吳文強(qiáng)，夏宸渝，謝鑫炎，李航，王嬌嬌，劉婷，屈健，黃松，魯瓊*（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 50006；.株洲人民醫(yī)院藥劑科，湖南 株洲 000；.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，長沙 00；.長沙市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，長沙 000）

衰老相關(guān)性骨質(zhì)疏松是老年人中常見的代謝性疾病，以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為主要特征[1-2]。隨著人口老齡化，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率日趨升高，嚴(yán)重危害人們的健康。衰老相關(guān)性骨質(zhì)疏松以骨形成減少為主[3]，而臨床治療效果欠佳，如何促進(jìn)骨形成亟待解決。目前治療骨質(zhì)疏松的一線藥物如雙膦酸鹽類等，主要針對(duì)骨吸收增多所致的骨質(zhì)疏松，而對(duì)骨形成減少所致的衰老相關(guān)性骨質(zhì)疏松療效欠佳[4-5]。而目前臨床應(yīng)用的促進(jìn)骨形成的藥物僅有特立帕肽，但因其長期使用會(huì)增加骨腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，因此推薦使用不超過2年[6]。為此，尋找安全有效的促骨形成藥物對(duì)于衰老相關(guān)性骨質(zhì)疏松的治療至關(guān)重要。

姜黃素是從姜黃中提取得到的一種多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種藥理活性[7-10]，對(duì)骨質(zhì)疏松治療具有潛在作用[11-13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合阿侖膦酸鹽可以改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女的骨密度[14]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等[15]，成人隨著年齡的增長，BMSCs的成骨分化潛能下降，導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化數(shù)量減少，骨形成能力下降，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生[3，16]。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以促進(jìn)體外BMSCs成骨分化[17]，而在體內(nèi)的研究卻不多見，因此，本研究著重于姜黃素在體內(nèi)對(duì)衰老相關(guān)性骨質(zhì)疏松中骨代謝平衡的影響。

1 材料

1.1 試藥

姜黃素（批號(hào)：SLBN7214V，純度≥65%，美國Sigma公司），橄欖油（批號(hào)：H28J10P91601，上海源葉生物科技有限公司），二甲基亞砜（DMSO）（廣州捷倍斯生物科技有限公司），胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基（美國Biological Industries公司），茜素紅S染液（賽業(yè)生物科技有限公司），抗壞血酸、地塞米松、β-甘油磷酸、H＆E染色試劑、TRAP染色試劑（美國Sigma公司），MTT試劑盒（碧云天公司），Liberase DL消化酶（瑞士Roche公司）。

1.2 儀器

mircoCT儀（Skyscan 1172，德國Bruker公司），石蠟切片機(jī)（microm HM325）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司），酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只健康的C57BL/6雄性小鼠，12月齡，質(zhì)量為27～33 g；4只7日齡的C57BL/6小鼠[上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2015-0017]。所有動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)方案由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.1.1 原代BMSCs提取[18]取4只7日齡的小鼠股骨和脛骨，置于Liberase DL消化酶中，在37℃恒溫水浴鍋中消化。通過冷凍離心獲得細(xì)胞懸液，補(bǔ)充1 mL完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U·mL－1青霉素、100 μg·mL－1鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基）。將細(xì)胞液種于培養(yǎng)皿中，每隔一日更換培養(yǎng)基，通過抗CD11b磁珠清除CD11b陽性的細(xì)胞，獲得原代BMSCs。BMSCs培養(yǎng)條件為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱，2～3 d傳代一次。

2.1.2 MTT檢測細(xì)胞活性 細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，消化離心，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞接種在96孔板中，每孔大約2000個(gè)細(xì)胞，按照說明書方法，在培養(yǎng)箱孵育24 h后，用含有姜黃素的新鮮培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基，孵育一段時(shí)間。然后在每孔中加入10 μL MTT液，再孵育4 h，最后加入100 μL DMSO溶解甲臜，當(dāng)結(jié)晶完全溶解后在570 nm處測量吸光度。

2.1.3 成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 取生長良好的BMSCs，接種于6孔板。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到40%～50%時(shí)，吸棄完全培養(yǎng)基，加入2 mL成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基[含有不同濃度的姜黃素（0、1、2 μmol·L－1）＋0.05 mmol·L－1抗壞血酸＋0.1 nmol·L－1地塞米松＋10 mmol·L－1β-甘油磷酸＋10%胎牛血清＋100 U·mL－1青霉素＋100 μg·mL－1鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基]。每隔3 d更換新鮮的成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。誘導(dǎo)17 d后用2%茜素紅S（pH＝4.2）染色。在顯微鏡下觀察礦化情況并拍照記錄。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 動(dòng)物分組和給藥方法 將C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、姜黃素組（50、100 mg·kg－1，用橄欖油溶解），每組8只，對(duì)照組灌胃橄欖油，實(shí)驗(yàn)組灌胃姜黃素，每日灌胃給藥，連續(xù)給藥3個(gè)月。

