王艷玲，陳小燕，余 強(qiáng)，張慶華，王忠銘，袁振宏

低共熔溶劑在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用*

王艷玲1,2,3,4，陳小燕2,3,4，余 強(qiáng)2,3,4?，張慶華1?，王忠銘2,3,4，袁振宏2,3,4

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045；2. 中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，廣州 510640；3. 中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；4. 廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

低共熔溶劑（DES）已被證明是傳統(tǒng)有機(jī)溶劑以及離子液體的良好替代溶劑，具有低熔點(diǎn)、低揮發(fā)性、合成簡(jiǎn)單、易回收、成本低等特點(diǎn)。本文介紹了DES的生物毒性和生物降解性，綜述了DES在生物催化和微生物轉(zhuǎn)化方面的研究進(jìn)展，簡(jiǎn)單討論了DES在酶促反應(yīng)中的作用機(jī)理，為新型DES的設(shè)計(jì)提供參考，并對(duì)DES在生物轉(zhuǎn)化方面的工作做出了展望。

低共熔溶劑；生物催化；微生物轉(zhuǎn)化

0 引 言

綠色化學(xué)的宗旨之一是減少生化工藝過程中產(chǎn)生的環(huán)境毒性，傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑不可避免存在著高揮發(fā)性、易燃性、不可回收以及對(duì)生物催化反應(yīng)的抑制作用[1]。因此，尋找安全環(huán)保的替代溶劑受到了越來(lái)越多的關(guān)注[2]。離子液體因其蒸汽壓低沒有揮發(fā)性而被作為傳統(tǒng)溶劑的替代溶劑[3]，但由于離子液體價(jià)格昂貴、合成復(fù)雜、對(duì)環(huán)境污染性大以及許多成分（例如四烷基銨和二烷基咪唑）的生物降解性差[4]，不利于社會(huì)的可持續(xù)性發(fā)展。

近年來(lái)，類離子液體——低共熔溶劑（deep eutectic solvent, DES），因其具有與離子液體相近的特性，包括蒸氣壓低、生物降解性好、合成簡(jiǎn)單、理化性質(zhì)可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物、化學(xué)等各種領(lǐng)域[5]。DES是由氫鍵供體（hydrogen bond donor, HBD）和氫鍵受體（hydrogen bond receptor, HBA）以一定摩爾比混合加熱形成的均相透明溶液。研究發(fā)現(xiàn)，DES與許多生物材料（如核酸、酶和藥物）具有生物相容性，且在有機(jī)催化、生物轉(zhuǎn)化和分子提取方面均發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)作用[6-9]。針對(duì)以上特點(diǎn)，本文簡(jiǎn)述了DES的生物毒性和生物降解性，重點(diǎn)綜述了DES在生物催化與轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用與作用機(jī)制，并對(duì)其在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的工作進(jìn)行了展望。

1 DES的生物學(xué)特性

1.1 細(xì)胞毒性

DES由兩種或兩種以上物質(zhì)組成，且大多數(shù)是由環(huán)境友好的天然成分構(gòu)成（例如膽堿，是B族維生素中的一員）。因此，DES一般被認(rèn)為是無(wú)毒的、具有生物相容性的綠色溶劑，但在參與一些微生物生化轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，DES的細(xì)胞毒性往往是不可忽略的，表1列舉了近年來(lái)報(bào)道的DES的生物毒性研究情況。

2013年HAYYAN等[10]提出DES是否具有毒性的問題，并研究了以氯化膽堿（choline chloride, ChCl）為氫鍵受體，甘油、乙二醇、三甘醇和尿素為氫鍵供體的四種DES分別對(duì)金黃色葡萄球菌（）、枯草芽孢桿菌（）、大腸桿菌（）、銅綠假單胞菌（）以及鹵蟲藻（）有無(wú)毒性作用進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四種ChCl型DES對(duì)所研究的細(xì)菌均無(wú)毒性，而僅對(duì)鹵蟲藻有一定毒性且毒性因DES的氫鍵影響了化合物的結(jié)構(gòu)而遠(yuǎn)高于其單個(gè)成分。WEN等[11]在2015年的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)DES的這種抑制作用與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道一些含有有機(jī)酸的DES（如ChCl/檸檬酸）比氨基、醇基和糖基的DES對(duì)細(xì)菌的抑制作用更強(qiáng)[12]。RADO?EVI?等[13]研究了三種ChCl類DES對(duì)魚及人細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)的毒性作用，發(fā)現(xiàn)ChCl/甘油具有較低的細(xì)胞毒性（對(duì)兩種細(xì)胞均為EC50>10 mmol/L），而ChCl/草酸則表現(xiàn)出中度的細(xì)胞毒性。

