吳文理，黃保駕，陳天乙，李煌（.廈門市中醫(yī)院，福建 廈門 6009；.晉江梅嶺街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，福建 泉州 600；.廈門市兒童醫(yī)院，福建 廈門 6006；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 50）

靈源萬應(yīng)茶為養(yǎng)生藥茶，可疏風(fēng)解表、祛暑化濕，是閩南一帶及東南亞地區(qū)常用的防暑降溫藥茶。靈源萬應(yīng)茶是由木香、廣藿香、鬼針草等58味中藥材、紅茶和麥粉加工而成。這項傳統(tǒng)制備工藝是藥餅在反復(fù)蒸曬的過程中利用環(huán)境中的微生物自然發(fā)酵，工藝獨具特色。在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中，雖然有關(guān)于靈源萬應(yīng)茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，但原有標(biāo)準(zhǔn)中僅包含檢查項，并無含量測定項。另外，該制劑的相關(guān)研究報道較少，目前也尚未見有同時定量檢測靈源萬應(yīng)茶中多種成分的方法。此外已有研究表明，緊壓茶隨著發(fā)酵時間的延長，有機酸含量減少[1]。在日常飲用中發(fā)現(xiàn)，靈源萬應(yīng)茶口感有時略有差異，推測口感與其有機酸含量密切相關(guān)，因此，本研究采用了UPLCMS/MS法檢測靈源萬應(yīng)茶中原兒茶酸、綠原酸、丁香酸、肉桂酸等9種有機酸的含量，以期為該制劑的全面質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

XS105DU型十萬分之一分析天平（美國Mettler-Toledo公司）；TDL-40B低速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SCIEX QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜（美國SCIEX公司）；Nexera X2超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；甲醇、乙酸銨和甲酸（色譜純，德國Merck公司）；其余試劑為分析純。

靈源萬應(yīng)茶（泉州市靈源藥業(yè)有限公司，批號：190601、191002、191101，規(guī)格：15 g/塊）；原兒茶酸（批號：110809-200604，純度＞99%）、綠原酸（批號：110753-201716，純度＞99%）對照品（中國食品藥品檢定研究院）；對羥基苯甲酸對照品（上海寶曼生物科技有限公司，批號：D13O8S45560，純度＞99.1%）；咖啡酸對照品（成都曼思特生物技術(shù)有限公司，批號：MUST-17032010，純度＞98.5%）；香草酸（批號：H11J9Z65318）、丁香酸（批號：S23F7K9842）、鄰苯二甲酸（批號：AM0509LB14）、芥子酸（批號：S05M6Y）和肉桂酸（批號：AA0806LB14）對照品（純度均＞98%，南京森貝伽生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack XR-ODSⅢ（2 mm×75 mm，1.6 μm）；流動相：0.1%甲酸5 mmol·L－1乙酸銨水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～0.5 min，35%B；0.5～3.5 min，35%B→90%B；3.5～5.0 min，90%B；5.0～5.5 min，90%B→35%B；5.5～7.0 min，35%B）；流速：0.30 mL·min－1；柱溫：40℃；進樣量：5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧（ESI）離子源，在MRM正負離子模式下掃描，毛細管電壓：4500 V，脫溶劑溫度：500℃、氣流：氮氣800 L·h－1，錐孔氣流：氮氣150 L·h－1，離子源溫度：550℃，二級錐孔萃取電壓：3 V，碰撞氣體：氬氣，各成分的具體質(zhì)譜分析參數(shù)如下表1所示。各成分的MRM圖如圖1所示。

圖1 對照品（A）和供試品（B）的 UPLC-MS/MS圖Fig 1 UPLC-MS/MS of the reference substances（A）and sample（B）

表1 各成分的保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)Tab 1 Retention time and MS parameters of various constituents

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 精密稱取2.0 g靈源萬應(yīng)茶樣品置于圓底燒瓶中，加入100 mL 60%乙醇，精密稱定，加熱回流2 h，冷卻，60%乙醇補足重量，過濾，搖勻，取濾液定容至25 mL量瓶中，在45℃水浴下旋蒸至干，精密加入2.5 mL 50%甲醇溶液，渦旋溶解，轉(zhuǎn)移到離心管中，以10 000 r·min－1離心10 min，過0.22 μm微孔濾膜，取上清液，即得供試品溶液（4℃下保存）。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取原兒茶酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、鄰苯二甲酸、芥子酸和肉桂酸對照品適量，加入甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.10、1.22、1.02、1.31、1.27、1.13、1.05、1.00、1.39 mg·mL－1的單一對照品溶液；分別精密量取上述對照品溶液90.9、82.0、98.0、76.3、78.7、88.5、95.2、100.0、71.9 μL，置于10 mL量瓶內(nèi)，加入20%甲醇水至刻度，可得各成分質(zhì)量濃度均為10 μg·mL－1的混合對照品儲備液，其他不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液均由其逐級稀釋所得。

2.3 UPLC-MS/MS方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項下對照品儲備液適量，用20%甲醇稀釋，配制系列質(zhì)量濃度的對照品混合溶液，進樣分析。以對照品溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，各成分定量離子峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r），信噪比（S/N）＝10得定量限，結(jié)果見表2。

表2 線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量下限Tab 2 Regression equation，linearity and LLOQ of various constituents

