閆 媛，牛芳林，王迓君，于 怡，熊裕焱，△

（西北大學(xué)1生命科學(xué)學(xué)院，2醫(yī)學(xué)院，陜西西安710069）

L-精氨酸（L-arginine）是一種半必需氨基酸，參與蛋白質(zhì)的生物合成、宿主免疫反應(yīng)、尿素循環(huán)和一氧化氮（nitric oxide，NO）的產(chǎn)生等多種生物過程［1］。在心血管系統(tǒng)中，L-精氨酸是內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）產(chǎn)生血管舒張因子NO的單一底物［1-2］，NO在調(diào)節(jié)血管張力和整體心血管穩(wěn)態(tài)中具有重要作用［3］，也是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能檢測(cè)的常見指標(biāo)［4］。另外，精氨酸也是尿素循環(huán)中精氨酸酶的底物，精氨酸酶對(duì)精氨酸的消耗會(huì)引起eNOS底物不足，導(dǎo)致NO產(chǎn)生減少，因此二者的表達(dá)平衡對(duì)維持血管內(nèi)皮功能具有重要意義［5］。我們之前的研究表明，精氨酸酶I（arginase-I，Arg-I）過表達(dá)會(huì)引起活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）升高和NO下降，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙［6］。

在基礎(chǔ)理論和臨床研究中，L-精氨酸補(bǔ)充劑被用來(lái)治療某些心血管疾病如高血壓和冠心病等［1，7-10］，改善內(nèi)皮依賴性血管舒張［11-18］，但其作用仍存在許多爭(zhēng)議。已有研究表明，L-精氨酸補(bǔ)充劑對(duì)內(nèi)皮功能沒有持續(xù)有益作用［19-23］；口服L-精氨酸補(bǔ)充劑與心血管疾病的改善沒有關(guān)聯(lián)［24］；長(zhǎng)期L-精氨酸補(bǔ)充對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型［25］和心血管疾病患者存在原因不明的有害作用［26-27］。由此可見，L-精氨酸在心血管疾病中的作用不僅僅和NO的生成有關(guān)。為進(jìn)一步闡明L-精氨酸在心血管系統(tǒng)中的其它作用，我們以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilicalvein endothelialcells，HUVECs）為研究對(duì)象，采用不同的L-精氨酸補(bǔ)充時(shí)間處理細(xì)胞，探索不同長(zhǎng)短的補(bǔ)充時(shí)間對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及其分子機(jī)制，為L(zhǎng)-精氨酸用于治療心血管疾病提供理論指導(dǎo)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

原代人HUVECs購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司，經(jīng)該公司鑒定vWF的表達(dá)陽(yáng)性率達(dá)90%以上。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子購(gòu)自Promo‐Cell；澳洲胎牛血清購(gòu)自Gibco；RPMI-1640高糖培養(yǎng)基，L-精氨酸和Western blot相關(guān)試劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich；超氧化物陰離子熒光檢測(cè)探針二氫乙啶（di‐hydroethidium，DHE）和檢測(cè)NO的4，5-二氨基熒光素二乙酸酯（4，5-diaminofluorescein diacetate，DAF-2DA）染料均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（senescence-associated galactosidase，SA-β-Gal）染色試劑盒購(gòu)于Promega；U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)靶向人Arg-I的shRNA重組腺病毒由瑞士弗里堡大學(xué)的Zhihong Yang教授贈(zèng)送；抗tubulin、Arg-I、核糖體蛋白S6、磷酸化S6、核糖體蛋白S6激酶1（ribosomal pro‐tein S6 kinase 1，S6K1）和磷酸化S6K1抗體均購(gòu)自CST。SDS-PAGE儀器和半干轉(zhuǎn)印儀均購(gòu)自Bio-Rad。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 原代HUVECs復(fù)蘇于含有5%胎牛血清FBS、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和抗生素（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)液中，并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h換液，待細(xì)胞融合率達(dá)80%進(jìn)行傳代。選取第2～4代的HUVECs作為“年輕”的血管內(nèi)皮細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞L-精氨酸處理 對(duì)于短期L-精氨酸處理實(shí)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行血清和L-精氨酸饑餓過夜處理，然后用0.1 mmol/L（正常生理濃度）或0.5 mmol/L（臨床補(bǔ)充濃度）的L-精氨酸處理2 h。對(duì)于長(zhǎng)期補(bǔ)充L-精氨酸的研究，將細(xì)胞在不含L-精氨酸的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后補(bǔ)充0.1或0.5 mmol/L的L-精氨酸，培養(yǎng)10 d，每48 h更換一次培養(yǎng)基。樣品收集前，將細(xì)胞饑餓處理過夜。對(duì)于需要基因沉默的實(shí)驗(yàn)，在L-精氨酸饑餓后用重組腺病毒感染細(xì)胞。