表1 不同DES對(duì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的影響

綜上所述，DES的組成影響著溶劑的性質(zhì)和溶劑的利用領(lǐng)域，因此，可根據(jù)DES組成成分的物理化學(xué)特性合成具有特殊性質(zhì)的新型DES溶劑。研究表明，一些DES在一定程度上存在細(xì)胞毒性，但是由于所測(cè)試的生物體與在生物催化過程中使用的有所不同，這些研究具有一定的局限性，然而，對(duì)于一個(gè)典型的反應(yīng)，可以在前人研究的指導(dǎo)下估算所使用的DES對(duì)反應(yīng)中生物催化劑的影響[1]。因此，研究者可以在前人基礎(chǔ)上更加充分地了解以及利用DES的特性，對(duì)其參與的微生物轉(zhuǎn)化以及生物催化反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2 DES的生物降解性

被稱為“綠色溶劑”的 DES，大多數(shù)都是可生物降解的。目前，關(guān)于DES生物可降解性的數(shù)據(jù)較少，確定其生物降解潛力是非常必要的。RADO?EVI?等[13]采用密閉瓶法測(cè)試了以葡萄糖（glucose, Glu）、甘油（glycerin, Gly）和草酸（oxalic acid, OA）為氫鍵供體的三種ChCl類DES的生物降解性。實(shí)驗(yàn)表明生物降解程度為ChCl/Glu > ChCl/Gly > ChCl/OA，其中ChCl/Glu的生物降解率最高，為96%；ChCl/OA最低，為68%。

通常生物可降解化合物首先以各種方式通過細(xì)胞壁，如自由擴(kuò)散、易化擴(kuò)散或主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，然后通過酶的氧化作用，中間產(chǎn)物被代謝成水和二氧化碳或轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的組成物質(zhì)，這是氨基DES和糖基DES具有良好生物降解性的主要原因，其次，細(xì)菌細(xì)胞膜上也含有膽堿鹽陰離子運(yùn)輸?shù)膶佥d體。此外，DES的羥基、羧基和氨基是酶催化反應(yīng)的潛在位點(diǎn)，也可能會(huì)提高其生物降解能力[12]。但是一些具有短烷基側(cè)鏈的DES擁有較差的生物降解性[16]。

2 DES在酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用

酶催化反應(yīng)通常在條件較為溫和的水溶液中進(jìn)行，一般不需要常規(guī)化學(xué)有機(jī)合成中所需的官能團(tuán)活化和保護(hù)以及去保護(hù)的步驟，使得產(chǎn)物的合成時(shí)間更短，選擇性更高，能提供更高純度的產(chǎn)品，在能源和原材料制備方面更有效，比傳統(tǒng)方法產(chǎn)生的廢物更少[17]。但如果有機(jī)底物僅微溶于水，不利于酶催化反應(yīng)的進(jìn)行，則有必要開發(fā)新的酶催化反應(yīng)介質(zhì)，使得非水相酶催化反應(yīng)成為可能。目前許多DES被用于代替離子液體作為酶催化反應(yīng)的溶劑。與離子液體相比，DES更有利于環(huán)境保護(hù)以及節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本。在生物催化方面，已經(jīng)報(bào)道了幾種以DES為溶劑的酶催化過程，例如脂肪酶催化（反式）酯化和氨解反應(yīng)[18-19]。

除了作為酶催化反應(yīng)的溶劑外，DES也可以作為酶的激活劑，例如LEHMANN等[20]利用DES作為水溶液中的助溶劑來(lái)評(píng)估纖維素酶的活性和穩(wěn)定性。有研究發(fā)現(xiàn)DES中不同的氫鍵供體與氫鍵受體組成以及其摩爾比均會(huì)影響酶活性，通過選擇具有最佳化學(xué)性質(zhì)的DES，酶可以高度穩(wěn)定并被激活，例如HUANG等[7]的研究證明了醋酸膽堿/甘油（1∶2）可以作為穩(wěn)定劑而顯著提高脂肪酶的活性。表2列出了不同DES在一些酶催化中的應(yīng)用。

