朱永俊，俞 容，李曉燕，王 穎，沈 婕，王善志，崔紅旺

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1腎內(nèi)科，2脊柱外科，海南?？?70102）

腎小管間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）走向終末期腎衰的主要病理變化［1］，該病理變化起始于腎小管上皮細胞的進行性喪失，繼而被細胞外基質(zhì)所代替，進而引發(fā)腎小管間質(zhì)纖維化不斷進展，直至終末期腎衰。然而，導(dǎo)致CKD小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機制和最初的分子事件仍有待充分研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)程序性壞死可能是引起腎大部切除大鼠腎小管上皮細胞過度死亡的重要方式，是引發(fā)腎小管間質(zhì)纖維化損傷的重要原因［2］。但哪些因子能促發(fā)腎小管上皮細胞程序性壞死尚不清楚。本研究旨在探討血管緊張素II（an‐giotensin II，Ang II）與腫瘤壞死因子α（tumor necro‐sis factor-α，TNF-α）是否是促使腎小管上皮細胞發(fā)生程序性壞死（necroptosis）的重要炎癥介質(zhì)，并初步探討其發(fā)生機制，為CKD小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑

人近端腎小管上皮細胞株HK-2（ATCC）；DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素（Gib‐co）；Ang II、二甲基亞砜和necrostatin-1（Nec-1）購自Sigma-Aldrich；TNF-α（Sino Biological）；GSK'872、NSA（Selleck）；Z-VAD-FMK（zVAD）購自MPBiomedi‐cals；兔抗受體相互作用蛋白3（receptor-interacting protein 3，RIP3）單克隆抗體（#95702）、兔抗混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）多克隆抗體（#28640）、兔抗phospho-MLKL（p-MLKL）單克隆抗體（#91689）和Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit IgG（H+L）（#4413）購自Cell Signaling Technology；兔 抗phospho-RIP3（p-RIP3）多克隆抗體（ab205421）購自Abcam；內(nèi)參小鼠抗β-actin單克隆抗體（sc-47778）購自Santa Cruz；熒光原位細胞死亡檢測試劑盒（Roche）。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng)和分組 HK-2細胞于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長密度按1∶2或1∶3比例傳代。當細胞生長到70%～80%融合，分別用10?9mol/L濃度的AngII（前期實驗已證實10?9mol/L是所試驗不同濃度AngII誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生程序性壞死出現(xiàn)高峰值的濃度［3］），100μg/L TNF-α及10?9mol/L Ang II+100μg/L TNF-α刺激HK-2細胞24 h。為了進一步評估HK-2細胞的死亡情況，實驗分為正常對照（control）組：單純采用DMEM/F12完全培養(yǎng)基處理HK-2細胞24 h；Ang II組用含10?9mol/L Ang II的DMEM/F12完全培養(yǎng)基處理HK-2細胞24 h；TNF-α組用含100 ng/mLT‐NF-α的DMEM/F12完全培養(yǎng)基處理HK-2細胞24 h；Ang II+TNF-α組用含10?9mol/L Ang II和100μg/L TNF-α的DMEM/F12完全培養(yǎng)基處理HK-2細胞24 h；Ang II+TNF-α+Nec-1干預(yù)組用含100μmol/L程序性壞死特異性抑制劑Nec-1［3］的DMEM/F12完全培養(yǎng)基預(yù)處理HK-2細胞30 min，再用含10?9mol/L Ang II［3］和100μg/L TNF-α的DMEM/F12完全培養(yǎng)基作用HK-2細胞24 h；Ang II+TNF-α+zVAD干預(yù)組用含10μmol/L凋亡抑制劑zVAD［3］的DMEM/F12完全培養(yǎng)基預(yù)處理HK-2細胞30 min，再用含10?9mol/L Ang II和100μg/L TNF-α的DMEM/F12完全培養(yǎng)基處理HK-2細胞24 h。

2.2 電鏡觀察細胞的形態(tài)變化 各組處理的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，800 r/min離心5 min［4］，2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中固定過夜，用PBS沖洗，然后固定在2%四氧化鋨中4 h。梯度乙醇脫水，轉(zhuǎn)入丙酮。然后，包埋于環(huán)氧樹脂包埋劑中。應(yīng)用超微切片機將標本切成50 nm超薄切片，放置在Formvar膜包被的銅網(wǎng)格上晾干。最后，用醋酸鈾酰和堿性檸檬酸鉛對超薄切片（60～70 nm）進行染色，并用透射電鏡（日本日立7700）觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。

