陳 佳，劉青武，韓旭陽(yáng)，劉 欣，林 燕，馬慧可，何秀娟△，李 萍△

（1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029；2北京中醫(yī)醫(yī)院，北京市中醫(yī)研究所，北京100010）

慢性皮膚潰瘍臨床上多指經(jīng)2周以上治療未能愈合，也無(wú)愈合傾向的創(chuàng)面，該病住院患者占外科住院患者的1.5%～3.0%，其中因糖尿病者占32.6%，臨床發(fā)病率高，病理機(jī)制復(fù)雜，為一種難治性皮膚疾?。?］?，F(xiàn)臨床上使用清創(chuàng)換藥、植皮、生長(zhǎng)因子和干細(xì)胞技術(shù)等進(jìn)行治療［2］，能取得一定的治療作用，但治療周期長(zhǎng)，費(fèi)用昂貴，復(fù)發(fā)率高，給患者帶來(lái)巨大精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［3］。因此，尋找一種療效顯著、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)小、患者易于接受的治療方法是亟待解決的臨床問(wèn)題。而中醫(yī)藥顯示出顯著優(yōu)勢(shì)，其組合協(xié)調(diào)作用和低副作用已成為慢性皮膚潰瘍替代療法研究的熱點(diǎn)?；仃?yáng)生肌湯（Hulyang-Shengji decoction，HYSJD）是經(jīng)北京中醫(yī)醫(yī)院名老中醫(yī)趙炳南、王玉章臨證總結(jié)，現(xiàn)被呂培文發(fā)展而來(lái)的臨床經(jīng)驗(yàn)方。回陽(yáng)生肌湯能顯著改善創(chuàng)面微環(huán)境，促使創(chuàng)面由晦暗變鮮活，加速創(chuàng)面愈合［4-5］，且臨床成本低，副作用小。

單核巨噬細(xì)胞在慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，近年來(lái)被研究者重視。Ly6Chi/+促炎型單核細(xì)胞在單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的作用下被大量募集到局部創(chuàng)面，Ly6Clow/?單核細(xì)胞募集減少，導(dǎo)致創(chuàng)面中M1促炎型巨噬細(xì)胞聚集，M2抗炎型巨噬細(xì)胞減少，驅(qū)動(dòng)創(chuàng)面慢性炎癥，并損害糖尿病傷口愈合［6］。但目前有關(guān)回陽(yáng)生肌湯通過(guò)調(diào)控單核細(xì)胞的動(dòng)員、募集和表型轉(zhuǎn)化來(lái)影響創(chuàng)面愈合的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)db/db糖尿病小鼠構(gòu)建慢性皮膚潰瘍動(dòng)物模型，研究回陽(yáng)生肌湯對(duì)慢性皮膚潰瘍的治療作用，探討其是否通過(guò)調(diào)節(jié)Ly6Chi/+/Ly6Clow/?單核細(xì)胞的動(dòng)員和募集，增加創(chuàng)面中M2型巨噬細(xì)胞來(lái)源，從而加速慢性皮膚潰瘍的傷口愈合，進(jìn)一步揭示回陽(yáng)生肌湯可能的作用機(jī)制，為回陽(yáng)生肌湯的推廣應(yīng)用提供參考資料。

材料和方法

1 動(dòng)物

db/db糖尿病小鼠為無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)小鼠，雄性，8～12周齡，35～40 g；db/m小鼠，SPF級(jí)，雄性，6～8周齡，20～22 g。這2種小鼠均購(gòu)于江蘇常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010］，已通過(guò)北京市倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有小鼠在清潔、安靜、通風(fēng)良好的環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度20～22℃，相對(duì)濕度40%～60%，12 h光照/12 h避光循環(huán)飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，定期更換墊料，定期清理、消毒鼠籠。無(wú)菌手術(shù)在北京市中醫(yī)研究所動(dòng)物房?jī)?nèi)進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)藥物