表2 DES在各種酶生物催化作用中的應(yīng)用

2.1 脂肪酶

脂肪酶（甘油三酯脂肪酶）是能夠催化水解油脂生成游離脂肪酸、甘油二酯、單甘酯和甘油的一類酶[29]。脂肪酶在工業(yè)生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用，例如生物柴油的制備，表面活性劑的合成[30-31]。大多數(shù)脂肪酶在有機(jī)溶劑中能夠保持良好的活性。ZHAO等[12]研究發(fā)現(xiàn)廉價(jià)、無(wú)毒的甘油/ChCl與脂肪酶有良好的生物相容性，可以作為大豆油制備柴油的酶促反應(yīng)介質(zhì)，并使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率達(dá)到了88%，而且反應(yīng)結(jié)束后回收的諾維信435脂肪酶仍可繼續(xù)使用至少4次。因此，這種新型DES可以很好地替代傳統(tǒng)有毒易揮發(fā)的有機(jī)溶劑。此外，研究表明脂肪酶在DES中的活性取決于酶和底物的類型。ELGHARBAWY等[32]揭示了DES在脂肪酶催化的水解反應(yīng)中作為助溶劑和主溶劑的潛在作用。他們利用ChCl與甘油和丙二酸以及糖（葡萄糖、果糖和蔗糖）等組合，試驗(yàn)了6種不同脂肪酶，包括豬胰腺脂肪酶、玫瑰假絲酵母脂肪酶、洋蔥伯克霍爾德氏菌脂肪酶、尼氏根霉脂肪酶、丙烯酸樹脂南極假絲酵母脂肪酶、固定珠150上的南極假絲酵母脂肪酶B（lipase B, CALB），對(duì)對(duì)硝基苯棕櫚酸酯的水解作用。結(jié)果表明，由ChCl/蔗糖制備的DES效果最好，可使CALB和豬胰腺脂肪酶的活性分別提高到355%和345%；并且，動(dòng)力學(xué)研究證實(shí)脂肪酶在含有40%的DES中具有更高的催化效率（cat/m）。以上研究說明天然的DES可以作為脂肪酶催化反應(yīng)的溶劑來(lái)取代水反應(yīng)體系。

在ChCl或氯化乙胺與酰胺、羥基或酸等氫鍵供體配對(duì)的DES中，固定化的CALB具有較強(qiáng)活性[17]。然而，部分DES也會(huì)限制脂肪酶的活性。在DURAND等[18]的研究中，利用固定化的CALB為催化劑，進(jìn)行月桂酸乙烯酯的酯交換反應(yīng)，使用不同鏈長(zhǎng)的醇評(píng)估DES對(duì)底物極性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DES（ChCl/丙二酸、ChCl/乙二酸、ChCl/乙二醇）的組分在醇解過程中與底物發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，而且發(fā)現(xiàn)基于二羧酸或乙二醇的DES出現(xiàn)了副反應(yīng)，導(dǎo)致這些DES的使用受到一些限制。盡管如此，在大多數(shù)情況下，DES組分之間的氫鍵可以顯著降低其反應(yīng)活性。此外，ChCl/尿素和ChCl/甘油等DES具有較高的活性和選擇性，是脂肪酶催化反應(yīng)的理想溶劑，相對(duì)于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑，在DES中固定化CALB受醇鏈長(zhǎng)度的影響較小，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞最小。