2.2.2 顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（microCT）給藥3個(gè)月后，取小鼠股骨，用4%多聚甲醛固定24 h，然后使用microCT儀進(jìn)行掃描。采用股骨遠(yuǎn)端的橫斷面圖像進(jìn)行股骨的三維組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。在股骨遠(yuǎn)端，選擇距生長板下方、股骨長度5%的區(qū)域作為分析的區(qū)域，用來確定單位組織體積中的骨小梁體積（BV/TV）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）。

2.2.3 蘇木精-伊紅（HE）染色 持續(xù)給藥3個(gè)月后，取小鼠股骨，用10%福爾馬林固定24 h，然后用10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣14 d，用石蠟包埋，切成厚度為4 μm的骨切片。切片采用二甲苯脫蠟與梯度乙醇脫水，蘇木精染色5 min，水沖洗，伊紅染色3 min，再次用水沖洗，乙醇進(jìn)行脫水后自然晾干，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察骨組織變化并拍照用來定量脂肪細(xì)胞。

2.2.4 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色 取小鼠股骨，用10%福爾馬林固定24 h，脫鈣包埋，切成厚度為4 μm的骨切片。梯度脫水后，TRAP染液37℃孵育1 h，然后加入0.02%苯酚磷酸鹽緩沖液，孵育1 h。結(jié)束后，加入按照1∶1體積配制的4%亞硝酸鈉溶液和5%副品紅溶液中，常溫反應(yīng)20～30 min，然后流水沖洗，固定組織后完成TRAP染色，于顯微鏡下觀察骨組織變化并拍照定量破骨細(xì)胞。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用雙尾的Student’st檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 姜黃素對(duì)BMSCs成骨分化的影響

MTT實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，1 μmol·L－1姜黃素組的細(xì)胞存活率為（103.10±17.14）%，2 μmol·L－1姜黃素組的細(xì)胞存活率為（106.38±19.26）%，姜黃素對(duì)BMSCs活性沒有影響（P＞0.05）。茜素紅染色結(jié)果見圖1，與對(duì)照組相比，姜黃素組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多，顯示姜黃素對(duì)BMSCs有明顯的促成骨作用。

圖1 姜黃素對(duì)BMSCs成骨分化的影響（茜素紅染色）Fig 1 Effect of curcumin on the osteogenic differentiation of BMSCs（alizarin red staining）

3.2 姜黃素對(duì)老年小鼠骨形成的影響

microCT掃描結(jié)果顯示姜黃素可促進(jìn)老年小鼠股骨的骨形成，見圖2。采用CTan軟件計(jì)算骨小梁參數(shù)，結(jié)果顯示姜黃素使骨小梁的體積變大、數(shù)量變多、厚度變厚，骨小梁的分離度降低，見表1。說明姜黃素可以促進(jìn)老年小鼠股骨的骨形成。

圖2 姜黃素對(duì)股骨形態(tài)的影響（microCT）Fig 2 Effect of curcumin on the femoral morphology（microCT）

表1 姜黃素對(duì)股骨骨小梁的影響Tab 1 Effect of curcumin on femoral trabecular bone

3.3 姜黃素對(duì)老年小鼠骨組織的影響

HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，姜黃素各劑量組骨組織增加，通過Image J 軟件計(jì)數(shù)脂肪細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)姜黃素可以使骨組織中每平方毫米的脂肪細(xì)胞數(shù)目（No.adipocytes/T.Ar）顯著減少（P＜0.01），提示姜黃素可以緩解老年小鼠的骨質(zhì)疏松癥狀，見圖3。

圖3 姜黃素對(duì)骨組織形態(tài)學(xué)的影響（HE染色，100×）Fig 3 Effect of curcumin on bone morphology（HE staining，100×）

3.4 姜黃素對(duì)老年小鼠破骨細(xì)胞的影響

TRAP染色見圖4。與對(duì)照組相比，姜黃素各劑量組可以顯著減少骨表面的破骨細(xì)胞數(shù)（Oc.N/BS）（P＜0.05，P＜0.01），說明姜黃素也影響小鼠破骨細(xì)胞的生成。

圖4 姜黃素對(duì)破骨細(xì)胞的影響（TRAP染色，100×）Fig 4 Effect of curcumin on osteoclasts（TRAP staining，100×）