回陽(yáng)生肌湯飲片由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，由北京市中醫(yī)研究所制劑室負(fù)責(zé)質(zhì)量控制。臨床常用回陽(yáng)生肌湯組成：生黃芪30 g、炒白術(shù)10 g、茯苓20 g、蒼術(shù)10 g、肉桂10 g、附子10 g、鹿角霜10 g、木瓜10 g、白芥子10 g、當(dāng)歸10 g、熟地10 g和北沙參15 g。重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購(gòu)自Pe‐proTech。

3 主要試劑和儀器

明膠海綿購(gòu)自南京金陵制藥廠；一次性無(wú)菌敷料貼購(gòu)自山東東華醫(yī)療科技有限公司；多重免疫熒光抗體：CD68、精氨酸酶1（arginase-1，ARG-1）、清道夫受體CD163和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible ni‐tric oxide synthase，iNOS）抗體購(gòu)自Abcam；炎癥因子蛋 白 芯 片（GSM-INF-1：mouse inflammation Array GSI）購(gòu)自RayBiotech；單核細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)抗體CD45-APC/Cyanine7、Ly6C-PE、Ly6G-FITC、Viability staining solution-7-AAD和CD115-PE-Cyanine7均購(gòu)自BioLegend。流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD；血糖儀購(gòu)自三諾公司。

4 主要方法

4.1 藥物配制 回陽(yáng)生肌湯凍干粉制備：加入生藥總克數(shù)8倍體積的超純水，浸泡30 min，大火加熱煮沸后過(guò)濾，再加入生藥總克數(shù)6倍體積的超純水再次煎煮，大火煮沸后，文火繼續(xù)煎煮30 min，過(guò)濾后合并兩次收集的濾液；經(jīng)過(guò)醇沉法獲得精制液，進(jìn)行真空冷凍干燥，得到凍干粉制劑，儲(chǔ)存于干燥罐中備用。根據(jù)人、小鼠體表面積換算公式，使用蒸餾水將回陽(yáng)生肌湯凍干粉配成終濃度為2.325 kg/L的均勻懸液。使用1%胎牛血清將bFGF配成終濃度為3.6 mg/L的溶液，置于?20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4.2 回陽(yáng)生肌湯含藥血清質(zhì)譜分析 使用高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）對(duì)回陽(yáng)生肌湯含藥血清進(jìn)行質(zhì)譜分析。色譜分離采用Thermo Scientific的U3000快速液相色譜，使用反相色譜和親水色譜對(duì)血清樣本進(jìn)行分析。質(zhì)譜分析采用裝備熱電噴霧離子源的四極桿軌道離子阱質(zhì)譜儀。數(shù)據(jù)采集和靶向代謝物定量處理由Xcalibur 2.2 SP1.48軟件操作。

4.3 糖尿病小鼠一般表現(xiàn)及血糖值檢測(cè) 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，觀察小鼠飲食、飲水、排尿、活動(dòng)等習(xí)慣，于造模前稱(chēng)重，剪尾檢測(cè)血糖值。

4.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型制備及給藥 參照經(jīng)典的背部皮膚全層切除術(shù)制備慢性皮膚潰瘍小鼠模型［7］。小鼠戊巴比妥鈉麻醉后，背部剃毛，碘伏消毒，制備背部直徑6 mm全層皮膚切除傷口，距離背部中線(xiàn)和四肢等距離，單籠飼養(yǎng)。將30只db/db糖尿病小鼠隨機(jī)分為3組：模型組、回陽(yáng)生肌湯組和bFGF組?？瞻讓?duì)照組采用與db/db糖尿病小鼠相同背景的db/m小鼠。每組各10只小鼠?？瞻讓?duì)照組和模型組每日蒸餾水0.4 mL灌胃，外用含50μL生理鹽水的明膠敷料；回陽(yáng)生肌湯組每日回陽(yáng)生肌湯凍干粉懸液0.4 mL灌胃，外用含50μL生理鹽水的明膠敷料；bFGF組每日蒸餾水0.4 mL灌胃，外用含50μL bFGF的明膠敷料。灌胃每天1次，隔日換藥，外用一次性無(wú)菌敷料貼包扎。采用數(shù)碼照相拍照方法記錄創(chuàng)面愈合情況。