2.3 激光共聚焦顯微鏡檢測TUNEL和RIP3蛋白的表達 1×106/L HK-2細胞接種于chamber slides（Thermo Scientific）上，并按方法2.1孵育，用于RIP3免疫熒光染色和原位熒光TUNEL染色。首先，用4%多聚甲醛固定細胞，然后在0.1%Triton X-100中滲透，并用5%BSA孵育。細胞用抗RIP3多克隆抗體（稀釋1∶100）在4℃孵育過夜，然后用Alexa Fluor 555結(jié)合山羊抗兔IgG（H+L）孵育（稀釋1∶200）。在0.1 mol/L PBS（pH 7.4）中沖洗3次后，根據(jù)說明書，用原位細胞死亡檢測試劑盒試劑孵育樣品，并用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染。最后，用激光共聚焦顯微鏡（LEICA）拍攝圖像，并對細胞進行計數(shù)。

2.4 Western blot法檢測RIP3、MLKL、p-RIP3和p-MLKL的蛋白水平 離心收集經(jīng)不同干預(yù)的HK-2細胞，用RIPA裂解液/PMSF混合液提取總蛋白，測定蛋白濃度，并配平；凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，5%BSA-TBST室溫封閉；分別加Ⅰ抗［兔抗RIP3單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗MLKL單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗p-RIP3單克隆抗體（1：400）、兔抗MLKL多克隆抗體（1∶1 000）、抗β-actin抗體（1∶2 000）、兔抗p-MLKL單克隆抗體（1∶400）］4℃過夜；加Ⅱ抗37℃孵育1 h；TBST洗膜，ECL發(fā)光顯色。以β-actin作為內(nèi)參照，采用FUSION FX7分析軟件（Vilber）進行定量分析。

2.5 熒光酶標儀檢測活性氧簇（reactive oxygen spe‐cies，ROS）的水平 用DCFH-DA懸浮各組處理好的細胞，調(diào)整細胞濃度為5×109/L，每組設(shè)置3孔，每孔加200μL樣本，放置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育25 min，每5 min輕輕震蕩一次，用無血清的新鮮培養(yǎng)基反復(fù)漂洗細胞3次，除去未進入細胞內(nèi)的DCHF-DA。調(diào)整熒光酶標儀激發(fā)波長為488 nm，在發(fā)射波長525 nm下檢測各組細胞的熒光強度［4］，此實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 透射電鏡觀察不同干預(yù)組HK-2細胞超微結(jié)構(gòu)的改變

通過透射顯微鏡觀察在體外用Ang II（10?9mol/L）、TNF-α（100μg/L）、或Ang II（10?9mol/L）聯(lián) 合TNF-α（100μg/L）刺激HK-2細胞超微結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)Ang II組、TNF-α組、和Ang II+TNF-α組的HK-2細胞均出現(xiàn)典型的程序性壞死形態(tài)特征，可見細胞體積增大，細胞膜破裂，胞漿內(nèi)容物外溢（圖1A）；與正常對照組相比，Ang II組、TNF-α組和Ang II+TNFα組的HK-2細胞壞死率均明顯增高（圖1B，P<0.01），Ang II+TNF-α組與Ang II組和TNF-α組的程序性壞死HK-2細胞數(shù)量3組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P>0.05）。

分別應(yīng)用程序性壞死特異性抑制劑Nec-1和凋亡抑制劑zVAD預(yù)處理HK-2細胞后，再用Ang II+TNF-α培養(yǎng)HK-2細胞24 h；透射電鏡下發(fā)現(xiàn)Nec-1干預(yù)組未發(fā)現(xiàn)明顯壞死的細胞，僅見少數(shù)細胞線粒體呈輕度腫脹，空泡樣變；而zVAD預(yù)處理組可見大量HK-2細胞呈明顯的壞死形態(tài)特征（圖1A）。與Ang II+TNF-α誘導(dǎo)組相比，Nec-1可明顯抑制HK-2細胞的壞死率（圖1B，P<0.01）；zVAD反而增加HK-2細胞的壞死率（圖1B，P<0.05）。

2 激光共聚焦顯微鏡檢測TUNEL和RIP3蛋白在不同干預(yù)組HK-2細胞中的表達和分布

在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)RIP3蛋白主要表達于HK-2細胞的胞漿（紅色），TUNEL表達于細胞核（綠色），TUNEL和RIP3蛋白熒光染色雙陽性的細胞被認為是程序性壞死細胞。如圖2所示，與對照組相比，Ang II組、TNF-α組和Ang II+TNF-α組的HK-2細胞中TUNEL+/RIP3+細胞數(shù)顯著增高（P<0.01）；Ang II+TNF-α組與Ang II組、TNF-α組的程序性壞死HK-2細胞中TUNEL+/RIP3+細胞數(shù)量3組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P>0.05）。

