[8]利用640 bp長度的mt DNA COI基因片段對來自緬甸、老撾及中國3個國家15個地理種群的242頭橘小實蠅進行種群結(jié)構(gòu)及擴散路徑的研究，結(jié)果表明東南亞地區(qū)很有可能是該蟲的起源地。Mun等[8]利用mt DNA的COI基因多樣性和3個核酸位點，分析發(fā)現(xiàn)在日本橫濱新入侵的南瓜實蠅Bactrocera tau種群的線粒體單元型和在韓國廣泛分布的種群非常接近。吳廣超等[10]利用774 bp的mt DNA基因研究了橘小實蠅的緬甸與中國海南、云南、廣西、湖南等13個地理種群213個個體，提出云南是該種入侵中國的最早地區(qū)，次年進一步證實這一結(jié)論。施偉等[11]對云南省瑞麗、景洪、化念、元江和河口的橘小實蠅種群，共27個個體的線粒體COI基因，進行了部分測序后發(fā)現(xiàn)這5個地理種群間存在較低水平的遺傳分化，主要與地理隔離有關(guān)。王巧鈴等[12]利用153 5 bp mt DNA COI基因研究了印度、緬甸、泰國、老撾、越南、中國19個種群380個個體，證明橘小實蠅有從南到北，沿海到內(nèi)陸的擴散趨勢[12]。從分子水平上探索廣西區(qū)橘小實蠅的種群擴散路徑和種群結(jié)構(gòu)，可為優(yōu)化橘小實蠅在廣西區(qū)的防治方案提供基礎(chǔ)資料。

因此，本研究收集了廣西區(qū)橘小實蠅17個地理種群，通過DNA測序獲得所有供試昆蟲mt COI基因序列信息，對廣西不同地理種群的橘小實蠅基因信息、遺傳多樣性、遺傳分化和種群親緣關(guān)系進行了研究，為橘小實蠅的監(jiān)測和綜合防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

供試橘小實蠅共有17個種群117頭成蟲，由廣西區(qū)各地植保站采集蟲果，室內(nèi)培育羽化得到供試實蠅。樣本信息如表1所示，每個采集地點用相應(yīng)的種群代碼表示。所有橘小實蠅成蟲經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，確認無誤后用無水乙醇浸泡，于-20℃保存。

表1 橘小實蠅不同地理種群樣本采集信息

（接上表）

1.2 DNA提取

取橘小實蠅單頭成蟲，使用DNeasy Blood&Tissue Kit（QIAGEN，德國）試劑盒按照說明書步驟提取總DNA。DNA樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增及序列測定

線 粒 體COI基 因（mt DNA COI）片 段 由Hco2198（TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC）和Lco1490（GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG）兩對引物進行PCR擴增[14]，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，PCR試劑為2xTaq PCR MasterMix II（takara，中國）。