4.5 皮膚創(chuàng)面愈合率 數(shù)碼照相機(jī)采集的圖片采用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件分析，統(tǒng)計(jì)小鼠治療后第1、3和7天創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率（%）=（給藥前創(chuàng)面面積?未愈合創(chuàng)面面積）/給藥前創(chuàng)面面積×100%。

將通州區(qū)的農(nóng)村路網(wǎng)規(guī)模控制在通過(guò)以上測(cè)算得到的結(jié)果范圍內(nèi)，繼而進(jìn)行副中心背景下的農(nóng)村公路的布局方案，本文主要介紹以下幾種典型情況.

4.6 創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察 傷口皮膚取材后，10%甲醛溶液固定48 h，脫水、石蠟包埋，以5μm為厚度切片。將脫水后的切片進(jìn)行脫蠟至水，蘇木素侵染5 min，流水沖洗5 min后，鹽酸分化5 s，伊紅染液侵染5 min，流水沖洗5 min后多余軟料后，樹(shù)脂封片后進(jìn)行拍照。利用Aperio Image Scope軟件分析處理圖片。觀察創(chuàng)面皮膚表皮細(xì)胞爬行、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肉芽組織新生情況。

4.7 多重免疫熒光檢測(cè)傷口組織中M1型和M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量 石蠟切片（3μm）用磷酸鹽緩沖溶液洗滌15 min×2次，0.2%～0.5%Triton X-100通透，5%正常馬血清封閉1 h，使用CD68、ARG-1、CD163和iNOSⅠ抗過(guò)夜孵育，孵育Ⅱ抗后封片。使用Stra‐ta Quest軟件對(duì)切片中的巨噬細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)和定量。圖像處理：對(duì)整個(gè)圖像進(jìn)行重構(gòu)，并對(duì)全部結(jié)構(gòu)進(jìn)行分割。在核識(shí)別和篩選的基礎(chǔ)上，分析巨噬細(xì)胞表面CD68、Arg1、CD163和iNOS蛋白表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)分析M1和M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量占總巨噬細(xì)胞細(xì)胞數(shù)的百分比（%）。

4.8 蛋白芯片檢測(cè)創(chuàng)面細(xì)胞因子的表達(dá) 將創(chuàng)面皮膚組織裂解后，采用蛋白定量試劑盒（BCA法）檢測(cè)細(xì)胞裂解液蛋白濃度。采用Cy3或綠色通道（激發(fā)光波長(zhǎng)為532 nm）掃描，將得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Ray‐biotech軟件進(jìn)行芯片背景去除和芯片間歸一化處理，選擇歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析方法為矯正t檢驗(yàn)（moderatedt-statistics）；數(shù)據(jù)包為limma（R/Bioconductor）；采用P值（P<0.05）和logFC（表達(dá)差異倍數(shù)，以2為底，logFC>log21.2，差異閾值為1.2）對(duì)差異蛋白進(jìn)行篩選。

4.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠股骨骨髓和血液中總單核細(xì)胞、Ly6Clow/?單核細(xì)胞和Ly6Chi/+單核細(xì)胞比例分別收集小鼠單側(cè)脛股骨骨髓、血液中的總細(xì)胞。使用紅細(xì)胞裂解液裂解10 min，調(diào)整細(xì)胞數(shù)以每管106/100μL，加入CD45-APC/Cyanine7（0.25μg/106）、CD115-PE-Cyanine7（0.125μg/106）、Ly6G-PE（0.25μg/106）和Ly6C-FITC（0.25μg/106）流式抗體，4℃避光孵育30 min，使用500μL的PBS重懸，上機(jī)前加入Viability staining solution-7-AAD（每管5μL）待檢。在CD45+CD115+單核細(xì)胞中篩選出Ly6Clow/?和Ly6Chi/+單核細(xì)胞。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊者兩兩差異比較用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖片繪制使用Prism 8.0版本。