2.3 mTORC1和S6K1活性檢測(cè) 通過Western blot分別檢測(cè)S6K1在蘇氨酸389（T389）上的磷酸化和它的底物S6在絲氨酸235/絲氨酸236（S235/S236）上的磷酸化來(lái)分析mTORC1和S6K1的活性。

2.4 SA-β-Gal染色檢測(cè)細(xì)胞衰老 首先用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后用3.7%甲醛PBS溶液固定細(xì)胞10～15 min。再次用PBS洗滌兩次后，將細(xì)胞與SAβ-Gal染色溶液［1 g/L X-Gal、40 mmol/L Na3C6H5O7·2H2O、5 mmol/L K4Fe（CN）6·3H2O、5 mmol/L K3Fe（CN）6、150 mmol/L NaCl和2 mmol/L MgCl2溶于pH 6.0的PBS中］在37℃無(wú)CO2的培養(yǎng)箱中孵育過夜。通過常規(guī)光學(xué)顯微鏡檢測(cè)藍(lán)色的衰老細(xì)胞，計(jì)算各組陽(yáng)性衰老細(xì)胞的百分比，并進(jìn)行顯著性分析。

2.5 ROS和NO的檢測(cè) 為了測(cè)量細(xì)胞ROS，將細(xì)胞與5μmol/L DHE工作溶液孵育20 min，用熒光顯微鏡采集熒光信號(hào)圖像檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。為了檢測(cè)NO，將HUVECs用不含Ca2+的PBS輕輕洗滌2次，然后將細(xì)胞與含有5μmol/L DAF-2DA的Krebs-Ringer碳酸氫鹽溶液（mmol/L：NaCl 118，KCl 4.7，CaCl22.5，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325，EDTA 0.026，葡萄糖5.5）孵育30 min。然后將細(xì)胞洗滌3次，并用熒光顯微鏡采集熒光信號(hào)圖像，熒光強(qiáng)度通過ImageJ軟件（NIH）定量。

2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集不同實(shí)驗(yàn)條件下的細(xì)胞或者組織樣品，加入蛋白裂解液，冰上放置40 min，4℃下12 000 r/min離心15 min，取上清。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法對(duì)上清進(jìn)行蛋白定量。取20μg蛋白樣品，行10%SDS-PAGE，100 V轉(zhuǎn)移1 h至PVDF膜，用封閉溶液（含有5%脫脂奶粉的PBS緩沖液）在室溫下封閉膜1 h，或在4℃下封閉過夜。用適當(dāng)稀釋度的Ⅰ抗在5%封閉溶液中4℃過夜孵育膜，或在室溫下孵育2 h。用TBST洗滌膜5 min×3次。根據(jù)推薦的稀釋度，將遠(yuǎn)紅光/紅外Alexa Fluor熒光標(biāo)記的Ⅱ抗稀釋在含5%封閉緩沖液的TBST中，然后室溫孵育膜1 h。用TBST洗滌膜5 min×3次，然后用TBS沖洗，隨后用清水沖洗膜，室溫晾干，最后用熒光Li-COROdyssey成像儀檢查目標(biāo)蛋白信號(hào)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在所有實(shí)驗(yàn)中，n表示進(jìn)行的單個(gè)實(shí)驗(yàn)的次數(shù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用Student’st檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間L-精氨酸補(bǔ)充對(duì)HUVECs中ROS和NO產(chǎn)生及細(xì)胞衰老的影響