PCR反應(yīng)體系為40μL：12μL模板DNA，20 μL 2xTaq酶，上下游引物各0.5 mmol/L，加ddH2O至總體積為40μL。PCR擴增反應(yīng)條件為：95℃下初始變性3 min，95℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，完成35次循環(huán)。最后72℃下延伸5 min，于4℃下保存。PCR反應(yīng)在Applied Biosystems ABI 3 730（Applied Biosystem，USA）上進行。使用1%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，檢測結(jié)果為陽性后委托廣州生物工程股份有限公司進行測序，所有序列采用雙向測序以保證序列的準確性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得序列通過BioEdit 7.0及DNAMAN 6.0進行剪切和拼接，最終獲得667 bp的mt COI序列。在軟件MEGA 7.0[15]中進行序列比對，計算多態(tài)性位點數(shù)、簡約信息位點數(shù)和自裔位點數(shù)，并基于堿基轉(zhuǎn)換和顛換的Kimura雙參數(shù)模型，計算各種群兩兩之間的遺傳距離，基于遺傳距離矩陣，以鄰接法（Neighbor-Joiningmethod，NJ）構(gòu)建種群系統(tǒng)發(fā)育樹。以DnaSP 5.0軟件[16]對COI序列進行單倍型判定，堿基排列完全相同的序列為同一單倍型，同時計算單倍型數(shù)目（the number of haplotypes，HN）、中性檢驗（Tests of selectiveneutrality）、錯配分布（Mismatch distribution）、單倍型多樣性（Haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，Nd）、平均核苷酸差異（average number of nucleotide differences，K）及其相應(yīng)標準偏差（SD）。由軟件Arlequin 3.5[17]完成種群間遺傳分化系數(shù)FST及基因流Nm計算（海島模式：公式Fst=1/（4Nm+1）），換算出基因流Nm值。以Excel插件XLSTAT（https：//www.xlstat.com/en/）計算兩方面內(nèi)容：遺傳多樣性指數(shù)與樣本數(shù)量之間的Pearson相關(guān)系數(shù)；完成Mantel檢驗，分析地理距離和遺傳分化系數(shù)間的相關(guān)性。由Network 10.0[18]軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，并對圖進行調(diào)整和校對。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

在所有樣品中最終獲得準確一致的長為667 bp的線粒體DNA COI基因部分序列條中，4種核苷酸的平均堿基含量為：A（35.23%）＞T（29.33%）＞G（18.59%）＞C（16.85%），有明顯的A+T偏向性，其線粒體DNA的堿基組成類似于其他雙翅目果實蠅屬昆蟲[18]。在667個堿基中共檢測到保守位點（conserved sites，c）529個，變異位點（variable sites，v）138個，其中包括自裔位點（singleton sites，s）23個和簡約信息位點（parsimony-informative site，pi）115個；在堿基的替換中，85個位點發(fā)生了轉(zhuǎn)換，34個位點發(fā)生了顛換，19個位點同時發(fā)生了轉(zhuǎn)換和顛換，所有多態(tài)性位點全部由堿基的替換產(chǎn)生，未發(fā)現(xiàn)插入和缺失。

mt DNA COI基因標記遺傳多樣性分析（表2）顯示，17個地理種群橘小實蠅樣本整體的單倍型多樣性為0.958，核苷酸多樣性為0.008 55，平均核苷酸差異數(shù)為5.702 17，顯示出較高水平的遺傳多樣性，各種群的遺傳多樣性指數(shù)表現(xiàn)出一定的差異。此外，各種群的樣本數(shù)量與核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數(shù)、單倍型多樣性的Pearson系數(shù)分別為0.171 1（P=0.576 3）、0.152 6（P=0.618 6）和0.154 0（P=0.615 4），表明種群間的遺傳多樣性差異與樣本數(shù)量無關(guān)。由于桂林全州、柳州融安、梧州蒼梧及賀州昭平4個地理種群樣本數(shù)量為1，故不參與種群遺傳多樣性數(shù)值的統(tǒng)計。在單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異3個參數(shù)中，防城港上思種群均明顯大于其他地理種群，防城港東興種群各項指標最低。防城港上思種群變異位點數(shù)最高，其次是崇左龍州種群，最低的是防城港東興種群。百色田陽、桂林永福種群的單倍型多樣性較大，玉林陸川、防城港東興和南寧江南區(qū)種群的單倍型多樣性明顯偏小。防城港上思、桂林永福和桂林恭城的核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)值較大，防城港東興、玉林陸川、貴港港南區(qū)的核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)值明顯小于其他種群。通過以上分析表明，17個地理種群在地域上有較明顯的多態(tài)性差異，防城港上思種群的遺傳多樣性相對較高，防城港東興種群的遺傳多樣性相對較低。

表2 廣西橘小實蠅不同地理種群遺傳多樣性指數(shù)