結(jié) 果

1 回陽(yáng)生肌湯含藥血清主要成分

回陽(yáng)生肌湯含藥血清主要成分為毛蕊異黃酮（calycosin）、毛蕊黃酮苷（calycosin-7-glucoside）、次芒柄花素（formononetin）、芥子酸（sinapic acid）和次烏頭堿（hypaconitine），見(jiàn)圖1。

2 糖尿病小鼠一般表現(xiàn)及血糖值檢測(cè)

db/db小鼠平均體重為40 g，顯著高于空白對(duì)照組的db/m小鼠（P<0.01），見(jiàn)圖2A；db/db小鼠貪食、多飲、多尿，飼養(yǎng)籠墊料潮濕，行動(dòng)遲緩。db/m小鼠平均血糖濃度8 mmol/L，db/db糖尿病小鼠平均血糖濃度26 mmol/L，顯著高于db/m小鼠（P<0.01）；db/db糖尿病小鼠各組間血糖濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖2B。

3 回陽(yáng)生肌湯對(duì)db/db糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合率的影響

結(jié)果顯示，db/m空白對(duì)照組第3和7天創(chuàng)面愈合率分別為64.08%和82.95%，模型組第3和7天創(chuàng)面愈合率分別為24.14%和41.58%，模型組創(chuàng)面愈合率顯著低于空白對(duì)照組（P<0.01）；回陽(yáng)生肌湯干預(yù)后第3和7天創(chuàng)面愈合率分別為37.56%和61.17%，顯著高于模型組（P<0.01）；陽(yáng)性對(duì)照bFGF組第3和7天創(chuàng)面愈合率分別為38.08%和59.41%，與回陽(yáng)生肌湯相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見(jiàn)圖3。

4 回陽(yáng)生肌湯對(duì)db/db糖尿病小鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)改變的影響

創(chuàng)面愈合第7天，各組創(chuàng)面邊緣均開(kāi)始出現(xiàn)表皮細(xì)胞爬行，但創(chuàng)面均未完全愈合：空白對(duì)照組創(chuàng)面肉芽組織形成，同時(shí)見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管，大量纖維排列整齊；模型組表皮爬行緩慢，細(xì)胞稀疏，肉芽組織新生減少，成纖維細(xì)胞和血管新生稀少；回陽(yáng)生肌湯組可見(jiàn)表皮細(xì)胞增生向中間延伸，新生肉芽組織致密，成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管豐富，新生成纖維排列整齊，bFGF組與回陽(yáng)生肌湯組改變一致，見(jiàn)圖4。

5 回陽(yáng)生肌湯對(duì)db/db糖尿病小鼠創(chuàng)面M 1和M 2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響

CD68、ARG-1、CD163和iNOS分別為總巨噬細(xì)胞、M2a型巨噬細(xì)胞、M2c型巨噬細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性分子。在整個(gè)創(chuàng)面組織中，空白對(duì)照組M1型巨噬細(xì)胞（CD68+iNOS+ARG-1?CD163?）和M2型巨噬細(xì)胞（CD68+iNOS?ARG-1+CD163+）分別占總巨噬細(xì)胞（CD68+）的4.02%和2.48%；模型組M1和M2型巨噬細(xì)胞分別占總巨噬細(xì)胞的31.60%和0.76%，與空白對(duì)照組相比，模型組M1型數(shù)量顯著增多，M2型顯著減少（P<0.01）；回陽(yáng)生肌湯組M1和M2型巨噬細(xì)胞分別占總巨噬細(xì)胞的6.10%和14.75%，與模型組相比，M1型數(shù)量顯著減少，M2型顯著增多（P<0.01）；bFGF組M1和M2型巨噬細(xì)胞分別占總巨噬細(xì)胞的5.24%、10.28%，與模型組相比，M1型數(shù)量顯著減少，M2型顯著增多（P<0.01），與回陽(yáng)生肌湯組相比，M1和M2型數(shù)量均無(wú)顯著差異（P>0.05），見(jiàn)圖5。

