朱永俊，俞 容，李曉燕，王 穎，沈 婕，王善志，崔紅旺

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1腎內(nèi)科，2脊柱外科，海南海口570102）

腎小管間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）走向終末期腎衰的主要病理變化［1］，該病理變化起始于腎小管上皮細(xì)胞的進(jìn)行性喪失，繼而被細(xì)胞外基質(zhì)所代替，進(jìn)而引發(fā)腎小管間質(zhì)纖維化不斷進(jìn)展，直至終末期腎衰。然而，導(dǎo)致CKD小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制和最初的分子事件仍有待充分研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)程序性壞死可能是引起腎大部切除大鼠腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度死亡的重要方式，是引發(fā)腎小管間質(zhì)纖維化損傷的重要原因［2］。但哪些因子能促發(fā)腎小管上皮細(xì)胞程序性壞死尚不清楚。本研究旨在探討血管緊張素II（an‐giotensin II，Ang II）與腫瘤壞死因子α（tumor necro‐sis factor-α，TNF-α）是否是促使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生程序性壞死（necroptosis）的重要炎癥介質(zhì)，并初步探討其發(fā)生機(jī)制，為CKD小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑

人近端腎小管上皮細(xì)胞株HK-2（ATCC）；DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素（Gib‐co）；Ang II、二甲基亞砜和necrostatin-1（Nec-1）購(gòu)自Sigma-Aldrich；TNF-α（Sino Biological）；GSK'872、NSA（Selleck）；Z-VAD-FMK（zVAD）購(gòu)自MPBiomedi‐cals；兔抗受體相互作用蛋白3（receptor-interacting protein 3，RIP3）單克隆抗體（#95702）、兔抗混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）多克隆抗體（#28640）、兔抗phospho-MLKL（p-MLKL）單克隆抗體（#91689）和Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit IgG（H+L）（#4413）購(gòu)自Cell Signaling Technology；兔 抗phospho-RIP3（p-RIP3）多克隆抗體（ab205421）購(gòu)自Abcam；內(nèi)參小鼠抗β-actin單克隆抗體（sc-47778）購(gòu)自Santa Cruz；熒光原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒（Roche）。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 HK-2細(xì)胞于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度按1∶2或1∶3比例傳代。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到70%～80%融合，分別用10?9mol/L濃度的AngII（前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)10?9mol/L是所試驗(yàn)不同濃度AngII誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生程序性壞死出現(xiàn)高峰值的濃度［3］），100μg/L TNF-α及10?9mol/L Ang II+100μg/L TNF-α刺激HK-2細(xì)胞24 h。為了進(jìn)一步評(píng)估HK-2細(xì)胞的死亡情況，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照（control）組：?jiǎn)渭儾捎肈MEM/F12完全培養(yǎng)基處理HK-2細(xì)胞24 h；Ang II組用含10?9mol/L Ang II的DMEM/F12完全培養(yǎng)基處理HK-2細(xì)胞24 h；TNF-α組用含100 ng/mLT‐NF-α的DMEM/F12完全培養(yǎng)基處理HK-2細(xì)胞24 h；Ang II+TNF-α組用含10?9mol/L Ang II和100μg/L TNF-α的DMEM/F12完全培養(yǎng)基處理HK-2細(xì)胞24 h；Ang II+TNF-α+Nec-1干預(yù)組用含100μmol/L程序性壞死特異性抑制劑Nec-1［3］的DMEM/F12完全培養(yǎng)基預(yù)處理HK-2細(xì)胞30 min，再用含10?9mol/L Ang II［3］和100μg/L TNF-α的DMEM/F12完全培養(yǎng)基作用HK-2細(xì)胞24 h；Ang II+TNF-α+zVAD干預(yù)組用含10μmol/L凋亡抑制劑zVAD［3］的DMEM/F12完全培養(yǎng)基預(yù)處理HK-2細(xì)胞30 min，再用含10?9mol/L Ang II和100μg/L TNF-α的DMEM/F12完全培養(yǎng)基處理HK-2細(xì)胞24 h。

2.2 電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化 各組處理的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，800 r/min離心5 min［4］，2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中固定過(guò)夜，用PBS沖洗，然后固定在2%四氧化鋨中4 h。梯度乙醇脫水，轉(zhuǎn)入丙酮。然后，包埋于環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑中。應(yīng)用超微切片機(jī)將標(biāo)本切成50 nm超薄切片，放置在Formvar膜包被的銅網(wǎng)格上晾干。最后，用醋酸鈾酰和堿性檸檬酸鉛對(duì)超薄切片（60～70 nm）進(jìn)行染色，并用透射電鏡（日本日立7700）觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