2.2 種群遺傳分化分析

如表3所示，177條序列中共鑒定出82種單倍型，其中共享單倍型22種，其余60種均為獨享單倍型。在22種共享單倍型中，9種單倍型為種群內(nèi)共享（Hap23在玉林玉州區(qū)種群內(nèi)；Hap54在崇左龍州種群內(nèi)；Hap65在貴港港南區(qū)種群內(nèi)；Hap71在南寧江南區(qū)種群內(nèi)；Hap78和Hap79在桂林恭城種群內(nèi)；Hap72、Hap76和Hap77在南寧隆安種群內(nèi)），13種單倍型在至少2個種群間共享。除樣本數(shù)量小于3的種群外，獨享單倍型在各種群中所占的比率普遍較高，表明這些種群之間已經(jīng)出現(xiàn)了一定程度的遺傳分化。

表3 廣西橘小實蠅17個地理種群的單倍型分布表

（接上表）

種群遺傳分化系數(shù)FST（F-statistic）和基因流（geneflow）是度量種群間的遺傳分化程度和各種群間基因交流情況的重要指標。當(dāng)FST＞0.25，表明種群間出現(xiàn)了極度的分化；0.15＜FST＜0.25，表明群間出現(xiàn)了高度分化；0.05＜FST＜0.15，表明種群間出現(xiàn)中度分化；FST＜0.05時，表明兩種群間基因型極度相似，即無遺傳分化發(fā)生。當(dāng)種群間基因流0＜Nm＜1時，兩個種群之間由遺傳漂變而發(fā)生了遺傳分化；當(dāng)1＜Nm＜4時，兩個種群之間發(fā)生了較低水平的遺傳分化；Nm＞4或為負值，兩個種群之間基因交流頻繁，在相當(dāng)程度上阻礙了種群間的遺傳分化[19]。種群間遺傳分化系數(shù)與基因流關(guān)系如表4所示，結(jié)果顯示，41.18%的FST值大于0.25，表明部分兩種群間已出現(xiàn)極度分化，33.09%的FST值小于0.05，表明有部分地理種群間無遺傳分化現(xiàn)象。其中桂林全州種群與梧州蒼梧種群，賀州昭平與桂林全州、梧州蒼梧種群，柳州融安與桂林全州、梧州蒼梧、賀州昭平種群的FST值均為1，并且桂林永福種群與其他種群之間FST值均大于0.95，貴港港南區(qū)種群與其他種群間FST值均大于0.25，表明桂林永福種群、貴港港南區(qū)種群與其他種群間出現(xiàn)極度分化。所有種群間基因流Nm的最大值出現(xiàn)在北海鐵山港種群與防城港上思種群之間（Nm=98.175 20），南寧隆安種群與百色田陽種群之間的基因流值最?。∟m=-397.075 34）。

表4 基于mt DNA COI基因橘小實蠅17個地理種群間遺傳分化系數(shù)F ST和基因流N m

通常昆蟲綱物種的線粒體COI基因的遺傳距離差異達0.05左右時便可視為產(chǎn)生了種的分化，達0.02左右時產(chǎn)生亞種的分化。由表5顯示，基于mt COI基因17個地理種群的橘小實蠅的遺傳距離介于0.001到0.166之間，其中桂林永福種群與各種群間的遺傳距離均大于其余16個種群相互間的遺傳距離，其與南寧江南區(qū)種群的遺傳距離接近0.02，而與其他所有種群間的遺傳距離均大于0.05，種群間遺傳距離差異明顯，表明桂林永福與其他地理種群遺傳差異更大。除桂林永福種群外16個橘小實蠅地理種群間遺傳分化的程度均較弱，遺傳距離值均小于0.02，遺傳分化不明顯。地理種群遺傳距離和FST值與各種群間空間距離間的Mantel結(jié)果表明，2對矩陣之間不存在顯著的相關(guān)性（R1=-0.073，P1=0.630；R2=-0.073，P2=0.674），即橘小實蠅種群間的遺傳分化程度與地理距離沒有顯著的相關(guān)性。