在年輕的內(nèi)皮細(xì)胞中，與人體正常生理濃度0.1 mmol/L相比，0.5 mmol/L的L-精氨酸短時(shí)間（2 h）處理顯著促進(jìn)了HUVECs中NO的上升（P<0.01），但對(duì)ROS和細(xì)胞衰老沒有影響，見圖1。在長(zhǎng)時(shí)間（8 d）補(bǔ)充條件下，與0.1 mmol/L L-精氨酸處理的細(xì)胞相比，0.5 mmol/L的L-精氨酸處理導(dǎo)致ROS含量上升、NO水平下降和衰老標(biāo)志物SA-β-Gal活性升高（P<0.01），這些現(xiàn)象均是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和衰老的表現(xiàn)，見圖2。該結(jié)果表明，短時(shí)間L-精氨酸補(bǔ)充至0.5 mmol/L可以增加NO的水平，有利于心血管疾病的改善；然而，長(zhǎng)時(shí)間的L-精氨酸補(bǔ)充不但沒有增加NO的作用，反而使其降低，同時(shí)ROS和細(xì)胞衰老指標(biāo)也顯著增加，即長(zhǎng)時(shí)間的L-精氨酸補(bǔ)充會(huì)產(chǎn)生一定的副作用。

Figure 1.The effects of short-time（2 h）L-arginine supplementation on the ROSand NO production，and senescence of HUVECs.A：DHE and DAF-2DA staining for detection of ROS（red）and NO（green），respectively（scale bar=200μm）；B：SA-β-Gal staining（scale bar=200μm）.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs0.1 mmol/L group.圖1 短時(shí)間（2 h）L-精氨酸補(bǔ)充對(duì)HUVECs中ROS和NO產(chǎn)生及細(xì)胞衰老的影響

Figure 2.The effects of long-time（8 d）L-arginine supplementation on the ROSand NO production，and senescence of HUVECs.A：DHE and DAF-2DA staining for detection of ROS（red）and NO（green），respectively（scale bar=200μm）；B：SA-β-Gal staining（scale bar=200μm）.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs0.1 mmol/L group.圖2 長(zhǎng)時(shí)間（8 d）L-精氨酸補(bǔ)充對(duì)HUVECs中ROS和NO產(chǎn)生及細(xì)胞衰老的影響

2 短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間L-精氨酸補(bǔ)充對(duì)HUVECs中Arg-I表達(dá)及S6K1/S6信號(hào)通路活化的影響

在年輕的內(nèi)皮細(xì)胞中，與0.1 mmol/L組相比，短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間補(bǔ)充0.5mmol/L L-精氨酸均能促進(jìn)S6K1-S6磷酸化（P<0.05或P<0.01）；不同的是，長(zhǎng)時(shí)間處理同時(shí)增加Arg-I蛋白表達(dá)量，見圖3。該結(jié)果表明L-精氨酸長(zhǎng)期補(bǔ)充可激活mTORC1-S6K1和Arg-I信號(hào)通路，這可能是L-精氨酸影響內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制。

Figure 3.The effects of short-term（A）and long-term（B）L-arginine supplementation on the expression of Arg-I and activation of S6K1/S6 signaling pathway in the HUVECs.The protein levels of Arg-I，S6K1，S6，phosphorylated S6K1（S6K1-T389）and phosphorylated S6（S6-S235/236）were detected by Western blot.Tubulin served as loading control.Mean±SEM.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs0.1 mmol/L group.圖3 短時(shí)間（2 h）和長(zhǎng)時(shí)間（8 d）L-精氨酸補(bǔ)充對(duì)HUVECs中Arg-I表達(dá)及S6K 1信號(hào)通路活化的影響

