楊 星，潘歆怡，郭燕嫻，李滿超，史亞男，張曉麗，梁曉燕

（中山大學附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東廣州510063）

肥胖已經成為一種全球性的流行病，全世界超過6億成年人為肥胖人群。中國人群肥胖率在過去的20年中顯著上升。肥胖相關的風險包括月經紊亂、子宮內膜病變、不孕癥及妊娠期并發(fā)癥。我們的既往研究提示在飲食誘導肥胖小鼠卵子-卵丘顆粒細胞復合物中，存在由于脂質囤積而誘發(fā)非折疊或錯誤折疊的新合成蛋白質在內質網中大量堆積，Ca2+平衡狀態(tài)打破，進而損傷內質網正常生理功能，產生應激狀態(tài)誘發(fā)卵子內凋亡信號的產生，降低肥胖小鼠卵子發(fā)育潛能［1］。盡管肥胖對女性生育力的不良影響已經得到了廣泛重視，但病理生理學研究及有效的治療策略仍未完全闡明。

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是女性無排卵性不孕最常見的原因之一，對月經周期、排卵率、妊娠率和活產率產生諸多負面影響［2］。PCOS婦女中約有38%～66%是肥胖者［3］，而脂肪細胞是機體重要的內分泌器官，通過分泌一系列生物活性物質，如脂聯素、瘦素、抵抗素和白細胞介素等，促進慢性亞急性炎癥反應狀態(tài)［4］。PCOS患者血循環(huán)中致病性炎癥調節(jié)因子顯著增加。我們的前期研究提示PCOS患者卵巢組織內顆粒細胞炎癥性細胞因子IL-1、IL-6及腫瘤壞死因子α（tumor necro‐sis factor-α，TNF-α）表達增加［5］，對應卵泡液內炎癥細胞因子含量增高。而這一類肥胖患者卵泡液又可以誘導卵子內的脂質囤積，內質網應激并進而引發(fā)凋亡比例的增加［1］。炎癥細胞通路是肥胖及卵巢功能異常重要的鏈接環(huán)節(jié)［6］。

肥胖對于包括卵子在內的諸多器官產生不利影響，但肥胖對子宮內膜影響的結論并不一致。進行供卵治療的肥胖女性胚胎著床率無差異，提示肥胖對子宮內膜容受性沒有負面影響［7］。然而肥胖小鼠的子宮內膜胚胎著床位點減少，內膜間質細胞對孕激素刺激的反應減弱，子宮內膜蛻膜化過程受損［8］。肥胖女性來源的原代內膜細胞培養(yǎng)中也表現出間質蛻膜化異常［8］。蛻膜化和植入缺陷可能會對胎盤的形成產生負面影響。許多肥胖婦女的妊娠并發(fā)癥都與胎盤功能障礙有關［9］。復發(fā)性流產患者胎兒染色體分析發(fā)現，肥胖女性具有顯著高的整倍體流產率再次表明肥胖是子宮內膜功能異常的潛在獨立影響因素［10］。

PCOS患者廣泛存在肥胖狀態(tài)，且合并高雄激素血癥及高胰島素血癥，PCOS人群中不良妊娠結局更為顯著。PCOS患者復雜的內分泌狀態(tài)是否會加重肥胖對內膜的不良影響？本研究擬通過對肥胖PCOS患者子宮內膜進行細胞脂毒性反應測定，明確肥胖PCOS患者內膜上皮脂質對于子宮內膜內質網穩(wěn)態(tài)的影響。

材料和方法

1 研究對象

本研究納入在中山大學附屬第六醫(yī)院生殖中心進行助孕治療的患者。年齡介于20～35歲擬行宮腔鏡檢查，其中包括符合鹿特丹標準的BMI≥25 kg/m2的PCOS患者37名（obese組），以及正常體重對照組患者（18 kg/m2≤BMI≤22 kg/m2）18名（moderate組）。對照組患者月經周期規(guī)則，正常卵巢儲備，由于盆腔輸卵管因素或男方因素接受體外受精-胚胎移植治療。PCOS患者行人工周期黃體酮轉換后第7日獲取內膜組織活檢標本；正常排卵患者選取排卵后7日黃體期內膜組織。本研究已通過中山大學附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學與產前診斷委員會審批，倫理編號為2019ZSLYEC-005S。

2 方法

2.1 油紅O染色 子宮內膜組織冰凍切片，蒸餾水浸洗洗掉包埋劑。60%異丙醇浸洗2 min，油紅O工作液染色2～5 min，60%異丙醇調色2 min，清水洗滌，蘇木精復染1 min，鹽酸乙醇分化2 s，流水反藍，甘油明膠封片。

