何秀玲，譚金華，宋天云，唐霞，夏小容，溫預(yù)關(guān)（.暨南大學(xué)附屬江門中醫(yī)院Ⅰ期臨床研究中心，廣東 江門 529000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 50370）

利培酮（risperidone）作為精神分裂癥的一線治療藥物，具有較強(qiáng)的中樞5-羥色胺（5-HT）和多巴胺（D2）受體拮抗作用，口服吸收快，椎體外系不良反應(yīng)發(fā)生率較低[1]，被臨床廣泛使用。帕利哌酮是利培酮經(jīng)細(xì)胞色素P450（CYP）同工酶代謝后的活性產(chǎn)物，有研究表明CYP2D6是利培酮最主要的代謝酶，其代謝表型分為超強(qiáng)代謝型、強(qiáng)代謝型和弱代謝型，利培酮在不同的代謝表型人群中的藥動學(xué)參數(shù)有差異[2-3]。德國神經(jīng)精神藥理學(xué)與精神病藥理學(xué)會推薦在使用利培酮、帕利哌酮等藥物治療時(shí)進(jìn)行藥物濃度監(jiān)測[4]，制訂個(gè)體化給藥方案，以期提高藥物治療療效和安全性。目前國內(nèi)采用HPLC-MS/MS法測定人血漿中利培酮和帕利哌酮的報(bào)道較少，現(xiàn)有的研究方法存在樣品前處理復(fù)雜、分析時(shí)間較長、基質(zhì)效應(yīng)明顯、定量限過高等不足[5-6]。為此，本研究在已有文獻(xiàn)[7-9]的基礎(chǔ)上，采用穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)，建立同時(shí)測定人血漿中利培酮和帕利哌酮的方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-30AD高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜儀Triple Quad TM 5500（日本島津公司）和Applied Biosystems/（Sciex公司）；XW-80A型旋渦混合器（原上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；BP110S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；LC-456R型低速冷凍離心機(jī)（安徽中佳科學(xué)儀器有限公司）；100～1000 μL手動移液器（Thermo公司）。

1.2 試藥

利培酮對照品（批號：20180918，純度：99.9%，中國食品藥品檢定研究院）；帕利哌酮對照品（批號：20181015，純度：99.6%，USP）；內(nèi)標(biāo)：利培酮-d4（批號：20190220）、帕利哌酮-d4（批號：20190324）（TPC公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merk公司）；甲酸（色譜純，Adamas公司）；醋酸銨、英脫利匹特-20%（Sigma公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Atlantis T3（2.1 mm×50.0 mm，5.0 μm），預(yù)柱型號：Security Guard Cartridges C18（4 mm×2.0 mm，Phenomenex）；流動相A為含0.1%甲醇和5.00 mmol·L－1醋酸銨的水溶液，B為含0.1%甲醇的乙腈，梯度洗脫（0～3 min，22%B，3.0～3.1 min，22%～90%B；3.1～3.6 min，90%B；3.6～3.7 min，90%～22%B；3.7～5.0 min，22%B）；流速為 0.4 mL·min－1。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓（IS）為4000 V，渦旋離子噴霧溫度為550℃，氣簾氣（Cur）為35 psi（1 psi＝6.895 kPa），霧化氣（Gas1）為50 psi，輔助加熱氣（Gas2）為50 psi，碰撞氣（CAD）為9 Unit，正離子多離子反應(yīng)檢測（MRM）。利培酮和帕利哌酮的定量離子對分別為m/z411.2→191.1和m/z427.0→207.0，去簇電壓（DP）分別為95 V、100 V，入口電壓（EP）均為10 V，碰撞能（CE）分別為39 V、35 V，內(nèi)標(biāo)利培酮-d4定量離子對為m/z415.2→195.1，帕利哌酮-d4定量離子對為m/z431.2→211.1。其二級質(zhì)譜子離子掃描見圖1。

圖1 利培酮（A）、帕利哌酮（B）、利培酮-d4（C）和帕利哌酮-d4（D）的二級質(zhì)譜子離子掃描圖Fig 1 Secondary mass spectrum product ion scan of risperidone（A），paliperidone（B），risperidone-d4（C）and paliperidone-d4（D）

2.3 對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 用甲醇溶解利培酮和帕利哌酮對照品，得到0.500 mg·mL－1的對照品儲備液。儲備液存于透明玻璃瓶，在－20℃條件下長期保存。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 用甲醇溶解利培酮-d4對照品（2.5 mg/支）和帕利哌酮-d4對照品（1 mg/支），得到2.00 mg·mL－1的利培酮-d4儲備液和1.00 mg·mL－1的帕利哌酮-d4儲備液。儲備液存于透明玻璃瓶，在－20℃條件下長期保存。