2.3 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)TUNEL和RIP3蛋白的表達(dá) 1×106/L HK-2細(xì)胞接種于chamber slides（Thermo Scientific）上，并按方法2.1孵育，用于RIP3免疫熒光染色和原位熒光TUNEL染色。首先，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后在0.1%Triton X-100中滲透，并用5%BSA孵育。細(xì)胞用抗RIP3多克隆抗體（稀釋1∶100）在4℃孵育過(guò)夜，然后用Alexa Fluor 555結(jié)合山羊抗兔IgG（H+L）孵育（稀釋1∶200）。在0.1 mol/L PBS（pH 7.4）中沖洗3次后，根據(jù)說(shuō)明書(shū)，用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒試劑孵育樣品，并用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染。最后，用激光共聚焦顯微鏡（LEICA）拍攝圖像，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.4 Western blot法檢測(cè)RIP3、MLKL、p-RIP3和p-MLKL的蛋白水平 離心收集經(jīng)不同干預(yù)的HK-2細(xì)胞，用RIPA裂解液/PMSF混合液提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，并配平；凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，5%BSA-TBST室溫封閉；分別加Ⅰ抗［兔抗RIP3單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗MLKL單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗p-RIP3單克隆抗體（1：400）、兔抗MLKL多克隆抗體（1∶1 000）、抗β-actin抗體（1∶2 000）、兔抗p-MLKL單克隆抗體（1∶400）］4℃過(guò)夜；加Ⅱ抗37℃孵育1 h；TBST洗膜，ECL發(fā)光顯色。以β-actin作為內(nèi)參照，采用FUSION FX7分析軟件（Vilber）進(jìn)行定量分析。

2.5 熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)活性氧簇（reactive oxygen spe‐cies，ROS）的水平 用DCFH-DA懸浮各組處理好的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109/L，每組設(shè)置3孔，每孔加200μL樣本，放置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育25 min，每5 min輕輕震蕩一次，用無(wú)血清的新鮮培養(yǎng)基反復(fù)漂洗細(xì)胞3次，除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCHF-DA。調(diào)整熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，在發(fā)射波長(zhǎng)525 nm下檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度［4］，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 透射電鏡觀察不同干預(yù)組HK-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變

通過(guò)透射顯微鏡觀察在體外用Ang II（10?9mol/L）、TNF-α（100μg/L）、或Ang II（10?9mol/L）聯(lián) 合TNF-α（100μg/L）刺激HK-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)Ang II組、TNF-α組、和Ang II+TNF-α組的HK-2細(xì)胞均出現(xiàn)典型的程序性壞死形態(tài)特征，可見(jiàn)細(xì)胞體積增大，細(xì)胞膜破裂，胞漿內(nèi)容物外溢（圖1A）；與正常對(duì)照組相比，Ang II組、TNF-α組和Ang II+TNFα組的HK-2細(xì)胞壞死率均明顯增高（圖1B，P<0.01），Ang II+TNF-α組與Ang II組和TNF-α組的程序性壞死HK-2細(xì)胞數(shù)量3組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P>0.05）。

分別應(yīng)用程序性壞死特異性抑制劑Nec-1和凋亡抑制劑zVAD預(yù)處理HK-2細(xì)胞后，再用Ang II+TNF-α培養(yǎng)HK-2細(xì)胞24 h；透射電鏡下發(fā)現(xiàn)Nec-1干預(yù)組未發(fā)現(xiàn)明顯壞死的細(xì)胞，僅見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞線粒體呈輕度腫脹，空泡樣變；而zVAD預(yù)處理組可見(jiàn)大量HK-2細(xì)胞呈明顯的壞死形態(tài)特征（圖1A）。與Ang II+TNF-α誘導(dǎo)組相比，Nec-1可明顯抑制HK-2細(xì)胞的壞死率（圖1B，P<0.01）；zVAD反而增加HK-2細(xì)胞的壞死率（圖1B，P<0.05）。

2 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)TUNEL和RIP3蛋白在不同干預(yù)組HK-2細(xì)胞中的表達(dá)和分布

在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)RIP3蛋白主要表達(dá)于HK-2細(xì)胞的胞漿（紅色），TUNEL表達(dá)于細(xì)胞核（綠色），TUNEL和RIP3蛋白熒光染色雙陽(yáng)性的細(xì)胞被認(rèn)為是程序性壞死細(xì)胞。如圖2所示，與對(duì)照組相比，Ang II組、TNF-α組和Ang II+TNF-α組的HK-2細(xì)胞中TUNEL+/RIP3+細(xì)胞數(shù)顯著增高（P<0.01）；Ang II+TNF-α組與Ang II組、TNF-α組的程序性壞死HK-2細(xì)胞中TUNEL+/RIP3+細(xì)胞數(shù)量3組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P>0.05）。