2.2 RT-qPCR檢測子宮內膜組織中內質網應激相關分子的mRNA表達 使用RNeasy Micro Kit（Qia‐gen）提取顆粒細胞中的RNA。紫外分光光度計測定所提RNA濃度，逆轉錄為cDNA。使用特異性引物（Qiagen）測定內質網應激相關分子轉錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）及熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）的mRNA表達。于Rotor-GeneTM 6000（Corbett Research）進行gPCR反應。2?ΔΔCt方法定量分析mRNA的表達水平。

2.3 Western blot檢測子宮內膜組織中內質網應激相關蛋白 子宮內膜組織經RIPA裂解液冰浴研磨，離心后取上清液，BCA法測定胞漿總蛋白，SDSPAGE分離蛋白，電泳完成后轉印至硝酸纖維素薄膜上，脫脂奶粉常溫封閉1 h，TBST漂洗，隨后加入相應Ⅰ抗［蛋白激酶R樣內質網激酶（protein kinase Rlike endoplasmic reticulum kinase，PERK）、ATF4和CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT-enhancer binding protein homologous protein，CHOP）抗體］，4℃孵育過夜，TBST漂洗后加入HRP標記Ⅱ抗，常溫孵育1 h，TBST漂洗，暗室中加ECL超敏發(fā)光液，用ImageJ分析各條帶灰度值。

2.4 TUNEL染色 子宮內膜組織冰凍切片采用TUNEL檢測試劑盒（Roche）試劑盒進行操作：用二甲苯浸洗2次，每次5 min；用梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸洗1次，每次3 min；使用Pro‐teinase K工作液處理組織后使用PBS漂洗；加入50μL TUNEL反應混合液于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37℃反應1 h；PBS漂洗后在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞（激發(fā)光波長為450～500 nm，檢測波長為515～565 nm）。

Figure 1.The endometrial tissues of obesity PCOSwomen（BMI≥25 kg/m2）and moderate controls（ovulatory women with moderate weight，18 kg/m2≤BMI≤22 kg/m2）were stained with oil red Oat the implantation stage，and the lipid droplets in the endo‐metrial tissues were semi-quantitatively observed.The lipid content in the epithelium and stroma of endometrial tissues in obese patients was significantly higher than that in control group.The number and the size of lipid droplets in the endome‐trium increased significantly.The scale bar=50μm.圖1 兩組子宮內膜組織中脂滴含量的檢測結果

2.5 子宮內膜組織中凋亡信號DNA laddering檢測 子宮內膜組織低溫下將組織勻漿，加入抽提緩沖液，置于37℃水浴溫育1 h。加入0.2 mg/L蛋白酶K，50℃溫育至液體變得清亮，以等體積的飽和酚抽提3次。加無水乙醇和醋酸鈉沉淀DNA，溶于TE緩沖液。用分光光度計測量260 nm波長處的吸光度（A）值，計算DNA濃度。取10μg DNA于1.6%瓊脂糖凝膠中進行電泳，經溴化乙啶染色，紫外燈下觀察拍照。

3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數據采用均數±標準差（mean±SD）表示。組間均數比較使用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 油紅O染色結果

對肥胖PCOS患者及對照組患者種植期子宮內膜組織進行油紅O染色發(fā)現，內膜上皮及組織間質中，中性脂滴染色比例顯著增加，上皮中脂滴體積增大，數量有肉眼可見的增多，提示肥胖PCOS患者內膜組織中中性脂滴含量顯著高于正常體重對照組，肥胖者異常的代謝狀態(tài)直接影響到了胚胎種植的內膜環(huán)境中的脂質含量（圖1）。

2 內質網應激基因ATF4、GRP78及HSP70的mRNA表達情況

與對照組相比，肥胖PCOS患者黃體中期子宮內膜組織中ATF4的mRNA表達量顯著增加（P<0.05），GRP78及HSP70的mRNA表達量差異無統(tǒng)計學顯著性（圖2）。

3 內質網應激PERK通路中相關蛋白的表達情況

肥胖PCOS患者子宮內膜組織中內質網應激PERK通路中相關蛋白PERK及ATF4的蛋白表達量顯著增加（P<0.05），CHOP蛋白表達量在2組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性（圖3）。

4 細胞凋亡檢測結果

使用子宮內膜組織冰凍切片進行TUNEL染色之后熒光顯微鏡下計數其中凋亡信號，結果顯示，肥胖PCOS患者子宮內膜中的凋亡信號顯著高于對照組（P<0.01），見圖4。但在最終使用DNA laddering檢測凋亡條帶時，2組均未檢測到顯著標識的凋亡碎片條帶（圖5）。

Figure 2.The mRNA expression of endoplasmic reticulum stress-related molecules ATF4，GRP78 and HSP70 in the endometrium of obesity PCOSwomen（BMI≥25 kg/m2）and moderate controls（ovulatory women with moderate weight，18 kg/m2≤BMI≤22 kg/m2）was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=8.*P<0.05 vs moderate group.圖2 子宮內膜組織中內質網應激相關分子的mRNA表達