6 回陽(yáng)生肌湯對(duì)db/db糖尿病小鼠創(chuàng)面M 1和M 2型細(xì)胞因子的影響

結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組白細(xì)胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、TNF受體Ⅱ（TNF receptor II，TNF-RII）、MCP-1和干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組相比，回陽(yáng)生肌湯組IL-1β、IL-1α、IFN-γ、TNF-α、TNF-RII和MCP-1表達(dá)水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），bFGF組TNF-RII和IL-1α表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），但I(xiàn)FN-γ、TNF-α和MCP-1表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01），IL-1β表達(dá)無(wú)顯著差異（P>0.05），見(jiàn)圖6。

Figure 1.The mass spectrumanalysis of the medicated serum of Huiyang-Shengjidecoction.圖1 回陽(yáng)生肌湯含藥血清質(zhì)譜分析圖

Figure 2.Body weight（A）and random blood glucose（B）of the mice in each group.Ctrl：control；HYSJD：Huiyang-Shengjidecoc‐tion；bFGF：basic fibroblast growth factor，as positive control.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group.圖2 各組小鼠體重和隨機(jī)血糖檢測(cè)值

7 回陽(yáng)生肌湯對(duì)db/db糖尿病小鼠骨髓和血液總單核細(xì)胞及Ly6Clow/?和Ly6Chi/+單核細(xì)胞比例的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組骨髓總單核細(xì)胞和Ly6Clow/?單核細(xì)胞比例下降，Ly6Chi/+單核細(xì)胞比例升高（P<0.05或P<0.01），血液中總單核細(xì)胞和Ly6Chi/+單核細(xì)胞比例升高，Ly6Clow/?單核細(xì)胞比例下降（P<0.05或P<0.01）；與模型組相比，回陽(yáng)生肌湯組骨髓總單核細(xì)胞和Ly6Clow/?單核細(xì)胞比例升高，Ly6Chi/+單核細(xì)胞比例下降（P<0.05），血液中總單核細(xì)胞和Ly6Chi/+單核細(xì)胞比例下降，Ly6Clow/?單核細(xì)胞比例升高（P<0.01）；bFGF組骨髓和血液總單核細(xì)胞、Ly6Clow/?單核細(xì)胞和Ly6Chi/+單核細(xì)胞比例與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖7。

討 論

慢性皮膚潰瘍表現(xiàn)出創(chuàng)面持續(xù)炎癥狀態(tài)，肉芽組織新生和表皮細(xì)胞爬行困難，創(chuàng)面難以愈合。在創(chuàng)面愈合的增殖期和重塑期，因機(jī)體高血糖等因素導(dǎo)致創(chuàng)面組織中大量的M1促炎型巨噬細(xì)胞難以向M2型極化，分泌大量的炎癥細(xì)胞因子，同時(shí)血液中Ly6Chi/+促炎型單核細(xì)胞被大量募集到局部組織，分化為吞噬能力較強(qiáng)的M1型巨噬細(xì)胞，吸引更多的炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合機(jī)制難以啟動(dòng)［4］?；仃?yáng)生肌湯是回陽(yáng)生肌法的內(nèi)服代表方劑，為臨床上治療慢性皮膚潰瘍的經(jīng)驗(yàn)方，可加速慢性皮膚潰瘍“陰證”創(chuàng)面愈合，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究證明回陽(yáng)生肌湯能促進(jìn)db/db糖尿病小鼠慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合，通過(guò)抑制Ly6Chi/+促炎型單核細(xì)胞動(dòng)員和募集，促進(jìn)Ly6Clow/?抗炎型單核細(xì)胞動(dòng)員和募集，減少創(chuàng)面中血液來(lái)源的M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量，增加M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)創(chuàng)面血管新生和細(xì)胞外基質(zhì)形成。