分別應(yīng)用Nec-1和zVAD預(yù)處理HK-2細胞后，再用Ang II+TNF-α培養(yǎng)HK-2細胞24 h；激光共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，與Ang II+TNF-α誘導(dǎo)組相比，Nec-1可明顯降低TUNEL+/RIP3+HK-2細胞數(shù)（P<0.01）；而zVAD可促使TUNEL+/RIP3+細胞數(shù)增高（P<0.01），見圖2。

3 Western blot檢測HK-2細胞中程序性壞死標志性蛋白RIP3、MLKL、p-RIP3及p-MLKL的水平

與正常對照組相比，Ang II組、TNF-α和ΑngΙΙ+TNF-α組的HK-2細胞中RIP3、p-RIP3和MLKL、p-MLKL的蛋白水平均顯著增加（P<0.01）；Ang II+TNF-α組、Ang II組或TNF-α組的HK-2細胞中RIP3、p-RIP3和MLKL、p-MLKL的蛋白水平3組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P>0.05），見圖3。

分別應(yīng)用Nec-1或GSK'872（RIP3抑制劑）或NSA（MLKL抑制劑）預(yù)處理HK-2細胞后，再用Ang II+TNF-α培養(yǎng)HK-2細胞24 h；發(fā)現(xiàn)RIP3、p-RIP3、MLKL和p-MLKL的蛋白水平顯著降低（P<0.01），見圖3。

Figure 1.The morphological changes of HK-2 cells visualized by TEM（A）and quatitative analysis of necrotic cells（B）.The scale bars=5μm.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs Ang II+TNF-αgroup.圖1 透射電鏡觀察各組HK-2細胞形態(tài)學(xué)的變化

4 熒光標記法檢測不同干預(yù)HK-2細胞ROS水平的變化

化學(xué)熒光法檢測Ang II、TNF-α或Ang II+TNF-α對HK-2細胞中ROS含量的影響，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，Ang II組和TNF-α組的HK-2細胞ROS含量明顯增高（P<0.01）；Nec-1或GSK'872或NSA預(yù)處理HK-2細胞均可降低ROS水平（P<0.01），見圖4。但Ang II組、TNF-α組和Ang II+TNF-α組3組間ROS水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P>0.05）。

討 論

程序性壞死是指由死亡配體結(jié)合適當?shù)乃劳鍪荏w誘導(dǎo)的、在天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（cas‐pase）活性被抑制時發(fā)生的一種特殊形式的程序性死亡方式，可以被Nec-1特異性抑制，而不受凋亡抑制劑如zVAD的影響。此外，它可被程序性壞死關(guān)鍵信號分子RIP1/3及MLKL所調(diào)控［5］。RIP3通過其RHIM結(jié)構(gòu)與RIPK1相互結(jié)合、活化，并與MLKL結(jié)合形成程序性壞死小體（necrosome），啟動細胞程序性壞死［6］。已有研究證實程序性壞死參與了心肌缺血/再灌注損傷［7］、腦缺血［8］、急性腎損傷［9］及視網(wǎng)膜損害［10］等多種疾病的發(fā)病過程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)腎大部切除大鼠腎組織中具有典型壞死形態(tài)特征的程序性壞死腎小管上皮細胞，并且腎組織中RIP1、RIP3和MLKL的表達水平明顯增高，應(yīng)用程序性壞死抑制劑Nec-1以1.65 mg/kg連續(xù)腹膜下注射4周可有效減少腎小管上皮細胞程序性壞死，進而減少了腎小管上皮細胞的喪失［2］。這些初步結(jié)果提示程序性壞死可能是引起腎大部切除大鼠腎小管上皮細胞過度死亡的重要因素。但是這種腎小管上皮細胞程序性壞死是由那些因素促發(fā)的，及它是被如何促發(fā)的等問題深深地吸引著我們，亟需進一步深入探討。

TNF-α是由免疫細胞（主要是T淋巴細胞）產(chǎn)生的促炎細胞因子，其他來源包括白細胞、血管內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞和系膜細胞。TNF-α屬于可溶性和結(jié)合型細胞因子家族，具有促進炎癥、淋巴發(fā)育和細胞凋亡等多種功能。在腎組織損傷中，TNF-α是促進腎組織炎癥損傷的重要炎癥因子，它與TNF受體1（TNFreceptor 1，TNFR1）結(jié)合后，招募下游的某些信號分子促使程序性壞死小體necrosome的形成，從而啟動程序性壞死［11］。在本研究中，我們使用TNF-α誘導(dǎo)HK-2細胞，發(fā)現(xiàn)TNF-α可以誘導(dǎo)HK-2細胞發(fā)生程序性壞死。此外Ang II是另一種已知的促進CKD進展的重要炎癥介質(zhì)。那么，除TNF-α外，Ang II是否是促使腎小管上皮細胞發(fā)生程序性壞死的另一個重要炎癥介質(zhì)尚需進一步證實。