2.2 纖維素酶

木質(zhì)纖維素作為一種常見生物質(zhì)主要是由復(fù)雜的碳水化合物組成，可轉(zhuǎn)化為糖而用于生產(chǎn)生物燃料[33]。DES是最近出現(xiàn)的新一代用于木質(zhì)纖維素預(yù)處理的類離子液體。然而，DES含有的鹽成分在后續(xù)的糖化過程中會(huì)使纖維素酶失活，從而降低整個(gè)系統(tǒng)的應(yīng)用性。因此，有必要評(píng)估DES?纖維素酶系統(tǒng)的適用性以改善這一問題。GUNNY等[22]研究了纖維素酶在特定DES存在下的穩(wěn)定性，進(jìn)行了葡萄糖生產(chǎn)、能量消耗和動(dòng)力學(xué)性能的適用性評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，在體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油基DES和乙二醇基DES存在下，纖維素酶能夠保留90%以上的活性。而在5%的丙二酸基DES中，酶活性僅剩原有的38%，濃度為10%時(shí)無(wú)酶活性，這可能是因?yàn)楸嶙鳛殛?yáng)離子與酶相互作用，導(dǎo)致構(gòu)象變化和酶的失活。此外，與稀堿預(yù)處理體系相比，兩種DES體系均表現(xiàn)出較高的葡萄糖轉(zhuǎn)化率和較低的能耗，且乙二醇基DES有較好的動(dòng)力學(xué)性能。GUNNY等[33]也闡明了DES對(duì)生物質(zhì)消化的穩(wěn)定性和協(xié)同作用，發(fā)現(xiàn)30℃時(shí)，工業(yè)纖維素酶在體積分?jǐn)?shù)為10%的DES中作用1 h后，其相對(duì)活性保持在90%以上，且預(yù)處理溫度越高，米糠制取單糖的效率越高。

2.3 其他類型酶

除了脂肪酶與纖維素酶兩種常用的酶，DES也會(huì)對(duì)一些其他酶的酶促反應(yīng)產(chǎn)生影響。例如胰凝乳蛋白酶，在ChCl/甘油混合物中對(duì)肽的合成具有很高的活性[23]。ChCl型DES經(jīng)生物催化有望成為合成多肽的新溶劑。DES對(duì)綠豆環(huán)氧化物酶水解環(huán)氧苯乙烯的不對(duì)稱反應(yīng)也有影響[25]，添加10%的ChCl/三聚乙二醇可以使產(chǎn)物的對(duì)映體（-苯基乙二醇）純度從 (83.2±1.3)%提高到 (87.9±0.3)%。當(dāng)DES添加量從10%增加到30%，對(duì)映體純度從87.9%增加到94%，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)，且10% ～ 30%的添加量不利于酶活性的恢復(fù)。

3 在DES中的微生物轉(zhuǎn)化

3.1 酵母菌

在一些微生物參與的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，添加DES的雙水相溶劑比單純水溶劑有更好的效果。當(dāng)?shù)孜镌谒械娜芙舛冗^低時(shí)，需要在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。這種利用微生物全細(xì)胞進(jìn)行的生物催化與直接使用分離酶相比，細(xì)胞為酶提供了一個(gè)自然的環(huán)境，允許輔因子再生，并防止酶在嚴(yán)苛條件下（例如在非水相等非常規(guī)的反應(yīng)介質(zhì)中）發(fā)生變性和失活[34]。表3總結(jié)了一些DES在微生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用情況。紅酵母菌（）屬于真菌界[35]，通常能夠還原低分子量酮（苯乙酮的衍生物）[36]以及酮酯[37]。BUBALO等[38]評(píng)價(jià)了膽堿類DES作為酵母菌將3-氧丁酸乙酯還原為3-羥基丁酸乙酯的反應(yīng)溶劑，發(fā)現(xiàn)此釀酒酵母菌與DES有良好的生物相容性，此外，氫鍵供體的類型和DES中的含水量對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率有較大影響，當(dāng)水的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，糖和醇類DES是還原反應(yīng)的最佳溶劑，其產(chǎn)率與磷酸鹽緩沖液相似（<93.0%），而在酸或酰胺類DES中，無(wú)論水含量如何，產(chǎn)率都很低（<49.3%）。

