劉近發(fā)，庹 鵬，謝潔紅，吳亞芬，王壽平

（廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510150）

在病原微生物感染期間，機體不僅會發(fā)熱，還可能表現(xiàn)出一系列行為變化，如活動減少、食欲降低、社交退縮、認知功能障礙及抑郁樣、焦慮樣的情緒變化，統(tǒng)稱“疾病行為”（sickness behavior）［1］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要免疫刺激成分，在動物身上施用LPS會觸發(fā)細胞因子的釋放，從而激活先天性免疫系統(tǒng)，并通過多種途徑將炎癥信號傳至大腦，誘導中樞神經炎癥的發(fā)生，最終導致疾病行為［2-3］。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是一種由NLRP3、含胱天蛋白酶募集結構域的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和胱天蛋白酶1前體（procaspase-1）組成的細胞溶質蛋白復合物，在對微生物感染和內源性危險信號的反應中組裝和激活后，驅動和介導神經炎癥反應，加速神經退行性疾病的進展［4-5］。有研究表明，非甾體抗炎藥（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）可以通過抑制NLRP3炎癥小體的激活，在一定程度上減輕中樞神經炎癥反應，降低認知功能障礙的嚴重程度，延緩阿爾茨海默病等神經退行性疾病的進展［6-7］。帕瑞昔布鈉（parecoxib sodium，PA）是NSAIDs中一種選擇性環(huán)加氧酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑，通過特異性抑制COX-2轉化為前列腺素（prosta‐glandins，PGs）而起到良好的抗炎、解熱和鎮(zhèn)痛作用。PA能透過血腦屏障［8］，已被證實PA在腦缺血-再灌注損傷動物模型中發(fā)揮神經保護的作用［9］，但關于PA在炎癥性腦損傷中所介導的保護機制缺乏相關研究。本實驗通過腹腔注射LPS建立小鼠疾病行為模型，預先給予PA治療，探究其對小鼠認知功能和神經炎癥的影響及可能的作用機制。

材料和方法

1 動物

SPF級C57BL/6J雌性小鼠80只，10～12月齡，20～30 g，均購自廣東省實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2013-0002。所有小鼠飼養(yǎng)于12h/12h明暗周期，溫度25°C，濕度30%的環(huán)境中，自由飲水進食，使用滅菌飼料和墊料。所有的實驗操作均經廣州醫(yī)科大學實驗動物中心倫理委員會批準，并嚴格按照廣州醫(yī)科大學實驗動物中心指南進行。

2 主要試劑

LPS（大腸桿菌來源，批號L2880）購自Sigma；PA購自輝瑞制藥有限公司；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子α（tumor ne‐crosis factor-α，TNF-α）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA試劑盒均購自安迪華泰（中國）生物科技有限公司；兔抗離子鈣接頭蛋白分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1，Iba-1）抗體（貨號ab178847）、兔抗膠質細胞原纖維酸性蛋白（glial fi‐brillary acid protein，GFAP）抗體（貨號ab207165）、兔抗COX-2抗體（貨號ab15191）和兔抗誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體（貨號ab15323）購自Abcam公司；兔抗NLRP3多克隆抗體（貨號A12694）、兔抗ASC多克隆抗體（貨號A11433）和兔抗caspase-1多克隆抗體（貨號A0964）購自ABclonal；Ⅱ抗Alexa Fluor 488（驢抗兔）購自Molecular Probes；BCA蛋白定量試劑盒和ECL化學發(fā)光液購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

3 主要方法

3.1 動物分組和給藥 采用隨機數字法將80只C57BL/6J小鼠分為4組：空白對照（control，CON）組、PA組、LPS組和PA預處理組（P+L組），每組20只。LPS組和P+L組參照文獻［10］腹腔注射LPS（250μg·kg-1·d-1），持續(xù)7 d；P+L組每天在注射LPS前1 h參照文獻［11］按10 mg/kg劑量腹腔注射PA；CON組和PA組則分別腹腔注射等量的生理鹽水和PA。

3.2 Morris水迷宮實驗 包括定位航行實驗和空間探索實驗。Morris水迷宮是一個直徑120 cm，高100 cm，內壁為黑色的圓形水池，直徑10 cm的圓形黑色平臺置于水面下1 cm，水溫控制在（22±1）℃。小鼠前5 d先進行定位航行實驗，將小鼠面向池壁分別從4個象限放入水中，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間（逃避潛伏期，escape latency）。如果時間超過60 s，則引導引導小鼠到平臺上，讓其停留10 s。每只小鼠結束實驗后擦干，在暖風下烘干5 min，放回鼠籠。小鼠于第6天進行空間探索實驗，平臺所在象限為目標象限，把平臺撤離，將小鼠由目標象限的對側放入水中，記錄其逃避潛伏期、60 s內在目標象限的停留時間及穿越平臺的次數。