3 Arg-I過表達(dá)促進(jìn)S6K1/S6信號(hào)通路激活和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙

在正常濃度L-精氨酸的培養(yǎng)條件下，用重組腺病毒CMV啟動(dòng)子過表達(dá)Arg-I。如圖4所示，當(dāng)Arg-I表達(dá)量顯著升高以后，S6K1和S6蛋白的磷酸化水平顯著升高（P<0.01）。該結(jié)果表明，Arg-I在mTORC1信號(hào)通路的上游，長(zhǎng)時(shí)間的0.5 mmol/L L-精氨酸補(bǔ)充首先導(dǎo)致Arg-I升高，然后進(jìn)一步激活mTORC1-S6K1信號(hào)通路。

Figure 4.Overexpression of Arg-I promoted the phosphorylation of S6K1 and S6.The protein levels of Arg-I，S6K1 and S6，phos‐phorylated S6K1（S6K1-T389）and phosphorylated S6（S6-S235/236）were detected by Western blot.Tubulin served as loading control.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group.圖4 Arg-I過表達(dá)促進(jìn)S6K 1和S6磷酸化

另外，功能分析實(shí)驗(yàn)證明，過表達(dá)Arg-I同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致HUVECs中ROS升高、NO下降和衰老細(xì)胞增加，表明Arg-I可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，見圖5。

Figure 5.Overexpression of Arg-I induced ROSincrease，NO decrease and cellular senescence.A：DHE and DAF-2DA staining for detection of ROS（red）and NO（green），respectively（scale bar=200μm）；B：SA-β-Gal staining（scale bar=200μm）.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group.圖5 Arg-I過表達(dá)導(dǎo)致ROS增加、NO含量下降和細(xì)胞衰老

4 長(zhǎng)時(shí)間L-精氨酸補(bǔ)充通過激活A(yù)rg-I/S6K1信號(hào)通路引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙

我們?cè)谘a(bǔ)充精氨酸（0.5 mmol/L）的培養(yǎng)基中，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒rAd/U6-shRNA達(dá)到敲減Arg-I的目的。如圖6所示，在長(zhǎng)期L-精氨酸（0.5 mmol/L，8 d）處理后，與對(duì)照組相比，Arg-I的蛋白表達(dá)量顯著下降，表明敲減成功；同時(shí)，S6K1和S6的磷酸化水平也顯著下降（P<0.01）。

Figure 6.Silencing of Arg-I inhibited the phosphorylation of S6K1 and S6 induced by long-term L-arginine supplementation.The pro‐tein levels of Arg-I，S6K1，S6，phosphorylated S6K1（S6K1-T389）and phosphorylated S6（S6-S235/236）were detected by Western blot.Tubulin served as loading control.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group.圖6 敲減Arg-I表達(dá)抑制長(zhǎng)時(shí)間L-精氨酸補(bǔ)充引起的S6K1和S6磷酸化

此外，敲減Arg-I的表達(dá)可以明顯減輕長(zhǎng)時(shí)間L-精氨酸補(bǔ)充導(dǎo)致的HUVECs功能障礙和衰老。在Arg-I敲減組，ROS水平顯著下降，NO水平顯著升高，衰老細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.01），見圖7。該結(jié)果表明，Arg-I參與了長(zhǎng)期服用L-精氨酸引起的有害作用，這種毒害作用的機(jī)制是通過激活A(yù)rg-I/S6K1-S6信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

討 論

自從發(fā)現(xiàn)L-精氨酸是內(nèi)皮細(xì)胞eNOS產(chǎn)生血管保護(hù)性分子NO的唯一底物以來(lái)，人們對(duì)精氨酸補(bǔ)充劑進(jìn)行了數(shù)十年的研究，以促進(jìn)包括人在內(nèi)的不同模式生物體內(nèi)NO的產(chǎn)生。但是，我們和他人的結(jié)果均表明，長(zhǎng)期服用L-精氨酸對(duì)心血管系統(tǒng)是有害的。然而，該現(xiàn)象的潛在機(jī)制仍不清楚。