Figure 4.Huiyang-Shengji decoction（HYSJD）promotes the regeneration of granulation tissue in diabetic mice（HE staining of wound tissue on the 7th day，scale bar=2 mm）.圖4 回陽(yáng)生肌湯促進(jìn)糖尿病小鼠創(chuàng)面肉芽組織新生

隨著生活水平不斷提高，慢性皮膚潰瘍病因復(fù)雜化，其中糖尿病為主要致病因素?；颊叨嘁蛱谴x紊亂，機(jī)體糖基化終末產(chǎn)物富集，血管、神經(jīng)功能受損，導(dǎo)致破潰皮膚組織糖元利用度下降，細(xì)胞衰老壞死，局部生長(zhǎng)因子釋放減少。臨床多表現(xiàn)為創(chuàng)面平塌或下陷、滲液清稀，肉芽蒼白水腫。因陰虛熱盛，耗氣傷陰，導(dǎo)致神疲乏力、倦怠等全身癥狀，長(zhǎng)期拖延失治或誤治，創(chuàng)面干枯黧黑，全身腰膝酸軟，中醫(yī)診斷為“氣血不足，脾腎陽(yáng)虛，腎精虛衰”，屬瘡瘍“陰證”范疇?；仃?yáng)生肌湯是北京中醫(yī)醫(yī)院名老中醫(yī)趙炳南、王玉章和呂培文治療瘍瘡“陰證”的臨床經(jīng)驗(yàn)方劑，具有益氣養(yǎng)血、溫補(bǔ)脾陽(yáng)、補(bǔ)腎填精的功效［8］。

回陽(yáng)生肌湯由生黃芪、炒白術(shù)、蒼術(shù)、茯苓、肉桂、附子、鹿角霜、木瓜、白芥子、熟地、當(dāng)歸和北沙參組成。君藥附子、肉桂，補(bǔ)腎溫陽(yáng)；臣藥鹿角霜、黃芪、白術(shù)、茯苓、熟地、當(dāng)歸、北沙參，益氣養(yǎng)血、溫補(bǔ)腎陽(yáng)；佐使藥木瓜、蒼術(shù)、白芥子，健脾除濕，共奏益氣養(yǎng)血、健脾補(bǔ)腎、溫陽(yáng)散寒之效。腎為先天之本，脾為后天之本、氣血生化之源，因此調(diào)補(bǔ)脾腎，滋補(bǔ)腎精腎陽(yáng)，氣血生化有源，使創(chuàng)面氣血來(lái)源充足，陽(yáng)氣得以溫煦，改善創(chuàng)面微環(huán)境?；仃?yáng)生肌湯治療后創(chuàng)面由晦暗變鮮活，膿液由清晰變濃稠，肉芽組織蒼白變紅潤(rùn)，表現(xiàn)出一派由“陰證”轉(zhuǎn)“陽(yáng)證”之象，創(chuàng)面逐漸愈合［9-10］。同時(shí)回陽(yáng)生肌湯主要成分毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花素等已被大量研究。毛蕊異黃酮抑制Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）等信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、維持上皮屏障等作用［11-13］。毛蕊異黃酮苷可保護(hù)缺血再灌注損傷，預(yù)防氧化應(yīng)激［14-16］。刺芒柄花素為重要的抗癌靶標(biāo)分子，改善高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮損害，保護(hù)2型糖尿病的腎臟損傷［17-19］。

Figure 5.Huiyang-Shengji decoction（HYSJD）decreased the positive rate of M1 macrophages and increased the positive rate of M2 macrophages in the wound of diabetic mice.A and B：representative images of multiple immunofluorescence staining to identify different phenotypes of macrophages（scale bar=500μm in A；scale bar=200 nm in B）；C：the proportion of M2（a+c）and M1 macrophages in total macrophages in mouse wound tissue at 7 d.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs model group.圖5 回陽(yáng)生肌湯降低糖尿病小鼠創(chuàng)面中M 1型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率，升高M(jìn) 2型陽(yáng)性率