3.3 ELISA檢測血液和海馬區(qū)炎癥因子水平 每組小鼠于實驗第7天水迷宮實驗結束后選取8只，按20 mL/kg的麻醉劑量腹腔注射3%三溴乙醇，剪開胸腔暴露心臟，經左心室采血收集血液1mL于EP管中，室溫放置2 h后以3 000 r/min離心10 min，取上清液。將小鼠迅速斷頭取腦，冰面上剝離海馬組織并稱重，按重量體積比（1∶9）向組織中加入預冷PBS制備組織勻漿，在4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。嚴格按照ELISA試劑盒說明書提供的步驟分別檢測各樣本血液和海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-18、TNFα和PGE2的水平。

3.4 肺組織和海馬組織的形態(tài)學觀察 第7天水迷宮實驗結束后每組小鼠選取3只，麻醉后用預冷的生理鹽水和4%多聚甲醛經左心室依次灌注5 min至流出液澄清，取肺組織和大腦海馬組織，經Bouin氏液固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5μm切片。切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精復水，行HE染色，蘇木精染細胞核，伊紅染細胞質，最后脫水封片，在顯微鏡下觀察肺組織和海馬的形態(tài)改變。

3.5 免疫熒光染色法 第7天水迷宮實驗結束后每組小鼠選取4只，按上述方法取大腦組織，浸泡在PFA中固定過夜，行蔗糖梯度脫水后連續(xù)冰凍切片，切片厚度為20μm，加入5%BSA于室溫下封閉1h，加入已稀釋至濃度1∶1 000的Ⅰ抗，放入4℃冷室中孵育過夜。次日棄去Ⅰ抗，PBST清洗1次、PBS清洗2次后加入相應的Ⅱ抗，于室溫下孵育2 h，再次用PBST清洗1次、PBS清洗2次，用含DAPI的熒光封片劑進行封片，最后在蔡司熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3.6 Western blot實驗 取每組剩余的5只小鼠，按上述方法提取海馬組織，稱重，加入蛋白裂解液勻漿，靜置30 min后在4℃、15 000 r/min離心1 h，取上清液，用BCA法進行蛋白定量，取上樣量為20μg，進行SDS-PAGE，將蛋白轉移至PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉TBS溶液室溫封閉2 h后加入Ⅰ抗（除GADPH抗體以1∶8 000稀釋外，其余抗體以1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。次日用TBST溶液洗膜10 min×3次，將膜浸入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗溶液（1∶5 000）中室溫震蕩孵育2 h，TBST溶液洗膜10 min×3次。隨后ECL化學發(fā)光法顯色，在熒光凝膠成像系統(tǒng)中顯影，攝片，再用ImageJ軟件分析灰度值。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Morris水迷宮實驗結果

在定位航行實驗中，第1～3天各組小鼠的逃避潛伏期無顯著差異，在第4～5天的訓練中，LPS組小鼠到達平臺的逃避潛伏期顯著長于CON組（P<0.05），而PA治療改善了這一情況，P+L組與LPS組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1。

Figure 1.The spatial learning ability of mice in the place navi‐gation test of Morris water maze.Mean±SD.n=20.*P<0.05 vs CONgroup；#P<0.05 vs P+L group.圖1 各組小鼠在Morris水迷宮定位航行實驗中的空間學習能力

在第6天的空間探索實驗中，撤去平臺，各組小鼠之間游泳速度的差異無統(tǒng)計學顯著性；與CON組相比，LPS組小鼠的逃避潛伏期顯著延長（P<0.01），60 s內目標象限停留時間及穿越平臺次數顯著減少（P<0.01）；與LPS組相比，P+L組小鼠的逃避潛伏期顯著縮短（P<0.05），60 s內目標象限停留時間及穿越平臺次數顯著增加（P<0.05），見表1。

表1 各組小鼠在Morris水迷宮空間探索實驗中的結果Table 1.The results of each group in the spatial probe test of Morris water maze（Mean±SD.n=20）

2 小 鼠 血 清及 海馬 組織 中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α和PGE2的檢測結果

ELISA結果顯示，LPS組小鼠血清及海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α和PGE2的含量明顯高于CON組（P<0.01），而與LPS組相比，P+L組小鼠血清及海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α和PGE2的含量顯著減少（P<0.01），結果見表2、3。