4 討論

隨著我國老齡人口占社會(huì)總?cè)丝诘谋壤饾u增大，與年齡相關(guān)的老年性骨質(zhì)疏松成為重要的社會(huì)健康話題，尋找安全有效的藥物來治療老年性骨質(zhì)疏松亟待解決。骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)里屬于“骨痿”的范疇，主要病因是脾腎虛引起的氣血運(yùn)行不暢、出現(xiàn)血瘀，可以采用補(bǔ)腎壯骨、健脾益氣、活血通絡(luò)的方法進(jìn)行治療[19]。姜黃是來自姜科植物姜黃Curcuma longaL.的干燥根莖，具有破血行氣、通經(jīng)止痛的功效，對(duì)骨質(zhì)疏松具有潛在的療效[20]。姜黃素是姜黃的主要成分，在體外具有促進(jìn)成骨細(xì)胞生成[17，21]、抑制破骨細(xì)胞生成[22-23]的能力。姜黃作為藥食兩用的中藥，其安全性較好，可以長期應(yīng)用[7，24-25]。

4.1 骨質(zhì)疏松模型的應(yīng)用

常見的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型主要有絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型和老年性骨質(zhì)疏松模型，其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型是通過對(duì)雌鼠進(jìn)行去卵巢手術(shù)而制備的[26-28]；構(gòu)建老年性骨質(zhì)疏松模型的方法包括快速老化性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型[29]、D-半乳糖誘導(dǎo)引起的衰老性骨質(zhì)疏松模[30]和自然衰老導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松模型[31]。目前姜黃素的研究較多側(cè)重于對(duì)去卵巢大鼠的骨質(zhì)影響[12，32]，而缺乏對(duì)于衰老相關(guān)的骨質(zhì)疏松體內(nèi)研究。由于BMSCs的成骨分化能力下降是發(fā)生老年性骨質(zhì)疏松的重要原因[33]，本課題通過體外姜黃素干預(yù)BMSCs初步證實(shí)了姜黃素對(duì)老年性骨質(zhì)疏松的潛在作用；在體內(nèi)研究中，本研究通過自然衰老制備骨質(zhì)疏松模型，研究姜黃素對(duì)老年性骨質(zhì)疏松的作用。

4.2 姜黃素可以促進(jìn)骨形成

骨質(zhì)疏松早期沒有明顯的臨床特征，很容易使患者錯(cuò)過最佳的治療時(shí)機(jī)，而骨小梁數(shù)目、厚度等指標(biāo)可以反應(yīng)骨質(zhì)疏松早期的骨流失[34]，因此對(duì)骨小梁的觀察研究是防治骨質(zhì)疏松是一種較好的手段。目前廣泛應(yīng)用于觀察骨小梁結(jié)構(gòu)的技術(shù)是microCT，它可通過三維圖像重建骨小梁結(jié)構(gòu)[35]，適用于骨質(zhì)疏松的研究[36]。本研究通過microCT分析姜黃素對(duì)老年小鼠骨小梁的影響。與對(duì)照組相比，姜黃素組小鼠的骨小梁結(jié)構(gòu)有所改善，這與姜黃素在其他骨質(zhì)疏松模型的研究結(jié)論一致[12，37]，說明姜黃素確有改善骨質(zhì)疏松癥狀的作用。為了進(jìn)一步觀察骨組織形態(tài)，本研究進(jìn)行了H＆E染色，發(fā)現(xiàn)姜黃素可以增加骨組織、減少骨髓脂肪細(xì)胞的數(shù)量，表明了姜黃素可能對(duì)由年齡引起的骨質(zhì)流失具有顯著的保護(hù)作用，而目前多數(shù)臨床用于骨質(zhì)疏松的藥物只影響骨吸收能力[4-5]，說明姜黃素具有治療老年性骨質(zhì)疏松的潛力。

4.3 姜黃素可以抑制骨吸收

在骨骼發(fā)生發(fā)展過程中，破骨細(xì)胞也起著重要作用，當(dāng)破骨細(xì)胞數(shù)目較多時(shí)，也會(huì)引起骨質(zhì)疏松[38]。為了觀察姜黃素對(duì)老年小鼠破骨細(xì)胞的影響，本研究進(jìn)行了TRAP染色，研究結(jié)果與體外研究一致[39]，姜黃素能夠減少破骨細(xì)胞的數(shù)目，且在體內(nèi)研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論[40]。姜黃素不僅會(huì)影響老年性骨質(zhì)疏松的骨吸收進(jìn)程，還會(huì)影響其他類型骨質(zhì)疏松的骨吸收過程，提示其可以應(yīng)用于不同類型的骨質(zhì)疏松治療。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素既可促進(jìn)老年小鼠的骨形成，還能抑制其骨吸收，同時(shí)在其他骨質(zhì)疏松模型中發(fā)現(xiàn)姜黃素可以減少破骨細(xì)胞的數(shù)目，說明姜黃素有應(yīng)用于不同類型骨質(zhì)疏松治療的潛能，但具體的作用機(jī)制尚未明確，未來可以研究姜黃素在骨形成和骨吸收方面的作用機(jī)制，并依據(jù)機(jī)制研究結(jié)論制備合適的劑型，在提高姜黃素生物利用度的同時(shí)使其適用于不同類型的骨質(zhì)疏松，為骨質(zhì)疏松提供新的治療藥物。