表5 基于mt DNA COI基因橘小實蠅17個地理種群間遺傳距離

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)

依據(jù)各種群的地理位置差異，將所有樣品分為17個地理種群進行AMOVA（analysis of molecular variance）分析，如表6所示，發(fā)現(xiàn)種群間變異占45.26%，種群個體間變異占了54.74%，結(jié)果表明引起種群總體變異的主要因素還是種群內(nèi)的個體間變異。

表6 橘小實蠅17個地理種群的分子變異分析（AMOVA）

在單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）中不同灰度代表一個地理種群，圓面積與單倍型頻率成正比?？傮w呈現(xiàn)星狀分布，進一步證實廣西區(qū)橘小實蠅種群經(jīng)歷了種群擴張過程。單倍型Hap1出現(xiàn)頻率最高，存在于11個地理種群中，Hap17次之，存在于4個種群中，低頻率單倍型大多分布在單倍型網(wǎng)絡(luò)外圍，經(jīng)一步或多步突變與高頻率單倍型相連。各單倍型散亂分布，缺乏明顯地理分布格局。南寧隆安單倍型（Hap73和Hap74）衍生于防城港上思（Hap46）和崇左龍州（Hap54）。南寧隆安種群與防城港上思種群的遺傳分化系數(shù)（0.037 44）較崇左龍州種群的遺傳分化系數(shù)（0.027 24）大，因而南寧隆安單倍型更有可能衍生于崇左龍州單倍型。

圖1 廣西17個橘小實蠅地理種群的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

鄰接法建立的橘小實蠅地理種群系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結(jié)構(gòu)（圖2）顯示擁有共同單倍型的橘小實蠅種群基本匯在一起。桂林永福種群形成單獨一支，其他種群在系統(tǒng)發(fā)育樹上有一定的地理分布格局，但并非同一地理種群所有個體的序列都聚在一起。

圖2 鄰接法構(gòu)建基于mt DNA COI基因序列的17個橘小實蠅地理種群系統(tǒng)進化樹

2.4 種群歷史動態(tài)

中性檢驗并結(jié)合錯配分布（Mistmatch distibution）常用于群體歷史動態(tài)推斷[18]。中性檢驗運用Tajima'D和Fu's Fs統(tǒng)計，結(jié)果顯示中性檢驗的Tajima'D值為-2.516 40，為極顯著性負值（P＜0.001），推斷該群體經(jīng)歷了規(guī)模擴張及定向選擇；Fu's Fs值為-85.957，且錯配分布圖（圖3）呈單峰分布，說明本研究的橘小實蠅群體可能在歷史上經(jīng)歷過突然擴張的事件。

圖3 廣西17個橘小實蠅地理種群的錯配分析

3 討論

橘小實蠅mt DNA COI序列片段堿基組成表現(xiàn)出明顯的A+T偏好性，這符合脊椎動物線粒體基因的堿基組成明顯偏好性的特點[20]。遺傳距離結(jié)果表明，橘小實蠅種群間具有較高的遺傳相似性，同時又存在一定的遺傳分歧，證實mt DNA COI基因核苷酸堿基序列在一定程度上能夠反映出橘小實蠅種群間的遺傳相似性和差異性。聚類分析結(jié)果反映了橘小實蠅群體間具有一定的地理聚集分布格局，證明了可利用mt DNA COI基因序列開展橘小實蠅種群遺傳多樣性等相關(guān)研究。

遺傳距離的大小反映地理種群間親緣關(guān)系的遠近[21]，玉林陸川與賀州昭平遺傳距離最小，桂林永福與貴港港南區(qū)遺傳距離最大，這與Mantel檢測結(jié)果得出結(jié)論一致，即遺傳分化大小與地理空間距離無關(guān)。推測可能橘小實蠅種群間高頻率的遷移或擴散（如水果調(diào)運）克服了遺傳漂變對種群的分化效應(yīng)。