Figure 3.Western blot for determining the protein levels of PERK，ATF4 and CHOPin the endometrium from obesity PCOSwomen（BMI≥25 kg/m2）and moderate controls（ovulatory women with moderate weight，18 kg/m2≤BMI≤22 kg/m2）.Mean±SD.n=8.*P<0.05 vs moderate group.圖3 兩組子宮內膜組織中內質網應激相關蛋白檢測結果的比較

討 論

本研究所納入BMI大于25 kg/m2符合肥胖診斷標準的PCOS患者［11］，該群體具有最典型的血清代謝指標紊亂，高血清膽固醇和非酯化脂肪酸濃度，高血糖和胰島素抵抗［12］。異常血清代謝變化可反映在卵泡液中，卵泡液組成成分影響在體及體外培養(yǎng)的卵母細胞和卵丘顆粒細胞成熟過程及質量［13-14］。并伴隨著內質網應激PERK通路激活進而導致細胞凋亡信號產生［15］。因此在本研究中，我們進一步觀察了肥胖PCOS婦女異常的代謝狀態(tài)是否同樣反映在子宮內膜組織中，是否同樣激活內質網應激通路。結果提示肥胖組子宮內膜上皮及間質內具有典型的中性脂滴浸潤，脂滴體積增大，浸潤范圍廣；伴隨上皮組織中內質網應激相關分子ATF4表達增加，熒光TUNEL染色提示內皮細胞內凋亡信號增加，PERK及ATF4表達增加，但2組內膜組織中CHOP及細胞凋亡DNA碎片的差異無統(tǒng)計學顯著性，子宮腔內高脂狀態(tài)激發(fā)細胞脂毒性反應。

Figure 4.The apoptosis of endometrial cryosections fromobesity PCOSwomen（BMI≥25 kg/m2；a and b）and moderate controls（ovu‐latory women with moderate weight，18 kg/m2≤BMI≤22 kg/m2；c and d）was detected by TUNEL assay.The scale bar=75μm.Arrows inticate positive staining.Mean±SD.n=8.**P<0.01 vs moderate group.圖4 TUNEL染色及凋亡細胞計數

Figure 5.DNA ladder assay.Total DNA was isolated from endometrium of obesity PCOSwomen（BMI≥25 kg/m2；O）and moderate controls（ovulatory women with moderate weight，18 kg/m2≤BMI≤22 kg/m2；M）for DNA fragment assay.Neither of each group had detectable fragment band.n=8.圖5 子宮內膜組織中凋亡DNA碎片檢測

脂滴是細胞內以中性脂質形式儲存能量的細胞器，通過脂肪合成和脂肪動員分解動態(tài)調節(jié)細胞能量平衡，在能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用。這種自我平衡作用對正常細胞和機體功能至關重要，脂滴在肥胖等諸多涉及脂質代謝紊亂的疾病中大量增加。內質網是具有多種功能的重要細胞器，完成蛋白質的合成和跨膜蛋白分泌［16］，包括蛋白質降解、鈣失衡、缺氧和細胞氧化還原調節(jié)等應激狀態(tài)，可導致未折疊蛋白累積，誘發(fā)內質網應激［17］。在應激狀態(tài)下，未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）被激活。UPR由內質網3條傳感通路控制，包括肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、PERK和ATF6。其中PERK主要通過減弱蛋白翻譯和調節(jié)氧化應激參與UPR，可特異性誘導轉錄因子eIF2α、ATF4和CHOP。已有研究表明，內質網應激誘導的下游事件UPR的3個分支都參與NF-κB的激活，進而調控編碼促炎癥細胞因子的基因表達，調控細胞炎癥反應，提示內質網應激參與了細胞炎性反應和細胞凋亡。內質網應激抑制劑可以阻斷內質網應激蛋白在羊慢性子宮內膜上皮中的表達，如ATF6、IRE1、GRP78、ATF4、EIF2和LC3等。內質網抑制劑預處理降低了炎癥細胞因子，如IL-1、IL-8和caspase-1生成，內質網應激與炎癥細胞因子激活之間存在密切關聯，子宮內膜功能異常機理中可能包括亞急性炎癥細胞反應狀態(tài)。

我們的研究結果提示肥胖女性異常脂質代謝狀態(tài)可伴隨內膜組織的高脂狀態(tài)，誘導內質網PERK應激通路中ATF4基因的激活，PERK及ATF4蛋白表達增加，凋亡相關蛋白CHOP的表達量未及明顯差異，雖然TUNEL可以發(fā)現細胞水平凋亡信號的比例增加，但未最終在內膜細胞凋亡后的DAN碎片化程度中發(fā)現顯著異常狀態(tài)的存在。PCOS可能涉及內膜組織凋亡、自噬及存活，免疫耐受及對胚胎容受性等多種生理活動，與女性生殖健康密切相關。我們所觀察到的子宮內膜上皮細胞中脂質含量增加所伴隨內質網應激狀態(tài)還需要進一步擴大人群范圍進行研究論證。