在本實(shí)驗(yàn)中，db/db糖尿病小鼠為4號(hào)染色體的瘦素受體（leptin）基因缺陷導(dǎo)致的自發(fā)性2型糖尿病型小鼠。與db/m小鼠相比，db/db小鼠表現(xiàn)出高血糖，貪食、多飲、多尿，大便溏稀腥臭，蜷縮少動(dòng)［20］，將背部進(jìn)行6 mm直徑的全層皮膚切除術(shù)，形成經(jīng)典的慢性皮膚潰瘍模型［21］。db/db小鼠皮膚創(chuàng)面清冷，滲液清稀，創(chuàng)面愈合遲緩?；仃?yáng)生肌湯治療后顯著提高創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面顏色鮮活，滲液濃稠，肉芽組織紅潤(rùn)，創(chuàng)面表現(xiàn)出由陰轉(zhuǎn)陽(yáng)的趨勢(shì)。bFGF為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，對(duì)創(chuàng)面中成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等都具有促增殖作用，是臨床上常用的細(xì)胞生長(zhǎng)因子藥物，臨床應(yīng)用廣泛，為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照藥物［22-23］。與bFGF組相比，回陽(yáng)生肌湯創(chuàng)面愈合率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明回陽(yáng)生肌湯是具有臨床推廣價(jià)值的藥物。

Figure 6.Huiyang-Shengji decoction（HYSJD）attenuated wound inflammation in diabetic mice.Mean±SD.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs model group.圖6 回陽(yáng)生肌湯減輕糖尿病小鼠創(chuàng)面炎癥

與急性傷口相比，慢性皮膚潰瘍傷口顯示出巨噬細(xì)胞的數(shù)量和表型發(fā)生變化。在慢性傷口邊緣，80%的細(xì)胞是M1型巨噬細(xì)胞，且表現(xiàn)出向M2型極化障礙，是傷口慢性不愈合的重要機(jī)制［24］。糖尿病小鼠傷口模型顯示，在晚期糖基化終產(chǎn)物等物質(zhì)的影響下，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的減少導(dǎo)致調(diào)節(jié)修復(fù)增殖階段的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endo‐thelial growth factor，VEGF）水平降低，傷口中聚集高水平的促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、IL-6和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等，導(dǎo)致不愈合表型［25］。M2型又可分為M2a、M2b、M2c和M2d四種亞型，其中M2a型和M2c型在細(xì)胞外基質(zhì)沉積和血管新生中發(fā)揮主要作用［26-28］。在創(chuàng)面中使用鐵螯合劑去鐵氧胺治療鐵負(fù)荷小鼠，可減少創(chuàng)面巨噬細(xì)胞向M1型極化，促進(jìn)傷口愈合［29］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)第7天創(chuàng)面皮膚中不同表型巨噬細(xì)胞進(jìn)行定量分析，回陽(yáng)生肌湯治療后，創(chuàng)面中M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著下降，M2（M2a和M2c）型數(shù)量增多，MCP-1、IL-1α、IL-1β、TNF-α、TNF-RII和IFNγ表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明回陽(yáng)生肌湯治療后的創(chuàng)面中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，創(chuàng)面炎癥減輕，肉芽組織新生。bFGF組創(chuàng)面中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，但創(chuàng)面中與M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)的IFN-γ、TNF-α、MCP-1等炎癥因子的表達(dá)水平仍升高，說(shuō)明bFGF作為一種生長(zhǎng)因子，可能通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等其他作用機(jī)制發(fā)揮作用，間接作用于巨噬細(xì)胞［30］。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明回陽(yáng)生肌湯能調(diào)節(jié)創(chuàng)面中M1/M2型巨噬細(xì)胞平衡，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，創(chuàng)面炎癥減輕，加速愈合。