分別應(yīng)用Nec-1和zVAD預(yù)處理HK-2細(xì)胞后，再用Ang II+TNF-α培養(yǎng)HK-2細(xì)胞24 h；激光共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，與Ang II+TNF-α誘導(dǎo)組相比，Nec-1可明顯降低TUNEL+/RIP3+HK-2細(xì)胞數(shù)（P<0.01）；而zVAD可促使TUNEL+/RIP3+細(xì)胞數(shù)增高（P<0.01），見(jiàn)圖2。

3 Western blot檢測(cè)HK-2細(xì)胞中程序性壞死標(biāo)志性蛋白R(shí)IP3、MLKL、p-RIP3及p-MLKL的水平

與正常對(duì)照組相比，Ang II組、TNF-α和ΑngΙΙ+TNF-α組的HK-2細(xì)胞中RIP3、p-RIP3和MLKL、p-MLKL的蛋白水平均顯著增加（P<0.01）；Ang II+TNF-α組、Ang II組或TNF-α組的HK-2細(xì)胞中RIP3、p-RIP3和MLKL、p-MLKL的蛋白水平3組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P>0.05），見(jiàn)圖3。

分別應(yīng)用Nec-1或GSK'872（RIP3抑制劑）或NSA（MLKL抑制劑）預(yù)處理HK-2細(xì)胞后，再用Ang II+TNF-α培養(yǎng)HK-2細(xì)胞24 h；發(fā)現(xiàn)RIP3、p-RIP3、MLKL和p-MLKL的蛋白水平顯著降低（P<0.01），見(jiàn)圖3。

Figure 1.The morphological changes of HK-2 cells visualized by TEM（A）and quatitative analysis of necrotic cells（B）.The scale bars=5μm.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs Ang II+TNF-αgroup.圖1 透射電鏡觀察各組HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

4 熒光標(biāo)記法檢測(cè)不同干預(yù)HK-2細(xì)胞ROS水平的變化

化學(xué)熒光法檢測(cè)Ang II、TNF-α或Ang II+TNF-α對(duì)HK-2細(xì)胞中ROS含量的影響，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，Ang II組和TNF-α組的HK-2細(xì)胞ROS含量明顯增高（P<0.01）；Nec-1或GSK'872或NSA預(yù)處理HK-2細(xì)胞均可降低ROS水平（P<0.01），見(jiàn)圖4。但Ang II組、TNF-α組和Ang II+TNF-α組3組間ROS水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P>0.05）。

討 論

程序性壞死是指由死亡配體結(jié)合適當(dāng)?shù)乃劳鍪荏w誘導(dǎo)的、在天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（cas‐pase）活性被抑制時(shí)發(fā)生的一種特殊形式的程序性死亡方式，可以被Nec-1特異性抑制，而不受凋亡抑制劑如zVAD的影響。此外，它可被程序性壞死關(guān)鍵信號(hào)分子RIP1/3及MLKL所調(diào)控［5］。RIP3通過(guò)其RHIM結(jié)構(gòu)與RIPK1相互結(jié)合、活化，并與MLKL結(jié)合形成程序性壞死小體（necrosome），啟動(dòng)細(xì)胞程序性壞死［6］。已有研究證實(shí)程序性壞死參與了心肌缺血/再灌注損傷［7］、腦缺血［8］、急性腎損傷［9］及視網(wǎng)膜損害［10］等多種疾病的發(fā)病過(guò)程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)腎大部切除大鼠腎組織中具有典型壞死形態(tài)特征的程序性壞死腎小管上皮細(xì)胞，并且腎組織中RIP1、RIP3和MLKL的表達(dá)水平明顯增高，應(yīng)用程序性壞死抑制劑Nec-1以1.65 mg/kg連續(xù)腹膜下注射4周可有效減少腎小管上皮細(xì)胞程序性壞死，進(jìn)而減少了腎小管上皮細(xì)胞的喪失［2］。這些初步結(jié)果提示程序性壞死可能是引起腎大部切除大鼠腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度死亡的重要因素。但是這種腎小管上皮細(xì)胞程序性壞死是由那些因素促發(fā)的，及它是被如何促發(fā)的等問(wèn)題深深地吸引著我們，亟需進(jìn)一步深入探討。

TNF-α是由免疫細(xì)胞（主要是T淋巴細(xì)胞）產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，其他來(lái)源包括白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞。TNF-α屬于可溶性和結(jié)合型細(xì)胞因子家族，具有促進(jìn)炎癥、淋巴發(fā)育和細(xì)胞凋亡等多種功能。在腎組織損傷中，TNF-α是促進(jìn)腎組織炎癥損傷的重要炎癥因子，它與TNF受體1（TNFreceptor 1，TNFR1）結(jié)合后，招募下游的某些信號(hào)分子促使程序性壞死小體necrosome的形成，從而啟動(dòng)程序性壞死［11］。在本研究中，我們使用TNF-α誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TNF-α可以誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。此外Ang II是另一種已知的促進(jìn)CKD進(jìn)展的重要炎癥介質(zhì)。那么，除TNF-α外，Ang II是否是促使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的另一個(gè)重要炎癥介質(zhì)尚需進(jìn)一步證實(shí)。

