李少華姜麗萍牛佳瑤王樂牛嗣云齊峰

(1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 新生兒科,河北 保定 071000；2.河北大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000；3.保定市第一醫(yī)院 呼吸科,河北 保定 071000)

中老年男性隨著睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞衰老及功能下降,生成睪酮的能力下降,臨床表現(xiàn)為性欲減退,肌肉體積和力量減小,內(nèi)臟脂肪增加,骨密度減少,情緒異常[1].傳統(tǒng)中藥在延緩衰老中發(fā)揮重要作用.現(xiàn)有研究表明,何首烏具有抗氧化、抗衰老以及神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[2],其中二苯乙烯苷為其主要特征性成分[3].胰島素/胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)信號通路在激素調(diào)節(jié)衰老中發(fā)揮重要作用[4],但二苯乙烯苷通過胰島素/IGF-1信號通路調(diào)節(jié)睪丸衰老的研究鮮有報(bào)道.因此,本研究從睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞著手,采用自由基氧化損傷的方法建立睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞的衰老模型,通過流式細(xì)胞術(shù)、RT-qPCR等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),探討二苯乙烯苷調(diào)節(jié)胰島素/IGF-1信號通路延緩大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞衰老的作用機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買(350±20)g的SPF級雄性Wistar大鼠(合格證號:No.1510063).根據(jù)中國科學(xué)技術(shù)部制定的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指導(dǎo)意見”及河北大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和倫理委員會的指導(dǎo)方針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理和實(shí)驗(yàn)的開展.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司),Ⅰ型膠原酶(美國Sigma公司),胎牛血清FBS(fetal bovine serum,以色列Biological Industries公司),DMEM/F12(美國Gibcos公司),β-半乳糖苷酶染色試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒和蛋白裂解緩沖液(中國Beyotime公司),RNA快速提取試劑盒(中國艾德萊公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司),兔源一抗(美國Santa公司),羊抗兔二抗(中國Proteintech公司).

1.3 二苯乙烯苷適宜用藥量的確定

濃度梯度設(shè)置為20、50、100、150、250μmol/L,作用于培養(yǎng)了48 h后處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,作用時(shí)間為24、48、72 h,酶標(biāo)儀檢測吸光度,采用MTT 法篩選出二苯乙烯苷作用于睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞的最適濃度為150μmol/L,作用時(shí)間為48 h.

1.4 睪丸間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

選用17～25 d齡的雄性Wistar大鼠(n＞3),無菌操作取兩側(cè)睪丸組織,置于Ⅰ型膠原酶中消化數(shù)分鐘,獲取睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞,使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),以1×106/m L的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種到FBS體積分?jǐn)?shù)為10%的DMEM/F12培養(yǎng)液中,置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱1h,更換新鮮培養(yǎng)液,48h后,鑒定睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞,3β-羥類固醇脫氫酶特異性染色液可使陽性細(xì)胞顯示灰色,經(jīng)過染色鑒定睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞純度超過97%[5].待細(xì)胞融合度達(dá)80%,按1∶2的比例對細(xì)胞繼代培養(yǎng),傳至第3代時(shí)進(jìn)行細(xì)胞爬片,培養(yǎng)48 h后備用.

1.5 睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞分組及氧化損傷法建立衰老模型

細(xì)胞分組:根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃檎＝M、衰老組和二苯乙烯苷組.

首先,按上述方法培養(yǎng)睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞,第3代傳至六孔板,每天同一時(shí)間加等量300μmol/L 的H2O2和100μmol/L的FeSO4刺激細(xì)胞2 h,連續(xù)刺激4 d；刺激結(jié)束后,衰老組在FBS體積分?jǐn)?shù)為10%的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d；二苯乙烯苷組則加入1.3μL 二苯乙烯苷,在含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d；正常組總培養(yǎng)時(shí)間需與衰老組和二苯乙烯苷組保持一致,在FBS體積分?jǐn)?shù)為10%的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d.進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色和細(xì)胞周期的檢測以鑒定細(xì)胞衰老模型,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.6 檢測睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞中胰島素/IGF-1信號通路關(guān)鍵因子的表達(dá)情況

1.6.1 RT-qPCR 檢測各關(guān)鍵因子m RNA 表達(dá)水平

提取細(xì)胞總RNA 并測定濃度,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,以cDNA 為擴(kuò)增模板,使用相應(yīng)引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增.所有待測樣品均做3個(gè)平行復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-qPCR

