楊天歌，倪詩(shī)婷，高旭華，陶歐（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

香附為莎草科植物莎草（Cyperus RotundusL.）的干燥根莖，氣香，味辛、微苦、微甘，平；歸肝、脾、三焦經(jīng)；具有疏肝解郁、理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛的功效[1]；主要成分為揮發(fā)油類、黃酮類、糖類、生物堿類、酚類和三萜類化合物[2]。其揮發(fā)油類成分具有鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、抑制子宮收縮、雌激素樣作用等[3-4]。關(guān)于香附揮發(fā)性成分已有較多研究并且普遍為提取揮發(fā)油后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，王艷等[5]建立了12批香附藥材揮發(fā)油的指紋圖譜，方蕾等藥理作用[6-7]參照揮發(fā)油測(cè)定法中的甲法結(jié)合GC-MS分別鑒定對(duì)比了藥對(duì)香附-藿香和陳皮-香附的揮發(fā)油，齊菲等[8]采用GC-MS法對(duì)比了隔水和共水蒸餾對(duì)香附揮發(fā)油提取的影響。香附醋炙后，能增強(qiáng)其疏肝止痛之功效[9]。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)醋香附成分研究有提取揮發(fā)油的GC-MS法和HPLC檢測(cè)等方法[10-11]。頂空進(jìn)樣（HS）-GC-MS法操作簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)安全、無需溶劑[12]。采用頂空進(jìn)樣法可避免揮發(fā)油長(zhǎng)時(shí)間提取造成的易揮發(fā)成分的損耗，醋香附經(jīng)粉碎后即可裝樣測(cè)量，有利于節(jié)約時(shí)間，且直接氣體進(jìn)樣能夠更直觀地反應(yīng)醋香附氣味特征，為醋香附進(jìn)一步合理利用、質(zhì)量評(píng)價(jià)、香附與醋香附氣味對(duì)比提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

7697A HS-7890B GC-5977A MS 型頂空進(jìn)樣-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；BSA124S電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；FW200 高速萬能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）。

醋香附（北京市金象大藥房，批號(hào)：19112007，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟教授鑒定為莎草科植物莎草Cyperus rotundusL.的干燥根莖醋炙后的飲片）。

2 方法

2.1 樣品制備

將醋香附用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過4號(hào)篩。稱取醋香附粉迅速裝入20 mL頂空進(jìn)樣瓶，加蓋密封，待測(cè)。以空瓶加蓋密封為空白對(duì)照。

2.2 儀器參數(shù)設(shè)置

GC條件：色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；樣口溫度為130℃，載氣為高純氦氣（純度＞99.999%）；流速為1.0 mL·min－1；柱流量控制模式為恒流；升溫程序（柱溫初始50℃，以2℃·min－1升溫至70℃，以10℃·min－1升至120℃，以3℃·min－1升至210℃；后運(yùn)行溫度230℃，5 min）。

MS條件：離子源為電子轟擊離子源（EI），電離電壓為70 eV，選擇全離子掃描模式，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃，接口溫度為130℃；溶劑延遲0 min。

HS條件：孵育溫度為120℃，定量環(huán)/閥溫度為130℃，傳輸線溫度為130℃，GC循環(huán)時(shí)間為55 min，孵育時(shí)間為40 min，進(jìn)樣量為1000 μL。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13-14]。

2.4 頂空進(jìn)樣條件的考察

2.4.1 稱樣量 參考文獻(xiàn)[15-16]及儀器稱樣量限制，分別稱取樣品0.3、0.6、1 g，進(jìn)行檢測(cè)。不同稱樣量檢測(cè)出總峰面積如圖1所示。結(jié)果表明，稱樣量為1 g時(shí)，總峰面積最大。因進(jìn)樣瓶裝量限制，因此稱樣量最大為1 g。

圖1 稱樣量對(duì)峰面積影響Fig 1 Effect of sample weight on the peak area

2.4.2 頂空瓶孵育溫度 分別考察80、90、100、105、120、140、160、200℃孵育溫度對(duì)色譜峰數(shù)量與面積的影響。結(jié)果表明，孵育溫度超過120℃時(shí)，樣品顏色明顯加深，出現(xiàn)變質(zhì)現(xiàn)象，因此120℃以上的溫度不考慮。在80、90、100、105、120℃各溫度下，色譜峰數(shù)量逐漸增加，色譜圖總峰面積如圖2所示，呈增加趨勢(shì)。