2.3.2 精密度試驗 取各成分質(zhì)量濃度均為0.1 μg·mL－1的混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次測定，結(jié)果各有機酸成分峰面積RSD結(jié)果見表2，表明本試驗所用的儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取靈源萬應(yīng)茶樣品，按“2.2.1”項下方法制備，分別于制備后的0、2、4、8、12、24 h進樣測定。結(jié)果各有機酸成分峰面積RSD結(jié)果見表2，表明在24 h內(nèi)供試品溶液相對穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗 精密稱取靈源萬應(yīng)茶樣品6份，按“2.2.1”項下方法制備，進樣測定，各成分含有量的RSD結(jié)果見表2，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收試驗 精密稱取6份1.0 g靈源萬應(yīng)茶樣品，分別加入一定體積的混合對照品溶液，進行加樣回收率考察。結(jié)果9種成分的平均回收率在97.4%～100.9%，RSD在1.2%～2.8%（n＝6），表明該方法準(zhǔn)確度較高（見表3）。

表3 加樣回收試驗(n＝6)Tab 3 Recovery (n＝6)

2.3.6 樣品含量測定 取3批靈源萬應(yīng)茶樣品，分別精密稱取2.0 g，每批各3份。按“2.2.1” 項下方法制備，按“2.1”項下條件進樣分析，計算含量。在3份樣品中，各成分平均含量分別為：原兒茶酸（316.0±30.2）mg·kg－1、綠原酸（551.0±69.1）mg·kg－1、對羥基苯甲酸（43.6±4.3）mg·kg－1、咖啡酸（40.9±3.8）mg·kg－1、香草酸（25.4±2.1）mg·kg－1、丁香酸（16.6±1.8）mg·kg－1、鄰苯二甲酸（22.4±2.0）mg·kg－1、芥子酸（0.378±0.040）mg·kg－1、肉桂酸（20.4±1.9）mg·kg－1。

3 討論

3.1 測定方法的選擇

關(guān)于靈源萬應(yīng)茶的測定方法，謝敏等[2]通過薄層色譜法鑒別其中含有的木香、肉桂、積雪草和丁香4味藥材，以建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。林雋丹等[3]采用HPLC法，測定其桂皮醛的含量情況。本方由58味中藥材加紅茶組成，有效成分十分復(fù)雜，并且大部分藥材成分含量較低，容易因為相互干擾和受雜質(zhì)干擾而影響測定結(jié)果，無法較好地控制其質(zhì)量。全方中藥材質(zhì)量≤10 g的品種高達40種，檢測難度較大。近年來，UPLC-MS/MS法在中成藥研究中的應(yīng)用越來越多[4-6]，因此，本研究選擇了UPLC-MS/MS法，并且選擇MRM模式對靈源萬應(yīng)茶的成分進行含量測定[7]，分析周期短，能夠在7 min內(nèi)將9種成分完全分離，實現(xiàn)了靈源萬應(yīng)茶中9種有機酸成分含量的同時測定，節(jié)約了檢測時間。

3.2 測定成分的選擇

靈源萬應(yīng)茶組成藥味眾多，成分復(fù)雜，主要含有機酸類、黃酮類和皂苷類等，其中，有機酸類成分是靈源萬應(yīng)茶中的一大類重要成分，具有較為廣泛的藥理作用。綠原酸作為一種水溶性有機酸，廣泛分布在植物界中，具有較強的生物活性，可抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗炎及抗病毒等[8]。研究發(fā)現(xiàn)靈源茶中綠原酸的含量最高，與其處方中多味藥材如墨旱蓮[9]、一點紅[10]、木香、紫花地丁、葉下珠等均含有綠原酸有關(guān)。原兒茶酸具有羥基結(jié)構(gòu)，因此抗氧化能力較強，甚至超過了維生素C、維生素E等[11]。對羥基苯甲酸同樣也具有抗炎抑菌作用，其可能是發(fā)揮抗氧化作用的物質(zhì)之一，并且對治療腫瘤方面有潛在的間接作用[12]?？紤]到靈源萬應(yīng)茶是養(yǎng)生藥茶，在保證療效的同時需要較好的口感，目前已有報道顯示原兒茶酸等與茶口感相關(guān)[13]，因此本文選擇了這9種有機酸作為檢測指標(biāo)。

3.3 色譜條件的選擇

選用了不同型號、不同粒徑與不同長度的色譜柱檢測靈源萬應(yīng)茶中9種有機酸成分的分離效果，結(jié)果顯示，Shim-pack XR-ODSIII（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）色譜柱的分離度和靈敏度最佳。另外，在考察流動相對測定成分的洗脫情況時，首先選擇了常用的甲醇-水和乙腈-水，結(jié)果顯示乙腈洗脫能力太強，造成9種有機酸成分的體系分離效果較差，因此流動相選擇了甲醇-水。再考察流動相中加入甲酸和乙酸銨，發(fā)現(xiàn)甲酸和乙酸銨可提高離子響應(yīng)及積分準(zhǔn)確度、改善各有機酸成分的離子峰形，結(jié)果表明，當(dāng)甲酸體積分數(shù)達到0.1%、乙酸銨為5 mmol·L－1時響應(yīng)良好，且峰形最佳。因此本試驗的流動相最終選擇了0.1%甲酸5 mmol·L－1乙酸銨水溶液-甲醇。

本試驗以靈源萬應(yīng)茶9種有機酸成分作為研究對象，并對其進行了方法學(xué)考察，所建立的UPLC-MS/MS法準(zhǔn)確快速，可以同時測定9種有機酸成分含量，為靈源萬應(yīng)茶有機酸成分的含量測定提供參考依據(jù)。