3.2 大腸桿菌

直接利用微生物進(jìn)行生物催化反應(yīng)能夠避免酶的分離等一系列復(fù)雜程序，但是由于全細(xì)胞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的存在，底物和酶的接觸并不充分，并且生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物無(wú)法快速流出，容易造成底物抑制[44]，降低目標(biāo)產(chǎn)物的收率。為了解決這一問題，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)酶與底物之間的結(jié)合，ZHANG等[45]使用離子液體和DES處理了大腸桿菌BL21-pET21a-rhaB1細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，利用蘆丁來(lái)生產(chǎn)異槲皮苷。研究發(fā)現(xiàn)，6%的ChCl/尿素處理后的大腸桿菌催化活性最高，且用此DES處理后細(xì)胞的穩(wěn)定性更強(qiáng)，這是由于處理后細(xì)胞的最佳pH接近中性且有耐高溫性，在最佳條件下，異槲皮苷的收率最高可達(dá)(93.05±1.3)%。此研究表明，利用ChCl/尿素處理大腸桿菌細(xì)胞可以提高細(xì)胞膜的通透性，從而提高細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化能力。

4 結(jié)論與展望

DES作為一種可生物降解溶劑，在生物質(zhì)酶的催化作用中可充當(dāng)溶劑和助溶劑以及酶的激活劑，DES可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，也可以使一些非水相酶的酶活性保持及應(yīng)用得以實(shí)現(xiàn)。DES在蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶的生物質(zhì)催化方面都有很好的協(xié)同作用。當(dāng)DES應(yīng)用于微生物的生物轉(zhuǎn)化過程中，DES能夠增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，加強(qiáng)底物與胞內(nèi)酶的接觸，減少底物抑制，縮短催化反應(yīng)的時(shí)間，提高產(chǎn)物的收率。DES在生物轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用為一些生物產(chǎn)品的回收提供了有效的途徑。然而，在DES對(duì)微生物活性的影響方面仍需做很多研究。例如在DES中所有使用脂肪酶的生物轉(zhuǎn)化都是在與溶劑親和力差的底物中進(jìn)行的，而在大多數(shù)情況下這種底物是惰性的，因此下一步可能會(huì)進(jìn)行在DES中對(duì)酶修飾的應(yīng)用。另外，在DES中進(jìn)行反應(yīng)的酶的固定化作用也需進(jìn)一步探討。其次，在選擇DES時(shí)，要盡量避免一些有害離子，而且一些酶的反應(yīng)中可能會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，導(dǎo)致反應(yīng)體系黏度增大，使得攪拌和回收變得困難，這也是一項(xiàng)需要繼續(xù)深入研究和解決的問題。

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Applications of Deep Eutectic Solvent in Biotransformation

WANG Yan-ling1,2,3,4, CHEN Xiao-yan2,3,4, YU Qiang2,3,4, ZHANG Qing-hua1, WANG Zhong-ming2,3,4, YUAN Zhen-hong2,3,4

(1. Jiangxi Engineering Laboratory for the Development and Utilization of Agricultural Microbial Resources, College of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China;2. Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510640, China; 3. CAS Key Laboratory of Renewable Energy, Guangzhou 510640, China; 4. Guangdong Provincial Key Laboratory of New and Renewable Energy Research and Development, Guangzhou 510640, China)

Deep eutectic solvent (DES) have been proved to be good alternatives for conventional organic solvents and ionic liquids. It has the characteristics of low melting point, low volatility, simple synthesis, easy recovery, and low preparation cost. In this review, the biotoxicity and biodegradability of DES was introduced, and the research progress of DES in biocatalysis and microbial transformation was summarized. Then, the mechanism of DES in enzymatic reaction was briefly discussed, which was helpful for the design of new DES. Finally, the prospect was presented on the future roles of DES in biotransformation.

deep eutectic solvents; biocatalysis; microbial transformation

TK6；Q50

A

10.3969/j.issn.2095-560X.2021.03.005

2095-560X（2021）03-0211-07

2021-03-08

2021-04-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51876206）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2018A030313012）；廣州市重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（202103000011）；廣東省特支計(jì)劃科技創(chuàng)新青年拔尖人才項(xiàng)目（2016TQ03N647）

余 強(qiáng)，E-mail：yuqiang@ms.giec.ac.cn；張慶華，E-mail：zqh_net@163.com

王艷玲（1996-），女，碩士研究生，主要從事木質(zhì)素的解聚與微生物轉(zhuǎn)化研究。

余 強(qiáng)（1983-），男，博士，研究員，主要從事生物質(zhì)解聚及轉(zhuǎn)化研究。

張慶華（1979-），男，博士，副教授，主要從事生物資源與環(huán)境工程研究。