孫梟瓊崔鐵峰方楠王印開王宏偉

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,生命科學(xué)與綠色發(fā)展研究院,河北 保定 071002；2.河北省唐山市曹妃甸區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,河北 唐山 063000)

浮游動物在能量傳遞與物質(zhì)循環(huán)中起重要作用.枝角類和橈足類屬節(jié)肢動物門、甲殼綱,是其他無脊椎動物和魚類的餌料,可作為水環(huán)境變化的指示生物[1].同時(shí),浮游動物在控制藻類生長,預(yù)防水華發(fā)生方面具有一定的作用.國內(nèi)外對浮游動物的研究多集中于群落結(jié)構(gòu)時(shí)空變化的生態(tài)調(diào)查,并以此反映水環(huán)境狀況[2-4],同時(shí)將其應(yīng)用到指示湖泊、河流水質(zhì)狀況和健康狀況評價(jià)[5-6].

由于浮游動物個(gè)體較小,且在采集時(shí)容易造成其肢體破損,對鑒定技術(shù)具有較高的要求.因此,在本研究中將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定手段與分子生物學(xué)鑒定手段結(jié)合在一起,從而提高浮游動物鑒定的準(zhǔn)確性.自DNA條形碼概念被提出及應(yīng)用后,國內(nèi)外學(xué)者多將其應(yīng)用于生物學(xué)物種鑒定、食品安全檢測、醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域,其在浮游動物鑒定中發(fā)揮重要作用.林元燒等[7]采集膠州灣青島海域中華哲水蚤(Sinocalanussinensis),成功提取并分析其線粒體COI基因.申欣等[8]應(yīng)用生物信息學(xué)輔助以分子標(biāo)記技術(shù)比較了南極磷蝦(Euphausiasuperba)與泛浮游動物和后生浮游動物的線粒體基因組.Bucklin等[9]在北大西洋環(huán)流中心的美國東部馬尾藻海進(jìn)行研究中,應(yīng)用DNA 條形碼技術(shù)共鑒定出4門175種浮游動物,并分析了其生物多樣性,由此可見,DNA 條形碼技術(shù)作為新型的生物鑒定手段得到廣泛應(yīng)用.

白洋淀作為華北地區(qū)最大的淡水湖泊,在洪水儲存、氣候調(diào)節(jié)、生態(tài)環(huán)境改善等方面發(fā)揮重要的作用[10-11].近年來,學(xué)者對白洋淀流域研究多集中于水環(huán)境、沉積物和生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)空變化[12-15].由于白洋淀淀區(qū)在歷史上多次出現(xiàn)干淀現(xiàn)象且現(xiàn)與其直接溝通的入淀河流僅為府河,使得其成為府河所攜帶物質(zhì)的“匯”,加以淀區(qū)居民日常生產(chǎn)活動等對其產(chǎn)生較大影響[16].對白洋淀長期的生態(tài)環(huán)境監(jiān)測和水生生物資源研究為水利工程的實(shí)施和雄安新區(qū)的建設(shè)提供參考.

1 材料與方法

1.1 樣本的采集與處理

枝角類和橈足類于2018年8月采于白洋淀流域,根據(jù)上下游河流及進(jìn)出水情況,共設(shè)30個(gè)樣點(diǎn):白洋淀1、白洋淀2、前塘淀、后塘淀、聚龍淀、孟家淀、胡家洼、泛魚淀、鰣鯸淀、平陽淀、池魚淀、撈王淀、大麥淀、唐家淀、龍王淀、光淀、王家寨、燒車淀(2個(gè))、大鴨圈、八大淀、麥淀、藻苲淀(4個(gè))、羊角淀、馬棚淀、三角淀、灣簍淀.具體采樣點(diǎn)位置如圖1所示.用浮游動物網(wǎng)[17]在淀區(qū)采集浮游動物并置于樣品瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇保存.室內(nèi)鏡檢、拍照、計(jì)數(shù).

圖1 白洋淀采樣點(diǎn)站位Fig.1 Sample sites in Baiyangdian Lake

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序分析

采用裂解法和試劑盒法進(jìn)行DNA 提取.對所提取DNA 質(zhì)量濃度及純度檢測,質(zhì)量濃度控制在100～300μg/m L,OD260/OD280值控制在1.8～2.1[18].對其進(jìn)行COI目的基因擴(kuò)增,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測是否擴(kuò)增出目的條帶.將所擴(kuò)增出的目的條帶樣品送至測序公司測序[19].

使用Bio Edit軟件查看測序所得浮游動物線粒體COI基因序列質(zhì)量并對其進(jìn)行編輯,將雜峰序列及序列兩頭不穩(wěn)定堿基序列進(jìn)行剪切.編輯后的浮游動物線粒體COI基因使用MEGAX6.4軟件對齊序列,基于Kimura 2-parameter模型對所拼接成功的COI基因序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹,并對各分支進(jìn)行1 000次的重復(fù)檢驗(yàn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]及分析遺傳距離[21].

