劉菊，白明學(xué)*，張紅偉，金云隆，呂鵬，高曉潔（.鄭州市中醫(yī)院，鄭州 450007；.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 45008）

升降茶由大黃、姜黃、僵蠶、蟬蛻4味中藥組成，具升清降濁、散風(fēng)清熱之功，主治溫病表里三焦大熱，癥見低熱或未發(fā)熱、干咳、少痰、咽干咽痛、倦怠乏力、胸悶、脘痞、嘔惡、便溏等。該品種是2020年3月鄭州市中醫(yī)院在河南省食品藥品監(jiān)督管理局應(yīng)急備案的中藥制劑，該方來源于經(jīng)典名方升降散。

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，其療效經(jīng)多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用。指紋圖譜技術(shù)對(duì)中藥制劑質(zhì)量控制具有針對(duì)性和合理性[1]。單一成分的含量測(cè)定也無法全面、真實(shí)地評(píng)價(jià)其整體質(zhì)量。王智民等[2-3]率先提出一測(cè)多評(píng)法（QAMS），即利用一種成分的對(duì)照品作為內(nèi)參物，建立該成分與其他成分之間的相對(duì)校正因子，通過相對(duì)校正因子計(jì)算其他成分含量，來實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步測(cè)定，具有快速、簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，近年來在中藥復(fù)方制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)中廣泛使用。為全面控制升降茶質(zhì)量，本研究建立HPLC指紋圖譜，從中藥物質(zhì)基礎(chǔ)角度出發(fā)，系統(tǒng)、整體、穩(wěn)定地表征其共有成分及內(nèi)在特征。并采用一測(cè)多評(píng)法，以穩(wěn)定易得、價(jià)格低廉的姜黃素為內(nèi)標(biāo)物，實(shí)現(xiàn)其他4種成分含量的同步測(cè)定。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；JA2003N電子天平（上海菁海儀器設(shè)備有限公司）；AB265-5型電子天平（d＝0.01 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司）；超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-4恒溫水浴鍋（河南天帝電子科技有限公司）。

1.2 試藥

升降茶（鄭州市中醫(yī)院，批號(hào)：200125、200126、200127、200203、200204、200205、200206、202007、200208、200209，編號(hào)分別為S1～S10）。姜黃素（批號(hào)：110823-201706，含量：98.7%）、蘆薈大黃素（批號(hào)：110795-201007，含量：98.0%）、大黃酸（批號(hào)：110757-201607，含量：99.3%）、大黃素（批號(hào)：110756-201913，含量：96.0%）、大黃酚（批號(hào)：110796-201922，含量：99.4%）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜的建立[4-9]

2.1.1 色譜條件 色譜柱Phenomenex Lune C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，60%～70%B；5～12 min，70%～79.5%B；12～20 min，79.5%B；20～25 min，60%B），流速為1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為25℃。

2.1.2 對(duì)照品母液制備 分別取蘆薈大黃素、姜黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解稀釋制成每l mL含31.2 μg蘆薈大黃素、423.9 μg姜黃素、31.8 μg大黃酸、49.5 μg大黃素、39.6 μg大黃酚的混合對(duì)照品母液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取升降茶內(nèi)容物0.25 g，精密稱定，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，放冷，補(bǔ)足重量，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 單味飲片溶液制備 分別單獨(dú)取大黃、姜黃、蟬蛻、僵蠶飲片0.1 g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別制成大黃、姜黃、蟬蛻、僵蠶單味飲片溶液。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)：200125），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定6次，以6號(hào)峰（姜黃素）為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.65%（n＝6），相對(duì)峰面積RSD均小于0.95%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)：200125），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以6號(hào)峰（姜黃素）為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.89%（n＝6），相對(duì)峰面積RSD均小于0.68%（n＝6），表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)：200125），按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以6號(hào)峰（姜黃素）為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.95%（n＝6），相對(duì)峰面積RSD均小于1.1%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 相似度評(píng)價(jià) 取10批升降茶，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012A版）進(jìn)行分析，10批次指紋圖譜共有模式及生成對(duì)照?qǐng)D譜見圖1。共標(biāo)定出12個(gè)共有峰，由于6號(hào)峰（姜黃素）保留時(shí)間穩(wěn)定、峰面積較大，對(duì)稱度好，故選擇其作為參照峰（S）。測(cè)得10批樣品相似度分別為0.997、0.984、0.992、0.993、0.997、0.998、0.996、0.981、0.989、0.997，均大于0.98，表明各批次樣品之間的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

圖1 10批樣品HPLC指紋圖譜共有模式及各成分對(duì)照?qǐng)D譜Fig 1 HPLC fingerprints common model of 10 sample batches and reference chromatograms of various constituents

圖2 單味藥HPLC指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprint of single herb

2.1.9 共有峰指認(rèn)歸屬 通過各峰保留時(shí)間并結(jié)合對(duì)照品溶液定位，確認(rèn)出其中5個(gè)色譜峰，分別為5號(hào)峰蘆薈大黃素、6號(hào)峰姜黃素、7號(hào)峰大黃酸、9號(hào)峰大黃素、11號(hào)峰大黃酚。通過單味姜黃、大黃、僵蠶、蟬蛻圖譜比對(duì)，確認(rèn)1～5、7、9、11號(hào)峰來源于大黃，6、8、10、12號(hào)峰來源于姜黃。

