周雅婷，羅志強，張彬彬，王武斌，孫睿，于國華*，史淵源，2*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 02488；2.深圳北京中醫(yī)藥大學(xué)研究院，深圳 588）

肝癌是全球癌癥診出率排第六的癌癥，西醫(yī)療法是治療肝癌的主要策略（如手術(shù)切除、肝移植、射頻、化療和靶向分子治療），但肝癌患者的一般預(yù)后仍然不佳[1]。中醫(yī)學(xué)認為，癌癥由痰濁、氣滯、血瘀等病理產(chǎn)物與乖戾之氣相合，郁積化為癌毒，邪盛正虛所致。臨床治法強調(diào)肝脾同調(diào)，療效肯定[2]。白芍在中醫(yī)理論中歸肝經(jīng)，具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗等功效，其靶器官很可能在肝臟。實驗研究表明白芍有抑制腫瘤生長[3]、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥[4]、影響肝癌預(yù)后[5]、抑制細胞遷移和侵襲[6]等作用。但相關(guān)研究多集中于中藥復(fù)方或者單味中藥，中藥藥物成分復(fù)雜，有多靶點多通路作用的特點，對獨立藥物成分抗腫瘤作用的研究可以有助于更好地解釋藥物作用的分子機制、指導(dǎo)臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)。本研究選取肝癌治療常用藥白芍[7]的主要化學(xué)成分——芍藥內(nèi)酯苷[8]進行體外實驗及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，進一步探索其抗肝癌作用的生物學(xué)機制，為臨床用藥及新藥研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 試藥及細胞

芍藥內(nèi)酯苷（賽譜銳思科技有限公司，貨號：B21149-20 mg）；CCK8試劑盒（北京蘭博利德商貿(mào)有限公司，貨號：ceb044hu）；Gibco澳洲胎牛血清（FBS，英濰捷基貿(mào)易有限公司，貨號：10099141C）；Corning-Cellgro RMPI 1640培養(yǎng)基（貨號：10-040-CVR）、Corning-Cellgro 0.25%EDTA胰蛋白酶（貨號：25-053-CI）（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）；Gibco青鏈霉素雙抗（P/S，北京歐北生物科技有限公司，貨號：15140122）；PBS干粉（北京百諾威生物科技有限公司，貨號：p1010）；Qiagen RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，貨號：74104）；Illumina TruSeqTM RNA sample preparation Kit（貨號：RS-122-2001）、Invitrogen SuperScript double-stranded cDNA synthesis Kit（貨號：11917020）（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。HepG2細胞系（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院）。

1.2 儀器

光學(xué)普通倒置顯微鏡（日本Olympus CKX53）；光學(xué)正倒置一體顯微鏡（日本ECHO RVL-100）；CO2恒溫培養(yǎng)箱160i（美國Thermo Scientific）；酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices SpectraMax i3X）；紫外分光光度計（美國Thermo NanoDrop One）；高通量測序平臺（美國Illumina Novaseq 6000）；電泳儀（中國六一DYCP-32B）；生物芯片分析儀（美國Agilent 2100）。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 不同濃度芍藥內(nèi)酯苷溶液 取芍藥內(nèi)酯苷樣品 5 mg，用RPMI 1640細胞培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗）溶解，渦旋5 min，逐步稀釋成濃度為50、100、250、500、1000、1500、2000、5000 μmol·L－1的溶液。

2.1.2 0.1%結(jié)晶紫溶液 稱取適量結(jié)晶紫，用無水乙醇溶解配制成濃度為0.5%的結(jié)晶紫母液。以1∶4比例用PBS將其稀釋成0.1%的結(jié)晶紫溶液，用以細胞侵襲實驗染色。

2.2 細胞培養(yǎng)

HepG2細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每1～2日傳代一次，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.3 CCK8法檢測細胞活性

取對數(shù)生長期HepG2細胞進行消化計數(shù)，將細胞濃度調(diào)整為約4×104個·mL－1，以每孔180 μL分別接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入20 μL各濃度芍藥內(nèi)酯苷溶液[終濃度為5、10、25、50、100、150、200 μmol·L－1]，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK8，孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，計算細胞存活率。以不加藥的細胞為對照。細胞存活率（%）＝OD樣品/OD對照×100%。