2 結(jié)果

2.1鑒定結(jié)果

2018年8月于白洋淀30個(gè)站點(diǎn)通過形態(tài)學(xué)鑒定方法結(jié)合DNA 條形碼技術(shù)共鑒定出枝角類3科5屬8種,橈足類4科9屬14種.枝角類和橈足類名錄如表1.

表1 白洋淀枝角類和橈足類名錄Tab.1 List of Cladocera and Copepoda samples in Baiyangdian Lake

2.2 枝角類和橈足類系統(tǒng)發(fā)育樹

測序后共拼接出21條序列,枝角類共拼接出14條序列,橈足類共拼接出7條序列.根據(jù)它們的COI序列建立的鄰接(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示.

系統(tǒng)發(fā)育樹首先分為2大分支,分別為枝角目和橈足綱.在枝角類中裸腹溞單獨(dú)聚為1支,而僧帽溞和棘爪低額溞聚為1支.在橈足類中,首先被分出來的是鏢水蚤屬,而劍水蚤形成1個(gè)大的分支,在劍水蚤所匯成的分支中,共分為2個(gè)小的分支,分別為廣布中劍水蚤和跨立小劍水蚤.所得的聚類結(jié)果與形態(tài)鑒別結(jié)果基本一致.但在發(fā)育樹中呈現(xiàn)的大型溞單獨(dú)聚為1支,與預(yù)想結(jié)果具有差異.

圖2 枝角類和橈足類NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of Cladocera and Copepoda

2.3 物種分布與環(huán)境相關(guān)性分析

2.3.1 典型相關(guān)性分析排序

根據(jù)各樣點(diǎn)枝角類和橈足類分布情況與水環(huán)境因子進(jìn)行典型相關(guān)性分析(CCA).結(jié)果如表2所示.

表2 枝角類和橈足類分布與環(huán)境因子的CCATab.2 CCA of environmental factors and distribution of Cladocera and Copepoda

依據(jù)CCA 結(jié)果(表2),4個(gè)排序軸對分布變異性(本征值)的解釋度逐漸減小,其中主成分軸(3、4排序軸)所能解釋的數(shù)據(jù)比重達(dá)42.64%；另外物種分布與環(huán)境因子之間的相關(guān)系數(shù)非常高,介于0.88～0.97,共解釋兩者總方差的62.55%,表明此結(jié)果能較好地反映枝角類和橈足類分布與環(huán)境因子之間的關(guān)系.

2.3.2 環(huán)境因素與CCA 排序

根據(jù)枝角類和橈足類分布進(jìn)行了環(huán)境因子顯著性檢驗(yàn)和CCA.結(jié)果如表3和圖3所示.

表3 環(huán)境因子解釋的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Interpretation results for significance test of environmental factors

圖3 枝角類和橈足類與環(huán)境因子的CCA排序Fig.3 CCA sequencing diagram of environmental factors with Cladocera and Copepoda

由排序分析可知,環(huán)境因子Zn含量對于枝角類和橈足類的分布有顯著影響.枝角類的分布與Zn、S、NH+4、Pb和Cu含量呈正相關(guān),其中橈足類近鄰劍水蚤、等刺溫劍水蚤、跨立小劍水蚤、草綠刺劍水蚤的分布和S、Cu、Zn含量呈正相關(guān)；而模式有爪猛水蚤、臺灣溫劍水蚤和透明溫劍水蚤的分布與P、石油烴、Chla、Cd和Pb含量呈正相關(guān)；蟲宿溫劍水蚤的分布與Mn O-4、NO-3、As含量及溫度(T)呈正相關(guān).對于2018年7～8月的水環(huán)境因子進(jìn)行主成分分析,見圖3.共分為4個(gè)主成分,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率62.55%.第1主成分與酸堿度(p H)、濁度、DO 和NO-3含量有關(guān),方差貢獻(xiàn)率為18.29%,第2主成分與Cu、S、Zn和NH+4含量有關(guān),方差貢獻(xiàn)率為16.84%,第3主成分與Chla、Pb和石油烴含量有關(guān),方差貢獻(xiàn)率為15.06%,第4主成分與溫度(T)、Mn O-4和As含量有關(guān),方差貢獻(xiàn)率為12.36%.

3 討論與分析

枝角類系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,裸腹溞、棘爪低額溞和僧帽溞在1個(gè)主分支上,大型溞單獨(dú)在另1個(gè)主分支上.這和預(yù)期的結(jié)果存在差異,由于裸腹溞、低額溞、僧帽溞和大型溞都隸屬于溞科,預(yù)期結(jié)果是4種溞都在同一分支.出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是由于建立系統(tǒng)發(fā)育樹的序列經(jīng)過剪切比對后基因之間差異減小[22].由此判斷,根據(jù)單一基因所獲得的序列獲得的DNA 條形碼和由此建立的系統(tǒng)發(fā)育樹還需進(jìn)一步精準(zhǔn)確認(rèn),因此應(yīng)該使用2個(gè)或多個(gè)基因共同完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,以達(dá)到更好的鑒定效果[23].橈足類系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,依靠DNA 條形碼技術(shù)對枝角類和橈足類進(jìn)行鑒定可以取得較好的效果[24-25].