2.1.10 聚類分析 以10批升降茶作為研究對(duì)象，應(yīng)用SPSS 22.0軟件，以6號(hào)（姜黃素）峰為參照峰，將12個(gè)特征峰相對(duì)峰面積之和導(dǎo)入軟件，采用中位數(shù)聚類法，歐式距離平方為測(cè)量區(qū)間，樹狀結(jié)果見圖3，顯示10批升降茶聚為3類，S1、S2、S3、S8、S9、S10聚為一類，S5、S6聚為一類，S4、S7為一類。這說明升降茶不同批次之間相對(duì)峰面積之和有所差異，這可能與飲片來源廠家、產(chǎn)地、批號(hào)差異有關(guān)，這為本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度制訂提供數(shù)據(jù)依據(jù)，也提示日后生產(chǎn)過程中，注意原料質(zhì)量的穩(wěn)定性和均一性。

圖3 升降茶指紋圖譜聚類分析樹狀圖Fig 3 Cluster analysis diagram of fingerprint for Shengjiang tea

2.2 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定5種成分含量[10-14]

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品母液5 mL，加甲醇稀釋至10 mL，得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 陰性樣品溶液制備 分別取缺大黃陰性制劑、缺姜黃陰性制劑，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，制成缺大黃、缺姜黃的陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，“2.2.2”項(xiàng)下缺大黃陰性樣品溶液、缺姜黃陰性樣品溶液各10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，理論板數(shù)按姜黃素峰計(jì)不低于3000，分離度大于1.5，陰性樣品無干擾，見圖4。

圖4 升降茶各成分HPLC色譜圖Fig 4 HPLC chromatogram of various constituents in Shengjiang tea

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品母液，逐級(jí)稀釋后分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（mAU*s）為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得5種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表1，5種成分在各自范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab 1 Linearity of various constituents

2.2.5 相對(duì)校正因子測(cè)定 將“2.2.4”項(xiàng)下不同濃度混合對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10 μL，以姜黃素為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他4種成分的相對(duì)校正因子，結(jié)果見表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子Tab 2 Relative correction factor of various constituents

2.2.6 精密度驗(yàn)證 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得蘆薈大黃素、姜黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚面積RSD分別為0.12%、0.23%、0.54%、0.18%、0.27%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性驗(yàn)證 取樣品（批號(hào)：200125），按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，蘆薈大黃素、姜黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚含量RSD分別為0.54%、0.95%、1.1%、0.74%、0.89%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性驗(yàn)證 取樣品（批號(hào)：200125），于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得蘆薈大黃素、姜黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為0.23%、0.31%、0.44%、0.37%、0.35%（n＝5），表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率驗(yàn)證 取已知含量樣品（批號(hào)：200125）0.125 g平行6份，分別加入混合對(duì)照品溶液5 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，進(jìn)樣測(cè)定，蘆薈大黃素、姜黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚加樣回收率分別為100.2%（RSD＝1.1%）、99.8%（RSD＝0.30%）、99.6%（RSD＝0.53%）、99.9%（RSD＝0.85%）、100.3%（RSD＝1.2%）。

2.2.10 相對(duì)校正因子耐用性考察 更換Agilent1260色譜儀、島津LC-2010 型色譜儀，更換 Agilent Extend-C18、Waters Symmetry C18、Phenomenex Lune C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），調(diào)節(jié)柱溫25、30、35℃，調(diào)節(jié)流速0.8、1.0、1.2 mL·min－1，分別測(cè)定相對(duì)校正因子，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚相對(duì)校正因子分別在0.1856～0.1925、0.1465～0.1532、0.2998～0.3141、0.2446～0.2546內(nèi)，RSD均小于2.0%，表明儀器、色譜柱、柱溫、流速更改對(duì)相對(duì)校正因子無明顯影響。

2.2.11 色譜峰定位考察 以相對(duì)保留時(shí)間為指標(biāo)定位色譜峰，更換儀器、色譜柱考察對(duì)其的影響，結(jié)果見表3，可知儀器、色譜柱更改對(duì)相對(duì)保留時(shí)間均無明顯影響。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響(n＝6)Tab 3 Effect of different instruments and columns on relative retention time (n＝6)

2.2.12 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，按 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量，結(jié)果見表4，兩種方法所得結(jié)果無明顯差異（RSD＜2%）。

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg·g－1，n＝3)Tab 4 Content determination of various constituents (mg·g－1，n＝3)

3 討論

3.1 質(zhì)控指標(biāo)選擇

君藥指針對(duì)主病或主證起主要作用的藥物，其藥力居方中之首，用量較作為臣、佐藥大。所以現(xiàn)在部分學(xué)者認(rèn)為升降散君藥為大黃。大黃瀉下、抗菌有效成分主要為蒽醌類化合物（大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚）。姜黃含姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素等成分。目前關(guān)于大黃、姜黃化學(xué)成分定性定量研究較為成熟。但僵蠶、蟬蛻化學(xué)成分研究多集中在氨基酸、蛋白質(zhì)、微量元素類成分，《中國(guó)藥典》至今未收載其定性定量方法，也是目前含僵蠶、蟬蛻等動(dòng)物藥的中藥制劑質(zhì)量控制研究難點(diǎn)。因此本研究中升降茶含量測(cè)定僅選擇蘆薈大黃素、姜黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚作為質(zhì)控指標(biāo)開展研究。

3.2 色譜條件優(yōu)化

本研究考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液四種流動(dòng)相系統(tǒng)，最終確定采用甲醇-0.1%磷酸溶液。對(duì)其梯度洗脫程序反復(fù)調(diào)試，確定了本文的洗脫條件。此條件下，各化學(xué)成分洗脫完全，色譜峰分離度及峰形較好，能夠滿足指紋圖譜建立要求。

4 結(jié)論

本研究首次建立升降茶HPLC指紋圖譜，并采用一測(cè)多評(píng)法同步測(cè)定蘆薈大黃素、姜黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚的含量，10批制劑相似度均大于0.98，相對(duì)校正因子在不同儀器、色譜柱、流速、柱溫條件下均較穩(wěn)定，且操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)成本低，可用于升降茶的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。