Figure 2.Immunofluorescence staining for TUNEL（green），RIP3（red）and DAPI（blue）in HK-2 cells（×400，scale bar=50μm）and quantitative analysis of TUNEL+RIP3+cells.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs Ang II+TNF-α group.圖2 激光共聚焦觀察TUNEL和RIP3蛋白在各組HK-2細胞中的表達

Ang II作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中最重要的效應(yīng)分子除了發(fā)揮其血流動力學(xué)效應(yīng)外，還可作為一種生長因子或致纖維化因子在腎纖維化和CKD的發(fā)生和發(fā)展過程中對腎細胞發(fā)揮關(guān)鍵的、不利的非血流動力學(xué)作用［12］。但Ang II介導(dǎo)慢性腎損傷和纖維化的潛在機制尚不完全清楚。既往研究表明，Ang II可誘導(dǎo)近端腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡、生長和分化［13］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Ang II暴露可導(dǎo)致腎小管上皮細胞發(fā)生程序性壞死。重要的是，RIP1穩(wěn)定劑Nec-1可以降低Ang II誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞程序性壞死率而凋亡抑制劑zVAD則加劇了Ang II誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞程序性壞死的發(fā)生，這一發(fā)現(xiàn)與程序性壞死的特征相符［14］。因此，我們推測Ang II可能是誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生程序性壞死的另一個重要因子。

有研究已經(jīng)證實TNF-α可通過調(diào)節(jié)腎臟的血流動力學(xué)和排泄功能而直接作用于腎臟，并在腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起作用［15］；反之Ang II升高和其他因素如氧化應(yīng)激條件下會促進TNF-α的形成［16-17］。本研究使用Ang II聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)HK-2細胞，發(fā)現(xiàn)程序性壞死關(guān)鍵分子RIP3、p-RIP3、MLKL和p-MLKL的蛋白水平與Ang II或TNF-α單獨誘導(dǎo)的HK-2細胞一樣增高，透射電鏡及激光共聚焦顯微鏡下顯示Ang II聯(lián)合TNF-α與Ang II、TNF-α單獨誘導(dǎo)的程序性壞死HK-2細胞和TUNEL+/RIP3+陽性的HK-2細胞數(shù)量一樣增多；分別應(yīng)用Nec-1或GSK'872或NSA預(yù)處理HK-2細胞后，發(fā)現(xiàn)Ang II+TNF-α誘導(dǎo)的HK-2細胞的RIP3，p-RIP3和MLKL，p-MLKL表達顯著降低。這些研究表明，Ang II和TNFα是否能協(xié)同或增強誘導(dǎo)HK-2細胞程序性壞死的發(fā)生尚待進一步深入研究。

Figure 3.The protein levels of RIP3，p-RIP3，MLKL and p-MLKL in HK-2 cells were detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs Ang II+TNF-αgroup.圖3 Western blot分析各組HK-2細胞RIP3、p-RIP3、MLKL和p-MLKL蛋白水平的變化

Figure 4.Analysis of the ROSlevels in the HK-2 cells with dif‐ferent treatments.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs Ang II+TNF-αgroup.圖4 各組HK-2細胞ROS水平的比較

ROS作為RIP1和RIP3的下游分子在程序性壞死過程中擔任著重要的角色［18］，它可以誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)或改變某些通道蛋白的功能，從而導(dǎo)致細胞損傷。有研究報道：高表達的RIP3可以活化磷酸化酶和谷氨酸脫氫酶1等，促使線粒體能量代謝增強，ROS產(chǎn)生增多，導(dǎo)致細胞發(fā)生程序性壞死［19］。本研究我們也發(fā)現(xiàn)Ang II、TNF-α或Ang II+TNF-α干預(yù)HK-2細胞24 h后ROS產(chǎn)生增多。在Nec-1抑制上游信號分子RIP1后或GSK'872抑制信號分子RIP3或NSA抑制信號分子MLKL后，Ang II聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)的HK-2細胞產(chǎn)生的ROS含量明顯降低。因此，我們推測ROS可能是HK-2細胞程序性壞死關(guān)鍵信號分子RIP1/3、MLKL的下游信號分子。

綜上所述，Ang II聯(lián)合TNF-α和Ang II、TNF-α單獨刺激均能誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生RIP3/MLKL依賴的程序性壞死。ROS可能是HK-2細胞程序性壞死的關(guān)鍵信號分子RIP1/3、MLKL的下游信號分子。但腎小管上皮細胞程序性壞死促發(fā)CKD小管間質(zhì)纖維化的具體機制有待進一步深入研究。