除捕食、競爭等生物因子外,各水環(huán)境因子對浮游動物的群落組成及演替具有重要作用.如溫度對浮游動物影響相對較大,夏季水溫相對其他季節(jié)較高,20℃以上溞屬的數(shù)量一般很低[26].而較高的溫度在限制枝角類數(shù)量的同時(shí)又通過影響水中的食物資源以及生存環(huán)境促進(jìn)橈足類幼體的生長發(fā)育[27].p H 均表現(xiàn)為弱堿性,且各采樣位點(diǎn)變化不大,對枝角類和橈足類分布影響較小.

部分水環(huán)境因子是湖泊本身所具有的,而大部分水環(huán)境因子變化與人們的活動息息相關(guān).白洋淀流域環(huán)境的變化,不單單是由于水利工程活動的影響,在白洋淀流域附近居住的村民的人為影響也應(yīng)該考量進(jìn)去.白洋淀淀區(qū)存在人口密度大、開發(fā)強(qiáng)度高的現(xiàn)象,也導(dǎo)致了白洋淀流域環(huán)境的復(fù)雜性.在居民活動中家禽畜養(yǎng)殖、餐飲業(yè)、旅游業(yè)占較大比例,生活廢水等未經(jīng)處理直接入淀現(xiàn)象大為存在,導(dǎo)致淀中營養(yǎng)鹽含量較高[28].營養(yǎng)鹽對浮游動物具有重要的影響,通過影響浮游植物數(shù)量以及Chla含量的變化從而間接影響浮游動物的密度與生物量[29],同時(shí)浮游動物的豐度和密度會隨水體富營養(yǎng)化的加重而增加,橈足類浮游動物的豐度和密度增加明顯,枝角類浮游動物的豐度和密度會隨水體富營養(yǎng)化的加重而減少[30].本研究中,從圖3中可以看出枝角類與環(huán)境中P含量呈負(fù)相關(guān).這也與李娟[31]等在太湖所研究的浮游動物與水環(huán)境因子相關(guān)性所得結(jié)論相一致.大部分樣點(diǎn)中占據(jù)優(yōu)勢的種類為橈足類中的透明溫劍水蚤及等刺溫劍水蚤,這也與當(dāng)?shù)豍、NH+4含量較高的實(shí)際情況相符.但采樣位點(diǎn)藻苲淀3、藻苲淀4的P含量相對于其他位點(diǎn)較高,但其優(yōu)勢物種透明溫劍水蚤相對較少,這與浮游動物根據(jù)溫度及光照強(qiáng)度在水體中進(jìn)行垂直運(yùn)動的生活習(xí)性有關(guān)[32].綜上兩點(diǎn),證實(shí)了枝角類存在數(shù)量及種類相對于橈足類較少的浮游動物分布狀況.

根據(jù)檢驗(yàn)得到的環(huán)境因子的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3.Zn對枝角類和橈足類分布的解釋度為9.1%,并對枝角類和橈足類的分布具有顯著影響(P＜0.05),說明它是枝角類和橈足類區(qū)域性分布差異的主要原因.同時(shí)S和Pb也對枝角類和橈足類空間分布有一定影響,但未達(dá)到顯著水平.Zn、Pb、S含量相對較高的樣點(diǎn)主要集中于白洋淀1、白洋淀2、燒車淀1、燒車淀2、唐家淀、藻苲淀2樣點(diǎn),水體中的重金屬離子及酸性物質(zhì)主要來自淀區(qū)的生活廢水、餐飲業(yè)廢水、農(nóng)藥殘留及旅游業(yè)垃圾排放[33].低濃度的重金屬對浮游動物所產(chǎn)生的效果不明顯,但高濃度的Zn和Pb等重金屬通過抑制浮游動物的攝食、生長活動以及休眠卵的發(fā)育來影響其生存率并不同程度地富集于生物體內(nèi),通過食物鏈的形式傳遞給更高級的消費(fèi)者[34].但不同的浮游生物對重金屬的耐受程度不同,從而所作出的反應(yīng)也不同[35].

由此得出,每個(gè)物種的生長都受不同水環(huán)境因子影響,相同水環(huán)境因子對不同物種的分布影響存在差異[36].綜上,可根據(jù)在不同位點(diǎn)枝角類和橈足類物種群落組成及演替來判斷該區(qū)域水環(huán)境因子變化,以此來監(jiān)測水質(zhì)變化情況[37],為白洋淀流域水環(huán)境監(jiān)測與評價(jià)提供數(shù)據(jù)支持.

致謝:感謝河北省海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究院海洋漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站肖國華研究員提供環(huán)境數(shù)據(jù).