1.6.2 免疫熒光染色

吸盡六孔板中的培養(yǎng)液,用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗2遍,細(xì)胞固定通透后,加入體積分?jǐn)?shù)為10%的封閉用正常山羊血清,室溫孵育12 min.加入目的蛋白一抗稀釋液(稀釋比例均為1∶200),4℃過夜.用PBS洗3遍.加入二抗(稀釋比例為1∶1 000)37℃避光孵育20 min.PBS洗3遍,在DAPI室溫孵育15 min,PBS洗3遍,5 min/遍,加入適量甘油進(jìn)行封片.每組至少選取3張爬片,熒光顯微鏡下隨機(jī)觀察15個(gè)視野,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上,使用Image J軟件和SPSS (20.0系統(tǒng))計(jì)算目的蛋白平均光密度和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

1.6.3 免疫印跡

用蛋白裂解緩沖液裂解睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞.使用BSA 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒計(jì)算蛋白質(zhì)濃度.制備相應(yīng)濃度的濃縮膠和分離膠,蛋白樣品上樣量為50μg,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳120 V、30 min進(jìn)行濃縮,80 V、1 h進(jìn)行分離目的蛋白,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉封閉,室溫孵育1 h.將目的條帶正面朝下放入用TBST稀釋的一抗(稀釋比例為1∶1 000),4℃孵育過夜,置搖床上用TBST洗滌；加入與一抗匹配的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(稀釋比例為1∶10 000)37℃孵育1 h,TBST清洗后,將PVDF膜與ECL發(fā)光液(V(A液)∶V(B液)=1∶1)充分接觸,使用ECL發(fā)光系統(tǒng)顯影.每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上,采用Image J軟件分析目的蛋白的灰度值,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量.目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/β-actin 灰度值.

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 MTT 法篩選二苯乙烯苷作用濃度結(jié)果

分別選用作用24、48、72 h和20、50、100、150、250μmol/L 用藥濃度進(jìn)行比較,研究結(jié)果如圖1所示,濃度為150μmol/L作用48 h效果較佳.

圖1 不同濃度二苯乙烯苷作用于睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力Fig.1 Cellular activity of leydig cells of testis with different concentrations of tetrahydroxystilbene glucoside

2.2 鑒定睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞衰老模型

2.2.1 睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞衰老染色結(jié)果

細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶試劑盒,以X-Gal為底物,在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會生成藍(lán)色產(chǎn)物.染色結(jié)果顯示:與正常組相比,衰老組β-半乳糖苷酶陽性率明顯升高,可達(dá)60%以上,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)(圖2).

圖2 睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色結(jié)果Fig.2 Results ofβ-galactosidase staining of leydig cells of testis

2.2.2 細(xì)胞周期變化情況

細(xì)胞衰老后周期會阻滯,結(jié)果顯示:衰老組相較于正常組,G1 期在細(xì)胞周期的占比顯著升高(P＜0.05),S期、G2期在細(xì)胞周期的占比明顯降低(P＜0.05),表明睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞阻滯在G1期,表明細(xì)胞發(fā)生衰老(表2).

表2 睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期分布結(jié)果Tab.2 Results of cell cycle distribution in leydig cells of testis

2.3 二苯乙烯苷對胰島素/IGF-1通路關(guān)鍵因子轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用

結(jié)果顯示:衰老組相較于正常組,INSR、IGF-1、IRS2、IRS1的m RNA 表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.05),IGFBP3表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05).二苯乙烯苷干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象(P＜0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3).

圖3 二苯乙烯苷對睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞胰島素/IGF-1通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)水平的調(diào)控作用Fig.3 Regulation of tetrahydroxystilbene glucoside on mRNA expression levels of key factors of the insulin/IGF-1 pathway in leydig cells of testis

2.4 二苯乙烯苷對睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞胰島素/IGF-1通路關(guān)鍵因子蛋白水平的調(diào)控作用

在免疫熒光染色中,陽性產(chǎn)物顯示紅色熒光(圖4),結(jié)果顯示:與正常組相比,胰島素/IGF-1通路關(guān)鍵因子INSR、IGF-1、IRS2、IRS1在衰老組的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05),二苯乙烯苷干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)關(guān)鍵因子的表達(dá)(P＜0.05).免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:胰島素/IGF-1通路關(guān)鍵因子的表達(dá)情況與熒光免疫染色結(jié)果一致(P＜0.05)(圖5).