橘小實蠅種群高水平的遺傳多樣性，表明其對環(huán)境變化有著較強的適應(yīng)能力，就其入侵性而言，復(fù)雜的種群結(jié)構(gòu)更有利于定殖與擴散[22]。20世紀50年代后，橘小實蠅在廣東、云南、廣西、福建以及貴州等地發(fā)生。隨后十年里橘小實蠅已跨越長江，達到了32°N的高緯度地區(qū)[23]。到20世紀80年代，該物種的種群數(shù)量急劇增加，分布范圍擴大到中國南方的大部分地區(qū)，陸續(xù)在江西、湖北、浙江、上海、江蘇、安徽和重慶等地區(qū)發(fā)現(xiàn)，其為害達到26°N的高緯度地區(qū)[24-25]。此外，北京、天津等地區(qū)也已成為橘小實蠅適生區(qū)[26-27]。廣西區(qū)內(nèi)，桂林整體遺傳多樣性指數(shù)突出，桂林永福的種群分化極顯著，系統(tǒng)發(fā)育成獨立的一個支系，很有可能與桂林廣闊的水果種植面積以及豐富的種類有關(guān)。廣西作為一個果蔬種植大省，僅柑橘類水果在廣西水果總產(chǎn)量中就占有相當(dāng)大的比例。據(jù)不完全統(tǒng)計，2020年廣西柑橘種植面積可能已超過50萬公頃。廣西桂林居柑橘類水果產(chǎn)地榜首，橘小實蠅具有轉(zhuǎn)移寄主危害的特性，廣泛的寄主為桂林種群高度分化提供了條件[24]。貴港港南區(qū)為另一極度分化的地理種群，但桂林永福與貴港港南區(qū)遺傳距離極顯著，推測貴港地理種群高度的遺傳分化現(xiàn)象可能是多次入侵的結(jié)果。

廣西橘小實蠅不同地理種群之間基因交流Nm平均值為0.302 35，基因交流較頻繁；分子變異分析結(jié)果進一步證實，橘小實蠅群體的遺傳變異主要來自于種群內(nèi)部，不同地理種群間基因相互滲透，可能與橘小實蠅自身強大的遷徙能力以及氣流擴散等因素相關(guān)[28]。除桂林永福地理種群外，大多數(shù)種群并未與同一地理種群聚類，大部分種群間保持中高度FST值和Nm值，這種長距離種群間的傳播可能與不同地區(qū)之間的種苗調(diào)運有關(guān)[12]。廣西水果種植面積迅速擴增，水果在各種植區(qū)相互調(diào)運，促使橘小實蠅在不同地域相互侵染，呈現(xiàn)出不同地區(qū)COI序列在各地理種群間混雜的現(xiàn)象。

私有單倍型的出現(xiàn)，是生物適宜環(huán)境的結(jié)果，可減少物種間基因交流的影響，從而保持穩(wěn)定的種群遺傳多樣性[19，28]。本研究檢測到不同地理種群橘小實蠅的單倍型中私有單倍型較共享單倍型更多，對于同一單倍型在地理距離相距較遠的種群之間共享的現(xiàn)象，推測可能源于種群間的基因交流或原始單倍型多態(tài)性的保留。單倍型Hap1在大部分地理種群中均有分布且出現(xiàn)頻率最高，并位于星狀圖中央，由此推測單倍型Hap1為橘小實蠅群體中廣泛分布的高適應(yīng)性的祖先單倍型[22]。

樣品數(shù)量可能對遺傳分化系數(shù)及基因流的統(tǒng)計存在一定影響。本研究取樣點分布范圍廣，具有一定地區(qū)代表性，為更好地明確廣西橘小實蠅的來源及擴散路徑，后續(xù)研究可以考慮增加不同地理種群的樣本量或基因數(shù)目，并且聯(lián)合廣西周邊省份的橘小實蠅樣本進一步深入分析。