2.4 血漿樣品處理

取50.0 μL的血漿樣品加入預(yù)先加了內(nèi)標(biāo)工作溶液50.0 μL的96孔板，將96孔板振搖約1 min，再加入200 μL的甲醇，振搖約10 min，室溫條件下4000 r·min－1離心10 min，取100 μL上清液轉(zhuǎn)移至干凈的96孔板中，用200 μL超純水稀釋，將96孔板充分振搖10 min后置于自動進(jìn)樣器進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專屬性 取來自不同健康者的空白血漿6份，其中3份加入0.500 mg·mL－1的儲備液和內(nèi)標(biāo)溶液，其中3份不做處理，除不加內(nèi)標(biāo)按“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行分析，得色譜圖2A、B；取服用利培酮?jiǎng)┝? mg患者的血漿樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行分析，得色譜圖2C。利培酮和利培酮-d4的保留時(shí)間約為1.9 min，帕利哌酮和帕利哌酮-d4的保留時(shí)間約為1.4 min。在分析物和內(nèi)標(biāo)相應(yīng)保留時(shí)間的地方，無干擾峰出現(xiàn)。血漿中無內(nèi)源性物質(zhì)干擾測定，專屬性強(qiáng)。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限 將“2.3”項(xiàng)下配制好的溶液分別加入到空白血漿中制備成質(zhì)量濃度為利培酮0.0500（LLOQ）、0.100、0.500、1.00、3.00、5.00、15.0、30.0 ng·mL－1；帕利哌酮0.0500（LLOQ）、0.100、0.500、1.00、3.00、5.00、10.0、15.0 ng·mL－1的溶液。按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，以分析物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，分析物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（W＝1/χ2）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得利培酮回歸方程：y＝0.9121x＋0.001 274（r＝0.9985），定量限為0.05 ng·mL－1，在0.05～30 ng·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好；帕利哌酮回歸方程：y＝0.9495x＋0.015 92（r＝0.9983），定量限為0.05 ng·mL－1，在0.05～15 ng·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5.3 回收率及精密度試驗(yàn) 將定量限、低、中和高質(zhì)量濃度質(zhì)控工作溶液各6份分別與空白血漿渦旋混勻，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，連續(xù)測定3批，計(jì)算批內(nèi)、批間的準(zhǔn)確度與精密度。同法以空白血漿、除不加標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和內(nèi)標(biāo)外，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的利培酮和帕利哌酮，以0.2 mL流動相溶解，離心后取2 μL進(jìn)樣，以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率，結(jié)果見表1。

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng) 收集6個(gè)不同來源的空白人血漿，各取0.1 mL空白血漿，加入低、中、高質(zhì)量濃度的工作液5 μL和內(nèi)標(biāo)20 μL，混勻，每個(gè)濃度平行制備3份。通過計(jì)算基質(zhì)存在下的峰面積（由空白人血漿提取后加入待測物和內(nèi)標(biāo)測得），與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積（待測物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤海┍戎?，?jì)算每一待測物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子。進(jìn)一步通過待測物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。結(jié)果利培酮低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平的內(nèi)標(biāo)歸一化因子的RSD在1.7%～4.5%，帕利哌酮在2.0%～5.2%，基質(zhì)效應(yīng)對濃度測定的干擾極小，可忽略不計(jì)。

2.5.5 溶血效應(yīng)和高脂效應(yīng) 將2%的冷凍后全血加入空白基質(zhì)中得到溶血基質(zhì)，將一定比例的脂肪乳（脂含量為20 mg·mL－1）加入空白基質(zhì)中得到高脂基質(zhì)，用溶血血漿和高脂血漿分別配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品（每個(gè)濃度水平3個(gè)重復(fù)），處理后進(jìn)樣分析。結(jié)果利培酮溶血質(zhì)控樣品平均測定值與其理論值的偏差在1.12%～4.44%，帕利哌酮在2.52%～4.81%，認(rèn)為在質(zhì)量濃度測定時(shí)溶血和高脂的影響可以忽略不計(jì)。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別制備低、中、高3種質(zhì)量濃度利培酮和帕里哌酮血漿樣品，考察分別經(jīng)過室溫放置16 h、－70℃凍融5次和－70℃凍存61 d處理后血漿樣品的穩(wěn)定性。得到利培酮和帕里哌酮血漿樣品的準(zhǔn)確度均在±15%，穩(wěn)定性符合相關(guān)要求，結(jié)果見表2。