創(chuàng)面中的巨噬細(xì)胞主要來(lái)源于血液中的單核細(xì)胞。通常Ly6Chi/+促炎型單核細(xì)胞募集到局部組織分化為M1型巨噬細(xì)胞；Ly6Clow/?抗炎型單核細(xì)胞募集到創(chuàng)面分化為M2型巨噬細(xì)胞。在創(chuàng)面愈合的不同時(shí)期，存在不同步趨化，且兩者可相互轉(zhuǎn)化［31］。創(chuàng)面免疫細(xì)胞分泌的趨化因子影響單核細(xì)胞的募集，參與單核細(xì)胞通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和活化［32-33］。在糖尿病小鼠創(chuàng)面中，趨化因子MCP-1促使發(fā)育不成熟的Ly6Chi/+單核細(xì)胞二次募集。在缺乏MCP-1、MCP-3或C-C趨化因子受體2（C-C chemokine recep‐tor 2，CCR2）介導(dǎo)信號(hào)的小鼠骨髓中，主要保留Ly6Chi/+單核細(xì)胞［34］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在血管竇附近釋放MCP-1，將Ly6Chi/+單核細(xì)胞吸引到內(nèi)皮近腔面［35］，說(shuō)明MCP-1信號(hào)介導(dǎo)Ly6Chi/+單核細(xì)胞從骨髓向血液中動(dòng)員和向創(chuàng)面募集，導(dǎo)致M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，炎癥期延長(zhǎng)。同時(shí)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）釋放水凝膠可局部吸Ly6Clow/?抗炎型單核細(xì)胞，促進(jìn)小鼠背部皮膚微血管網(wǎng)的生成和重塑［36-37］?；仃?yáng)生肌湯治療后MCP-1分泌水平下降，我們使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓及血液中Ly6Chi/+和Ly6Clow/?單核細(xì)胞，結(jié)果顯示Ly6Chi/+單核細(xì)胞從骨髓向血液中動(dòng)員和向組織募集減少，Ly6Clow/?單核細(xì)胞動(dòng)員和募集數(shù)量增多，這可能是創(chuàng)面中血液來(lái)源的M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增多的重要原因之一。

Figure 7.Huiyang-Shengji decoction（HYSJD）inhibited the mobilization and recruitment of Ly6Chi/+monocytes.A：schematic dia‐gram and statistical graph of the proportion of total，Ly6Chi/+and Ly6Clow/?monocytes in mouse bone marrow；B：schematic diagram and statistical graph of the proportion of total，Ly6Chi/+and Ly6Clow/?monocytes in mouse blood.Mean±SD.n=5.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs model group.圖7 回陽(yáng)生肌湯抑制Ly6Chi/+巨噬細(xì)胞動(dòng)員和募集

綜上所述，本研究證實(shí)回陽(yáng)生肌湯能夠提高糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面愈合率，促進(jìn)肉芽組織新生，減少創(chuàng)面中血液來(lái)源M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量，增加M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量，降低創(chuàng)面炎癥因子水平，其作用可能是通過(guò)抑制創(chuàng)面趨化因子MCP-1釋放，抑制Ly6Chi/+單核細(xì)胞的動(dòng)員和募集，促進(jìn)Ly6Clow/?單核細(xì)胞的動(dòng)員和募集，從而使創(chuàng)面炎癥水平下降，加速愈合。但回陽(yáng)生肌湯是通過(guò)何種機(jī)制促進(jìn)Ly6Clow/?單核細(xì)胞動(dòng)員和募集的，有待我們進(jìn)一步探索。這一基礎(chǔ)研究為回陽(yáng)生肌湯的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，并為進(jìn)一步在多種動(dòng)物模型上研究回陽(yáng)生肌湯的作用提供了證據(jù)和方向。但回陽(yáng)生肌湯能否直接作用于巨噬細(xì)胞，促進(jìn)M1型向M2型極化，有待我們進(jìn)一步體外驗(yàn)證。