圖4 睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞胰島素/IGF-1通路關(guān)鍵因子免疫熒光染色結(jié)果Fig.4 Immunofluorescence staining of key factors of the insulin/IGF-1 pathway in leydig cells of testis

圖5 睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞胰島素/IGF-1通路關(guān)鍵因子免疫印跡檢測結(jié)果Fig.5 Western blotting results of key factors of the insulin/IGF-1 pathway in leydig cells of testis

3 討論

各種衰老相關(guān)疾病伴隨著衰老發(fā)生,60歲以后,睪丸退化,性激素分泌減少,導(dǎo)致生育力下降和相關(guān)疾病,大量研究表明,中醫(yī)藥在抗衰老和治療不孕不育方面發(fā)揮重要作用[5-6].何首烏為常見的補(bǔ)益類中藥,在臨床中具有廣泛的應(yīng)用,其藥理活性主要有抗氧化、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及神經(jīng)保護(hù)等作用,在治療神經(jīng)退行性疾病、防治動(dòng)脈粥樣硬化、降血糖等方面具有潛力,其藥效成分主要包括二苯乙烯苷類、蒽醌類以及黃酮類,其中二苯乙烯苷顯示出多種生物活性[7].

Kramer等[8]的研究結(jié)果表明,氧化應(yīng)激是造成衰老的重要因素.本研究使用H2O2和FeSO4聯(lián)合刺激睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞致其氧化損傷來建立衰老模型.研究表明,β-半乳糖苷酶在衰老細(xì)胞中的活性相較于在正常細(xì)胞中會明顯增加,由于易于檢查,這一特征已被廣泛用作細(xì)胞衰老的組織化學(xué)標(biāo)記[9]；細(xì)胞衰老后細(xì)胞周期會發(fā)生阻滯[10].通過β-半乳糖苷酶染色和對細(xì)胞周期變化情況的檢測,發(fā)現(xiàn)衰老組相較于正常組,β-半乳糖苷酶陽性率和G1期在細(xì)胞周期的占比顯著升高；S期、G2期的結(jié)果與G1期相反,在細(xì)胞周期的占比降低,表明睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞在G1期發(fā)生阻滯,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致.綜上,睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞衰老模型成功建立.

IGF家族于1957年首次被發(fā)現(xiàn)[11].IGF-1是IGF家族重要的一員,由70個(gè)氨基酸殘基組成,是與胰島素分子結(jié)構(gòu)類似的單鏈多肽,其相對分子質(zhì)量為7 649 ku,可與IGF-1受體、胰島素受體(insulin receptor,INSR)以及兩者的雜合受體相互結(jié)合,以旁分泌和自分泌方式在組織生長發(fā)育、細(xì)胞代謝、增殖、分化、凋亡和調(diào)節(jié)衰老中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11-13].研究表明,IGF-1激活I(lǐng)GF-1/PI3K/AKT和IGF-1/MAPK/ERK 兩條途徑促進(jìn)細(xì)胞的增殖[14].IGF-1可以改善精子的活力、壽命和膜的完整性[11,15],可激活在衰老過程中發(fā)生改變的自噬/溶酶體系統(tǒng),促進(jìn)過氧化物酶體增殖,維持線粒體結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定,降低因衰老而引起的過度氧化應(yīng)激反應(yīng)[16].胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(insulin like growth factor binding protein 3,IGFBP3)也是IGF家族的一員,可結(jié)合IGF-1抑制其生物活性[6].本研究發(fā)現(xiàn),衰老的睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞中IGFBP3的表達(dá)水平相較于正常組顯著升高,INSR、IGF-1表達(dá)水平相較于正常組顯著降低,可見IGFBP3分泌的增加抑制了IGF-1對細(xì)胞的促增殖作用,而二苯乙烯苷可以逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象,發(fā)揮抗衰老的作用.

胰島素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)蛋白家族是胰島素/IGF-1信號的關(guān)鍵介體,參與代謝激素的控制[6].IRS1、IRS2是胰島素/IGF-1信號傳導(dǎo)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)中最重要的代表[17].在哺乳動(dòng)物的4種IRS蛋白中,IRS1和IRS2在調(diào)節(jié)生長和存活,代謝和衰老中起關(guān)鍵作用[18].本研究通過RT-qPCR、免疫熒光和免疫印跡技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)衰老的睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞IRS1、IRS2表達(dá)水平明顯降低,二苯乙烯苷干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象.綜上,二苯乙烯苷可上調(diào)衰老的睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞IGF-1、INSR、IRS1、IRS2表達(dá)水平,明顯下調(diào)IGFBP3 m RNA 水平.充分表明二苯乙烯苷延緩睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞的衰老可通過調(diào)控胰島素/IGF-1信號通路關(guān)鍵因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn),胰島素/IGF-1信號傳導(dǎo)通路是二苯乙烯苷延緩大鼠睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞衰老的重要途徑之一.