表2 各組小鼠血清炎癥因子的表達水平Table 2.The serumlevels of inflammatory factors in the mice of each group（ng/L.Mean±SD.n=8）

表3 各組小鼠海馬區(qū)炎癥因子的表達水平Table 3.Expression levels of inflammatory factors in the mouse hippocampus of each group（ng/L.Mean±SD.n=8）

3 小鼠肺組織和海馬組織形態(tài)學觀察

如圖2所示，各組小鼠肺組織整體結構正常，肺泡結構清晰，肺泡壁無明顯增厚，未見明顯的炎癥細胞浸潤，提示小劑量腹腔注射LPS并未引起肺部的明顯炎癥。如圖3所示，與對照組相比，PA組海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)正常，結構完整，無明顯病理性損傷，提示PA對海馬神經元本身無損傷作用；而LPS組神經元細胞間結構松散，排列紊亂，胞體縮小、胞核固縮、細胞深染，出現(xiàn)大量變性神經元；與LPS組相比，P+L組神經元形態(tài)較完整，排列較規(guī)整緊密，著色均勻，胞核固縮濃染減輕，損傷較輕。

Figure 2.Representative photographs of HEstaining for lung tissuesin different groups（×200）.圖2 各組小鼠肺組織HE染色的病理觀察

Figure 3.Representative photographs of HEstaining for hippocampus CA1 region in different groups.圖3 各組小鼠海馬組織CA1區(qū)HE染色的病理觀察

4 小鼠海馬組織免疫熒光染色結果

如圖4、5所示，與CON組相比，經LPS處理小鼠海馬區(qū)Iba1（小膠質細胞特異性標志物）陽性細胞明顯增多（P<0.05），GFAP（星形膠質細胞特異性標志物）陽性細胞分布密集（P<0.05），提示在炎癥刺激條件下海馬活化的小膠質細胞和星形膠質細胞增多；而與LPS組相比，P+L組小鼠Iba1陽性細胞和GFAP陽性細胞均顯著減少（P<0.05），提示PA通過抑制LPS對海馬小膠質細胞和星形膠質細胞的激活，從而抑制中樞炎癥反應，減輕小鼠的認知功能障礙。

Figure 4.Immunofluorescence staining of Iba-1 in the mouse hippocampus（×20）.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs CON group；#P<0.05 vs LPSgroup.圖4 各組小鼠海馬組織中Iba-1免疫熒光染色情況

5 Western blot實驗結果分析

如圖6所示，與CON組相比，LPS組小鼠海馬區(qū)COX-2、iNOS、NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達量顯著上調（P<0.01）；與LPS組相比，P+L組小鼠海馬區(qū)COX-2、iNOS、NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達量顯著下降（P<0.05），提示PA預給藥能降低小鼠海馬區(qū)炎癥相關蛋白的表達，從而抑制中樞炎癥。

討 論

Figure 5.Immunofluorescence staining of GFAP in the mouse hippocampus（×20）.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs CON group；#P<0.05 vs LPSgroup.圖5 各組小鼠海馬組織中GFAP免疫熒光染色情況

Figure 6.Western blot analysis of inflammatory proteins COX-2，iNOS，NLRP3，ASC and caspase-1 in the mouse hippocampus.Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs CONgroup；#P<0.05，##P<0.01 vs LPSgroup.圖6 小鼠海馬組織中COX-2，iNOS，NLRP3，ASC和caspase-1的蛋白表達

目前，許多神經退行性疾病的發(fā)病機制尚不明確，并且缺乏對這些疾病的有效治療。因此，建立合適的動物模型對于研究神經炎癥相關的認知障礙和神經退行性疾病非常重要。作為革蘭氏陰性菌的主要成分，LPS被廣泛用于研究全身內毒素血癥和炎癥反應對組織的影響，施用LPS會導致血腦屏障的損傷和神經炎癥的發(fā)生［12］。本研究選擇外周少量多次注射LPS誘導小鼠中樞神經炎癥，通過觀察肺組織病理切片，排除了肺部明顯炎癥，避免了大劑量LPS所造成的肺損傷導致的低氧血癥對認知功能的干擾。

小鼠全身注射LPS會導致認知功能缺陷，包括空間學習和記憶障礙［13］。Morris水迷宮實驗是目前用來評價小鼠空間學習記憶功能最為經典和廣泛的行為學測試方法。有研究表明使用NASIDs治療可減輕小鼠的神經炎癥從而改善認知功能［14］。水迷宮實驗結果顯示，LPS組小鼠的逃避潛伏期顯著延長，目標象限停留時間及穿越平臺次數顯著減少，提示腹腔注射LPS使小鼠海馬依賴性的學習與記憶功能受損。而經PA干預后改善了小鼠的學習記憶功能，降低了認知功能障礙的程度。