在本研究中，短時(shí)間L-精氨酸補(bǔ)充顯著增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的NO水平，而長(zhǎng)期補(bǔ)充則會(huì)顯著導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞衰老和NO產(chǎn)生減少，并上調(diào)Arg-I表達(dá)以及激活mTORC1-S6K1信號(hào)通路，Arg-I基因敲減則可以抑制這一現(xiàn)象。大量研究已表明，mTORC1-S6K1信號(hào)通路激活會(huì)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、衰老和炎癥反應(yīng)［28-29］。另外，高表達(dá)的Arg-I也會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞障礙［6，30-31］。因此，這些結(jié)果揭示了長(zhǎng)時(shí)間L-精氨酸補(bǔ)充對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有害作用是通過上調(diào)Arg-I，然后進(jìn)一步正調(diào)控mTORC1-S6K1活性，導(dǎo)致S6K1持續(xù)活化，最終影響細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。在實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)L-精氨酸短時(shí)間處理可快速激活mTORC1-S6K1，但不影響Arg-I表達(dá)，這一現(xiàn)象很可能是由Rag GTPases介導(dǎo)的［32-33］。然而，長(zhǎng)時(shí)間L-精氨酸補(bǔ)充是如何上調(diào)Arg-I以及Arg-I激活mTORC1-S6K1的詳細(xì)機(jī)制仍有待研究。精氨酸酶的另一同工酶Arg-II被報(bào)道也可以通過mTORC1-S6K1信號(hào)通路引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，其激活機(jī)制是通過肌球蛋白1b引起溶酶體的空間位移而解除TSC1/2對(duì)mTORC1的抑制［34］。Arg-I和Arg-II同屬于精氨酸酶，Arg-I對(duì)mTORC1-S6K1的激活機(jī)制極有可能與Arg-II相似，但由于Arg-I和Arg-II在細(xì)胞中存在位置不一樣，Arg-I存在于細(xì)胞質(zhì)中，Arg-II存在于線粒體中，兩種酶激活mTORC1信號(hào)通路的機(jī)制也有可能不一樣。研究表明，Rag GTPases通過與mTORC1復(fù)合體中的Raptor相互作用參與mTORC1的激活［32-33］，因此Arg-I也有可能直接或間接通過調(diào)節(jié)Rag GTPases的活性或者與其相互作用，從而影響mTORC1的激活，然而這需要進(jìn)一步的探索和驗(yàn)證。

Figure 7.Silencing of Arg-I attenuated the endothelial dysfunction induced by long-term L-arginine supplementation.A：DHE and DAF-2DA staining for detection of ROS（red）and NO（green），respectively（scale bar=200μm）；B：SA-β-Gal staining（scale bar=200μm）.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs control group.圖7 敲減Arg-I表達(dá)減輕長(zhǎng)時(shí)間L-精氨酸補(bǔ)充導(dǎo)致的HUVEC功能障礙

總之，我們的研究證明了L-精氨酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生有益或有害作用的證據(jù)，這取決于補(bǔ)充的持續(xù)時(shí)間。這些發(fā)現(xiàn)不僅可以解釋文獻(xiàn)中報(bào)道的補(bǔ)充L-精氨酸對(duì)血管作用的矛盾或不一致的結(jié)果，而且可以提供對(duì)心血管疾病患者不良臨床后果的機(jī)制性見解。因此，L-精氨酸補(bǔ)充劑與mTORC1-S6K1的抑制相結(jié)合可以保留對(duì)NO產(chǎn)生的有益作用，同時(shí)減少長(zhǎng)期L-精氨酸補(bǔ)充對(duì)內(nèi)皮的有害作用，這可能是L-精氨酸補(bǔ)充劑一種新的治療選擇，而靶向Arg-I也為心血管疾病的治療提供有效策略。