圖2 孵育溫度對(duì)峰面積影響Fig 2 Effect of incubation temperature on the peak area

2.4.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)。綜合考慮總峰面積、揮發(fā)油提取的溫度和單因素試驗(yàn)，擬定正交因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Tab 1 Orthogonal factor level

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tab 2 L9(34) orthogonal test

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

極差分析結(jié)果表明，RA＞RC＞RB，即孵育溫度影響最大，其次是稱樣量，孵育時(shí)間影響最小。但孵育時(shí)間對(duì)總峰面積影響不與時(shí)間成正比，在30 min時(shí)面積下降，推測(cè)其原因可能是樣品孵育時(shí)，易揮發(fā)性成分最先揮發(fā)至瓶上端使上方氣體濃度短時(shí)間升高，造成氣體混合不均，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，進(jìn)樣瓶中氣體混合均勻，且較難揮發(fā)性成分得以揮發(fā)使最終總峰面積增大。由方差分析可知，A因素3個(gè)水平P＝0.022＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B和C因素（P＞0.05）對(duì)結(jié)果沒有影響。綜合極差分析結(jié)果，選取使總峰面積最大的參數(shù)為A3B3C3，即孵育溫度為120℃，孵育時(shí)間為40 min，稱樣量為1.0 g。

3 結(jié)果與討論

經(jīng)GC-MS分析，得到醋香附揮發(fā)性成分和空白對(duì)照的GC-MS總離子流圖，見圖3及4。由圖3可知，1號(hào)峰為空白峰。色譜結(jié)果查看及質(zhì)譜解析由Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00解析軟件操作完成并確定化合物[17-19]。扣除空白峰后以峰面積歸一化法測(cè)定各組分的相對(duì)百分含量。對(duì)GC-MS圖譜中的各峰進(jìn)行質(zhì)譜解析后與NIST14.L數(shù)據(jù)庫(kù)匹配確定醋香附揮發(fā)性成分，結(jié)果見表4。從醋香附中共檢出41個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)，可以反映醋香附樣品中揮發(fā)性成分的總體特征。

圖3 醋香附揮發(fā)性成分總離子流圖Fig 3 Total ion current of volatile components in Cyperi Rhizome prepared with vinegar

圖4 空白對(duì)照的總離子流圖Fig 4 Total ion current of the blank control

表4 醋香附揮發(fā)性成分表Tab 4 Volatile components in Cyperi Rhizome prepared with vinegar

續(xù)表4

其中，相對(duì)含量＞1%的揮發(fā)性成分有醋酸、芹松香醇、環(huán)丙烯、lemnalol、脫氫芳烴、α-古巴烯、β-馬來烯、莎草烯、羅丹烯、β-蛇床烯、環(huán)氧萜烯、氧化石竹烯、8-氧代-9H-環(huán)異長(zhǎng)葉烯、香附烯酮、α-莎草酮，占總揮發(fā)性成分的87.01%，是醋香附主要揮發(fā)性成分。2號(hào)峰醋酸的發(fā)現(xiàn)也驗(yàn)證了本樣品為香附的醋炙品。所有鑒定出的揮發(fā)性成分中氧化石竹烯、桉油精、古巴烯、莎草烯等成分在香附揮發(fā)油中也有檢出[6，8-9，20]，但總體檢出成分并不完全相同，可見提取方法與醋炙對(duì)香附的揮發(fā)性成分存在影響。HS-GC-MS法分析表明，醋香附揮發(fā)性成分中烯烴相對(duì)含量大于79.17%，含量最多，與徐黔江等[10]研究結(jié)論相符。

頂空進(jìn)樣法直接將樣品密封于樣品瓶中，經(jīng)加熱孵育可收集樣品全部揮發(fā)性成分，不必?fù)?dān)心加熱過程中低沸點(diǎn)成分的損耗；樣品經(jīng)粉碎后可直接裝樣檢測(cè)，節(jié)省時(shí)間，也不需要復(fù)雜的提取過程因此樣品基質(zhì)干擾極?。粚?duì)于體積小、氣味濃烈的樣品具有無損檢測(cè)的潛力。本研究還可以為醋香附與香附的氣味對(duì)比研究和醋香附與其易混品的快速鑒別提供參考。