Figure 2.Immunofluorescence staining for TUNEL（green），RIP3（red）and DAPI（blue）in HK-2 cells（×400，scale bar=50μm）and quantitative analysis of TUNEL+RIP3+cells.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs Ang II+TNF-α group.圖2 激光共聚焦觀察TUNEL和RIP3蛋白在各組HK-2細(xì)胞中的表達(dá)

Ang II作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中最重要的效應(yīng)分子除了發(fā)揮其血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)外，還可作為一種生長(zhǎng)因子或致纖維化因子在腎纖維化和CKD的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中對(duì)腎細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵的、不利的非血流動(dòng)力學(xué)作用［12］。但Ang II介導(dǎo)慢性腎損傷和纖維化的潛在機(jī)制尚不完全清楚。既往研究表明，Ang II可誘導(dǎo)近端腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡、生長(zhǎng)和分化［13］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Ang II暴露可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。重要的是，RIP1穩(wěn)定劑Nec-1可以降低Ang II誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞程序性壞死率而凋亡抑制劑zVAD則加劇了Ang II誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生，這一發(fā)現(xiàn)與程序性壞死的特征相符［14］。因此，我們推測(cè)Ang II可能是誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的另一個(gè)重要因子。

有研究已經(jīng)證實(shí)TNF-α可通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟的血流動(dòng)力學(xué)和排泄功能而直接作用于腎臟，并在腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起作用［15］；反之Ang II升高和其他因素如氧化應(yīng)激條件下會(huì)促進(jìn)TNF-α的形成［16-17］。本研究使用Ang II聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)程序性壞死關(guān)鍵分子RIP3、p-RIP3、MLKL和p-MLKL的蛋白水平與Ang II或TNF-α單獨(dú)誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞一樣增高，透射電鏡及激光共聚焦顯微鏡下顯示Ang II聯(lián)合TNF-α與Ang II、TNF-α單獨(dú)誘導(dǎo)的程序性壞死HK-2細(xì)胞和TUNEL+/RIP3+陽(yáng)性的HK-2細(xì)胞數(shù)量一樣增多；分別應(yīng)用Nec-1或GSK'872或NSA預(yù)處理HK-2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)Ang II+TNF-α誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的RIP3，p-RIP3和MLKL，p-MLKL表達(dá)顯著降低。這些研究表明，Ang II和TNFα是否能協(xié)同或增強(qiáng)誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生尚待進(jìn)一步深入研究。

Figure 3.The protein levels of RIP3，p-RIP3，MLKL and p-MLKL in HK-2 cells were detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs Ang II+TNF-αgroup.圖3 Western blot分析各組HK-2細(xì)胞RIP3、p-RIP3、MLKL和p-MLKL蛋白水平的變化

Figure 4.Analysis of the ROSlevels in the HK-2 cells with dif‐ferent treatments.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs Ang II+TNF-αgroup.圖4 各組HK-2細(xì)胞ROS水平的比較

ROS作為RIP1和RIP3的下游分子在程序性壞死過(guò)程中擔(dān)任著重要的角色［18］，它可以誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)或改變某些通道蛋白的功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。有研究報(bào)道：高表達(dá)的RIP3可以活化磷酸化酶和谷氨酸脫氫酶1等，促使線粒體能量代謝增強(qiáng)，ROS產(chǎn)生增多，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性壞死［19］。本研究我們也發(fā)現(xiàn)Ang II、TNF-α或Ang II+TNF-α干預(yù)HK-2細(xì)胞24 h后ROS產(chǎn)生增多。在Nec-1抑制上游信號(hào)分子RIP1后或GSK'872抑制信號(hào)分子RIP3或NSA抑制信號(hào)分子MLKL后，Ang II聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞產(chǎn)生的ROS含量明顯降低。因此，我們推測(cè)ROS可能是HK-2細(xì)胞程序性壞死關(guān)鍵信號(hào)分子RIP1/3、MLKL的下游信號(hào)分子。

綜上所述，Ang II聯(lián)合TNF-α和Ang II、TNF-α單獨(dú)刺激均能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生RIP3/MLKL依賴(lài)的程序性壞死。ROS可能是HK-2細(xì)胞程序性壞死的關(guān)鍵信號(hào)分子RIP1/3、MLKL的下游信號(hào)分子。但腎小管上皮細(xì)胞程序性壞死促發(fā)CKD小管間質(zhì)纖維化的具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。