2.4 細胞侵襲實驗

用無血清的預(yù)冷細胞培養(yǎng)基稀釋matrigel基質(zhì)膠，至濃度為250 μg·mL－1。將150 μL稀釋膠加入到transwell上室中。37℃條件下孵育2～4 h后去除未結(jié)合的matrigel基質(zhì)膠。饑餓細胞12～24 h后消化離心收集細胞沉淀，PBS清洗1～2遍，用適量芍藥內(nèi)酯苷溶液（終濃度為200 μmol·L－1）或培養(yǎng)基（對照）重懸，調(diào)整細胞濃度至2×105個·mL－1。取細胞懸液200 μL加入transwell小室，下室加入含血清的培養(yǎng)基500 μL。放入培養(yǎng)箱37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后染色拍照計數(shù)。

2.5 總RNA提取

將細胞分成對照組（C組）和500 μmol·L－1芍藥內(nèi)酯苷給藥組（ALB組）兩個組，每組3個復(fù)孔。將細胞懸液鋪進12孔板中，7200個/孔，培養(yǎng)24 h后，去除上層培養(yǎng)基，對照組加入培養(yǎng)基200 μL，給藥組加入含終濃度為500 μmol·L－1的芍藥內(nèi)酯苷培養(yǎng)基溶液200 μL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。加200 μL 0.25% EDTA胰蛋白酶將12孔板中的細胞消化1 min后終止消化，1000 r·min－1離心，棄去上清液，用PBS清洗細胞。按RNeasy Mini Kit說明書提取總RNA，測定RNA濃度和OD260/OD280比值后備用。

2.6 轉(zhuǎn)錄組測序

真核mRNA測序使用基于第二代測序技術(shù)的Illumina Novaseq 6000測序平臺，對真核生物特定組織或細胞在某個時期轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA進行測序，測序?qū)嶒灢捎肐llumina TruSeqTM RNA sample prep Kit試劑盒進行文庫構(gòu)建。

2.7 測序數(shù)據(jù)處理

運用SeqPrep（https：//github.com/jstjohn/SeqPrep）和Sickle（https：//github.com/najoshi/sickle）軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行過濾分析。將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)，即clean data（reads）與參考基因組進行比對，使用HISAT2（https：//daehwankimlab.github.io/hisat2/）[9]軟件進行序列比對分析。獲得用于后續(xù)分析的mapped data（reads），同時運用測序覆蓋度的指標(biāo)對本次測序的比對結(jié)果進行質(zhì)量評估。使用軟件StringTie（http：//ccb.jhu.edu/software/stringtie/）[10]將mapped reads進行組裝拼接，與已知轉(zhuǎn)錄本進行比較，獲得沒有注釋信息的轉(zhuǎn)錄本，并對其中潛在的新轉(zhuǎn)錄本進行功能注釋?？偨Y(jié)它們注釋到GO、KEGG、EggCOG、NR、Swiss-Prot、Pfam常用的六大數(shù)據(jù)庫中的數(shù)量和百分比。使用RSEM[11]軟件分別對基因/轉(zhuǎn)錄本的表達水平進行定量分析，獲得每個樣本基因/轉(zhuǎn)錄本的Read Counts。然后對其進行FPKM或TPM轉(zhuǎn)換，進而得到標(biāo)準(zhǔn)化的基因/轉(zhuǎn)錄本表達水平。獲得基因/轉(zhuǎn)錄本的Read Counts數(shù)后，運用DESeq2[12]多樣本（≥ 2）項目進行樣本間基因/轉(zhuǎn)錄本的表達差異分析，設(shè)定閾值差異倍數(shù)Fold-change ≥ 2，P-value＜0.05篩選差異基因，通過Goatools[13]和R語言編寫腳本分析對差異基因集進行聚類分析，GO功能分析，KEGG通路富集分析、基因表達差異分析。

3 結(jié)果

3.1 抗肝癌活性

芍藥內(nèi)酯苷抗肝癌活性結(jié)果見圖1。48 h后，HepG2細胞隨著芍藥內(nèi)酯苷濃度升高，存活率顯著下降，在200 μmol·L－1時，存活率只有54%，接近其IC50值。說明芍藥內(nèi)酯苷具有抑制肝癌細胞生長的效果。

圖1 芍藥內(nèi)酯苷對HepG2細胞的生長抑制作用（n＝3）Fig 1 Growth inhibitory effect of albiflorin on HepG2 cells（n＝3）

3.2 細胞侵襲實驗

如圖2所示，當(dāng)芍藥內(nèi)酯苷濃度為200 μmol·L－1時，具有顯著的抑制肝癌細胞侵襲的效果（P＜0.05）。說明抑制侵襲可能是芍藥內(nèi)酯苷發(fā)揮抗腫瘤作用的途徑之一。

圖2 芍藥內(nèi)酯苷對HepG2細胞侵襲抑制作用（n＝3）Fig 2 Inhibition of albiflorin on the invasion of HepG2 cells（n＝3）