小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)中主要的先天免疫細胞，在免疫監(jiān)視、維持中樞神經系統(tǒng)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、清除受損神經元和碎片以及組織修復中發(fā)揮關鍵作用。在病理狀態(tài)下，小膠質細胞的異常激活可通過釋放神經毒性物質引發(fā)過度的神經炎癥反應，從而導致神經元損傷和認知功能障礙［15］。LPS與小膠質細胞膜表面的Toll樣受體4結合，相互作用激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶信號通路，從而觸進促炎細胞因子的表達和釋放，包括IL-1β、IL-6和TNF-α［16］。活化的小膠質細胞還可以通過分泌IL-1β、TNF和C1q誘導反應型星形膠質細胞的活化，兩者相互協(xié)作，共同發(fā)揮促炎作用，從而產生瀑布式炎癥級聯(lián)反應，最終導致疾病行為的發(fā)生［17］。研究表明，COX-2的表達增加參與調控神經炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，在機體感染的情況下COX-2過表達催化PGs特別是PGE2產生增加的過程中，一方面刺激膠質細胞釋放更多的細胞毒性因子加重全身炎癥反應，另一方面產生大量的氧自由基，通過介導興奮神經毒性作用和氧化應激機制造成神經元的損傷［18］。NOS是合成一氧化氮（ni‐tric oxide，NO）的關鍵酶，其中iNOS亞型在正常情況下極少表達，但在炎癥損傷的刺激下被誘導合成增加，催化產生大量NO，導致細胞死亡和組織損傷，進而加重神經炎癥反應。通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)在LPS誘導的炎癥模型小鼠中，海馬區(qū)活化的小膠質細胞和星形膠質細胞明顯增多，COX-2、PGE2和iNOS等促炎介質的蛋白表達量顯著增多，中樞和外周的IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子水平明顯增加，HE染色顯示海馬神經元細胞出現(xiàn)過度變性壞死的病理損傷；而經PA預處理后，小鼠的神經炎癥得到了改善，海馬區(qū)活化的膠質細胞減少，炎癥因子和促炎介質的表達水平降低，海馬體的病理損傷減輕，表明PA在LPS誘導的中樞神經炎癥中發(fā)揮神經保護作用。

炎癥小體是一種主要位于中樞神經系統(tǒng)的多蛋白復合物，已在神經細胞、小膠質細胞和星形膠質細胞中被發(fā)現(xiàn)［19］。其中，NLRP3炎癥小體是目前被研究最為廣泛和最具特征的炎癥小體，已被證實在阿爾茲海默病、帕金森病、膿毒癥腦病等神經退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用［20-22］。NLRP3炎癥小體是由NLRP3、ASC和procaspase-1三部分組成。由病原相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）或微生物相關分子模式（microbe-as‐sociated molecular pattern，MAMP）刺激介導的信號促進NLRP3寡聚化并激活，NLRP3蛋白激活后與接頭蛋白ASC結合并募集procaspase-1組裝形成NLRP3炎癥小體，隨后發(fā)生剪切形成有活性的cas‐pase-1，后者切割不成熟的IL-1β前體（pro-IL-1β）和IL-18前體（pro-IL-18），使其活化成IL-1β和IL-18并分泌到胞外，啟動多個信號通路并驅動炎癥級聯(lián)反應［23］。我們發(fā)現(xiàn)經LPS組小鼠海馬組織中NLRP3炎癥小體各組成蛋白的表達水平明顯升高，中樞和外周炎癥因子IL-1β和IL-18顯著增多，提示LPS誘導了NLRP3炎癥小體的激活。有研究報道COX-2可以通過增加NF-κB的激活和受損線粒體活性氧簇的產生，介導NLRP3炎癥小體的激活增加，而抑制COX-2/NF-κB/NLRP3信號通路對急性肺損傷小鼠起保護作用［24-25］。本實驗經PA預給藥后海馬區(qū)NLRP3炎癥小體激活減少，炎癥因子IL-1β和IL-18水平降低，疾病行為樣癥狀減輕，學習記憶能力改善。

綜上所述，PA預先給藥通過抑制小膠質細胞和星形膠質細胞的活化及炎癥因子和促炎介質的釋放，減少NLPR3炎癥小體的激活，減輕海馬組織的病理損傷，最終抑制LPS誘導的認知功能損傷及神經炎癥反應，在體內發(fā)揮抗炎和神經保護作用。