表2 血漿中帕利哌酮和利培酮的穩(wěn)定性(n＝6)Tab 2 Stability of paliperidone and risperidone in the plasma (n＝6)

2.6 質(zhì)控藥品的監(jiān)控

按“2.5.2”項(xiàng)下方法分別配制低、中、高3種質(zhì)量濃度血漿樣品，置－20℃凍存，備用，作為質(zhì)控樣品。制作隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測低、中、高3種質(zhì)量濃度雙份質(zhì)控樣品，如果相對回收率均在85%～115%（低濃度可在80%～120%），即可認(rèn)為儀器檢測正常，否則須檢查整個(gè)操作過程以及儀器原因。本文的結(jié)果符合相關(guān)要求。

2.7 藥動學(xué)應(yīng)用

6名健康受試者，男女各半，體質(zhì)量（54.33±7.76）kg，年齡（30.33±7.06）歲，身高（168.08±7.09）cm。試驗(yàn)采用2周期的二重2×2拉丁方自身對照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，6例受試者口服劑量均為2 mg，清洗期14 d。受試者于前一晚開始禁食至少10 h，給藥前抽取空白血樣4 mL，單次給藥用200 mL溫水送服，給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、48、72、96 h分別采集靜脈血4 mL，裝入肝素鈉試管，3000 r·min－1離心10 min后，分離血漿，置－70℃儲藏備用，測定后計(jì)算得主要藥動學(xué)參數(shù)見表3。

表3 6名健康受試者口服利培酮2 mg后的主要藥動學(xué)參數(shù)(±s)Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of 6 healthy subjects after the oral administration of 2 mg risperidone (±s)

表3 6名健康受試者口服利培酮2 mg后的主要藥動學(xué)參數(shù)(±s)Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of 6 healthy subjects after the oral administration of 2 mg risperidone (±s)

藥動學(xué)參數(shù)利培酮帕利哌酮Cmax /（ng·mL－1）15.74±7.1111.80±3.55 tmax / h 1.1±0.4 4.5±3.2 t1/2 / h 3.67±1.5620.54±2.65 AUC（0～48）/（h·ng·mL－1） 79.56±46.23311.22±78.96 AUC（0～∞）/（h·ng·mL－1） 80.66±60.36325.55±86.23

3 討論

本研究曾選用ESI-MS，參照文獻(xiàn)[2]采用甲醇直接沉淀蛋白的方法處理血樣，但是方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)存在一定的基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)主要是由血漿內(nèi)源性極性物質(zhì)引起，在高比例有機(jī)相等度洗脫時(shí)，內(nèi)源性物質(zhì)和藥物出峰時(shí)間較近，基質(zhì)效應(yīng)較為明顯[10]。而在梯度洗脫方法研究中，首先采用較低比例的有機(jī)相沖洗，讓極性物質(zhì)先流出色譜柱，保證了極性物質(zhì)和藥物先后流出，大大降低了基質(zhì)效應(yīng)。此外梯度洗脫縮短了分析時(shí)間，同時(shí)壓縮了色譜峰，使得色譜峰尖銳，提高了檢測靈敏度。基質(zhì)效應(yīng)的消除方法中，使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)是一個(gè)快速而有效的辦法[7-9]。本研究選用穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)同位素純度均在99%以上，選擇合適的內(nèi)標(biāo)濃度，可對整個(gè)分析環(huán)節(jié)帶來的誤差進(jìn)行有效控制，結(jié)果表明內(nèi)標(biāo)與分析物直接的交叉信號響應(yīng)值低。與已有文獻(xiàn)相比[1-3]，本研究增加了對高脂效應(yīng)和溶血效應(yīng)的考察，結(jié)果兩者均不影響濃度的測定，消除了藥物臨床試驗(yàn)中高脂餐和溶血效應(yīng)對分析檢測的干擾。本研究中利培酮和帕利哌酮LLOQ均為0.05 ng·mL－1，與已有文獻(xiàn)[11]相比，方法靈敏度更高，能滿足臨床血藥濃度檢測和藥動學(xué)研究。

帕利哌酮是利培酮在體內(nèi)經(jīng)CYP2D6和CYP3A酶轉(zhuǎn)化生成的代謝物[12]。有研究表明AUC的個(gè)體[2-3]差異大與CYP2D6和ABCB1的基因多態(tài)性有關(guān)。本研究中利培酮和帕利哌酮的藥動學(xué)參數(shù)AUC的標(biāo)準(zhǔn)差較大，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，為后續(xù)研究提供依據(jù)。