3.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

對原始測序數(shù)據(jù)測序接頭序列、低質(zhì)量讀段等因素過濾后的質(zhì)控分析如表1所示。由表1可知，對原始數(shù)據(jù)低質(zhì)量的因素進行過濾后，所測樣本的Q30仍全部大于90%，說明樣本的測序質(zhì)量很高，可以用于序列比對分析。

表1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果分析表Tab 1 Analysis table of sequencing data quality control results

3.4 轉(zhuǎn)錄組表達分析

一般認為基因表達量（log10[TPM]）在1以上具有較好的表達效果。因此，我們設(shè)置表達量為1，經(jīng)篩選得到，ALB組表達14 167個基因，C組表達14 184個基因，經(jīng)韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)，交叉基因13 815個，單獨在ALB組表達的基因數(shù)是352個，單獨在C組表達的基因數(shù)是369個。

3.5 轉(zhuǎn)錄組差異分析

經(jīng)篩選，ALB組與空白C組相比，共得到340個差異表達基因，其中上調(diào)基因154個，下調(diào)基因186個，見圖3（橫坐標(biāo)為基因在兩個樣本間表達差異的倍數(shù)變化值的對數(shù)，縱坐標(biāo)為基因表達量變化差異的統(tǒng)計學(xué)檢驗值，即P值的對數(shù)。圖中每個點代表一個特定的基因，紅色點表示顯著上調(diào)的基因，綠色點表示顯著下調(diào)的基因，灰色點為非顯著差異基因）。通過對340個差異基因進行GO功能富集和KEGG功能富集，對差異基因的功能進行分類和關(guān)聯(lián)。篩選得到GO條目的前10個條目，包括富集到BP模塊的差異基因，主要涉及到半乳糖基神經(jīng)酰胺生物合成、IL13的細胞應(yīng)答和鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運等過程；富集到CC模塊的差異基因，主要涉及到核內(nèi)膜和核膜部分的組成；富集到MF模塊的差異基因，主要涉及到膽堿跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性。結(jié)果見表2。

圖3 差異基因火山圖Fig 3 Differences gene volcanic map

表2 GO功能富集結(jié)果Tab 2 Results of GO functional enrichment

KEGG功能富集分析篩選得到8條生物學(xué)通路，見圖4，包括色氨酸代謝通路、磷酸肌醇代謝通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、癌癥膽堿代謝通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)通路、鈣信號通路、炎癥介質(zhì)對色氨酸通道的調(diào)節(jié)通路、縫隙連接通路，主要集中在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝活動、神經(jīng)活性等方面。

圖4 KEGG功能富集的關(guān)鍵生物學(xué)通路Fig 4 Key biological pathways of KEGG functional enrichment

肝癌的發(fā)展過程一般呈現(xiàn)出四個階段，從炎癥反應(yīng)到脂肪變性到肝硬化再到肝細胞癌，在這個過程當(dāng)中，代謝功能出現(xiàn)了紊亂，尤其是脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)代謝的異常變化[14-15]。脂質(zhì)是細胞膜的主要組成部分，在腫瘤細胞的血管形成、細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中具有不容忽視的作用。蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生氨基酸，肝癌細胞對氨基酸的代謝是其能量的主要來源，對細胞的生長增殖具有重要意義。因此，癌癥膽堿代謝通路、磷酸肌醇代謝通路與色氨酸代謝通路在肝癌細胞的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)常常在肝病患者體內(nèi)活化增高，血管緊張素Ⅱ可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子形成，促進血管生成，推動腫瘤的基本發(fā)展過程，引起肝癌的發(fā)生和加劇[16]。

瞬時受體電位（transient receptor poential，TRP）通道，是廣泛存在的一種陽離子通道，可以與多種炎癥因子結(jié)合，激活TRP通道通透鈣離子（Ca2＋）等陽離子，活化鈣信號通路等陽離子信號通路，通過對陽離子濃度變化的調(diào)節(jié)進一步影響細胞內(nèi)相應(yīng)信號通路的傳遞、轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合，引起細胞功能特性的改變[17]。Ca2＋作為一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介，可以通過TRP通道的傳導(dǎo)，激活下游的生物學(xué)過程，促進肝癌細胞的增殖。

近年來，神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)遞質(zhì)在腫瘤微環(huán)境中的作用逐漸受到關(guān)注，研究表明其通過激活相應(yīng)的信號通路來刺激細胞生長或增加細胞的遷移活動[18]，提示了神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路在肝癌發(fā)展過程中的重要性。

研究發(fā)現(xiàn)，細胞縫隙連接與腫瘤的生長、增殖和變化關(guān)系密切[19]。在癌變初始階段，癌細胞與周圍正常細胞的細胞間隙連接功能被抑制，通信障礙導(dǎo)致細胞喪失接觸抑制而無限擴增，由此形成癌變[20]。趙增強等[21]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能增強 HepG2細胞間縫隙連接功能，重建HepG2細胞間通信，闡釋了該藥物治療肝癌的可能的作用機制之一，說明細胞縫隙連接在肝癌發(fā)生發(fā)展進程中發(fā)揮了重要作用。

芍藥內(nèi)酯苷對8條關(guān)鍵通路的調(diào)控集中于10個上調(diào)基因（GRM1、ADRB1、P2RX7、BDKRB1、REN、ASIC4、SLC22A2、AC002996.1、AC104662.2、AC092143.2），12個下調(diào)基因（TUBA8、PHKA2-AS1、CACNA1H、PLCG1-AS1、RHEBP1、SLC44A5、AANAT、AC135048.1、AL513325.1、AC027796.3、AC011603.2、AL355315.1），其中調(diào)控兩條以上關(guān)鍵通路的基因為BDKRB1（2條）、AC011603.2（2條）、TUBA8（2條）、ADRB1（3條）、GRM1（3條）、PLCG1-AS1（4條）。

4 討論

中藥對腫瘤的殺傷能力普遍弱于化學(xué)藥物，但中藥在提高患者免疫力，減輕放化療的毒副作用、減輕疼痛、防止癌細胞轉(zhuǎn)移等方面具有獨特的優(yōu)勢。因此，采用中藥配合放化療等主流療法來抗擊腫瘤，對于提高患者的生存質(zhì)量具有重要的意義[22]。本研究選取芍藥代表性成分芍藥內(nèi)酯苷來探討其抑制肝癌的作用效果，芍藥內(nèi)酯苷能有效抑制腫瘤生長和侵襲，在25 μmol·L－1時對HepG2的抑制率即達到30%，且已有動物實驗表明芍藥內(nèi)酯苷具有明確鎮(zhèn)痛作用[23-24]，可聯(lián)合化學(xué)藥物作為輔助用藥，降低化學(xué)藥物用藥劑量，減輕患者痛苦。

本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)探究了芍藥內(nèi)酯苷抗肝癌細胞的調(diào)控機制，獲得了芍藥內(nèi)酯苷調(diào)控的關(guān)鍵差異基因，并通過大數(shù)據(jù)通路富集等方法，進一步挖掘了其分子作用機制。GO功能中富集的差異基因，主要涉及到半乳糖基神經(jīng)酰胺生物合成、IL13的細胞應(yīng)答和鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運、核內(nèi)膜和核膜部分的組成、膽堿跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性。在KEGG功能分析中，主要集中在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝活動、神經(jīng)活性等方面。許多重要的細胞生命活動如細胞增殖、分化以及死亡均與信號傳導(dǎo)密不可分。代謝為細胞增殖遷移活動提供能量保障。KEGG富集通路中受調(diào)節(jié)的重要編碼區(qū)上調(diào)基因為BDKRB1、ADRB1、GRM1，下調(diào)基因為TUBA8。BDKRB1為緩激肽受體，BDKRB1上調(diào)可通過下游響應(yīng)促進PAK表達[25]，抑制MLCK降低肌球蛋白收縮，減少肝癌細胞遷移[26]；BDKRB1還可以通過調(diào)節(jié)鈣離子信號通路上調(diào)PKC同工酶表達，抑制腫瘤細胞侵襲[27]。TUBA8編碼α微管蛋白家族的成員，實驗表明TUBA8過表達增強HepG2細胞中的細胞遷移[28]。ADRB1、GRM1通過調(diào)節(jié)cAMP、Ca2＋濃度影響PKA、PKC，調(diào)控細胞縫隙連接，抑制肝癌細胞遷移和增殖[29-30]。因此，芍藥內(nèi)酯苷很可能是通過對上述相關(guān)通路及基因進行調(diào)控實現(xiàn)抑制HepG2細胞系的生長增殖與遷移。

綜上所述，芍藥內(nèi)酯苷對于減少化學(xué)藥物的給藥劑量以減輕其毒副作用，減輕患者癌性疼痛和減少癌細胞侵襲等具有“增效減毒”的可能。這一方面可為白芍的臨床應(yīng)用及生物學(xué)效應(yīng)機制提供部分理論支持；另一方面可為新藥研發(fā)提供指導(dǎo)。