張蕾趙國(guó)發(fā)李楠喬曉強(qiáng)賈友超

(1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科 河北省腫瘤放化療機(jī)制與規(guī)程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000；3.河北大學(xué) 藥學(xué)院 河北省藥物質(zhì)量分析控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071002)

抑郁癥是一種常見的情緒和精神疾病,其主要的臨床表現(xiàn)包括身體癥狀和精神癥狀,身體癥狀主要出現(xiàn)疲勞、失眠、食欲不振和性欲下降等,后者的主要表現(xiàn)為情緒低落、興趣消沉、思維緩慢和記憶力減退等[1].根據(jù)世界衛(wèi)生組織的調(diào)查,抑郁癥已成為全球第四大常見疾病,全世界至少有4億人患有該疾病[2].

抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展與炎癥小體的異常升高密切相關(guān),尤其是血清和腦中炎癥小體的升高[3].免疫系統(tǒng)激活和炎性細(xì)胞因子在抑郁癥的發(fā)展形成過程中起重要作用.促炎細(xì)胞因子可以誘發(fā)動(dòng)物的病態(tài)行為,類似于抑郁癥的癥狀.例如,向動(dòng)物使用LPS或IL-1β可誘導(dǎo)抑郁癥樣行為[2].炎癥小體是炎癥反應(yīng)的重要組成部分,研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1和ASC在抑郁癥大鼠模型的血清和大腦海馬區(qū)中顯著性升高[4].

芒果苷(mangiferin,1,3,6,7-四羥基黃酮-C2-β-D-葡萄糖苷,化學(xué)分子式為C19H18011,相對(duì)分子質(zhì)量為422)是從芒果的葉子、樹皮、果皮和根中提取的天然多酚化合物.現(xiàn)代藥理學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)芒果苷具有多種藥理學(xué)作用,主要包括抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、止痛、肝臟保護(hù)、抗糖尿病等多種藥理學(xué)活性[5].有研究表明芒果苷能夠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)性抗炎作用[6],但它對(duì)抑郁癥的作用尚不清楚.本研究選擇健康的雄性sprague dawley(SD)大鼠建立了慢性不可預(yù)測(cè)的輕度應(yīng)激(CUMS)模型,研究芒果苷的抗抑郁和神經(jīng)保護(hù)作用.

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

芒果苷(MGF)購自Alatin公司(中國(guó)上海)；Bax和Bcl-2的一抗抗體購自Cell Signaling Technology Inc.(美國(guó)馬薩諸塞州)；NLRP1、Caspase-1、IL-1β、IL-6和TNF-α的一抗抗體和氟西汀(Flu)購自Abcam(美國(guó)加利福尼亞州舊金山)；Caspase-3、ASC和IL-18的一抗購自Santa Cruz Biotechnology(美國(guó)加利福尼亞州圣克魯斯)；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG,中杉金橋,批號(hào):122319A.免疫組化染色試劑盒,中杉金橋,批號(hào):13152A06.SABC 免疫組化試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào):06L13BJ.

1.2 慢性不可預(yù)見性動(dòng)物應(yīng)激模型(CUMS)的建立及分組給藥

按照文獻(xiàn)[7]報(bào)道的方法對(duì)健康SD 大鼠進(jìn)行CUMS干預(yù)刺激,刺激方式包括(不僅限于這些方法):1)禁食(24 h)；2)禁水(24 h)；3)夜間照明；4)籠具傾斜(45°)；5)弄臟籠具(按照200 g木屑?jí)|料加水500 m L比例) ；6)明/暗反轉(zhuǎn)；7)夾尾(距離尾巴起點(diǎn)1 cm 持續(xù)1 min),刺激時(shí)間為每天19:00.對(duì)照組動(dòng)物不受干擾.具體操作見表1,持續(xù)作用6周.

表1 6周內(nèi)給予大鼠慢性不可預(yù)測(cè)性刺激具體操作Tab.1 Rats were given chronic unpredictability stimulation within 6 weeks

雄性清潔級(jí)(SPF)大鼠,模型組分為單純模型組(Control)、受試藥溶劑組(Vehicle)、受試藥低中高劑量組(MGF20、MGF40、MGF80)、氟西汀陽性對(duì)照組(Flu10).采用灌胃給藥(intragastric administration)方式進(jìn)行藥物干預(yù).芒果苷低中高劑量組(mangiferin,MGF,20、40、80 mg/kg),氟西汀陽性對(duì)照組采用灌胃給藥(10 mg/kg),每次給予大鼠刺激前1 h給藥,連續(xù)給藥2周.

1.3 蔗糖偏愛測(cè)試(SPT)

在第0周、第4周和第6周結(jié)束時(shí)進(jìn)行蔗糖偏愛測(cè)試.大鼠被剝奪水和食物(24 h).每只大鼠被關(guān)在一個(gè)單獨(dú)的籠子里,可以自由進(jìn)入2個(gè)裝有100 m L蔗糖溶液1 g/m L和100 m L 純水的瓶子.6 h后,記錄蔗糖溶液和水的消耗質(zhì)量.蔗糖偏愛值由以下公式確定:

蔗糖偏愛值=蔗糖攝入量(g)/[蔗糖攝入量(g)+水分?jǐn)z入量(g)]×100%.

1.4 自發(fā)活動(dòng)測(cè)試(SAT)

在第0周、第4周和第6周,通過自主活動(dòng)程序(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院)測(cè)試大鼠自主神經(jīng)活動(dòng),測(cè)量大鼠的自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù).程序訪問后,將大鼠放入自發(fā)活動(dòng)框,計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄該大鼠的活動(dòng),使大鼠適應(yīng)3 min,然后記錄活動(dòng)5 min.

1.5 曠場(chǎng)測(cè)試(OFT)

測(cè)試用于評(píng)估小鼠的運(yùn)動(dòng)能力(交叉水平運(yùn)動(dòng)得分反映運(yùn)動(dòng)范圍).將大鼠單獨(dú)放置在一個(gè)開闊的野外設(shè)備中間的木箱中(80 cm×80 cm×50 cm),將競(jìng)技場(chǎng)的地面分成12個(gè)相等的正方形.經(jīng)過2 min的適應(yīng)后,在3 min的時(shí)間里計(jì)算了穿越間隔的次數(shù).每次實(shí)驗(yàn)后,使用酒精清潔設(shè)備.

1.6 強(qiáng)制游泳測(cè)試(FST)

在第0周、第4周和第6周CUMS程序結(jié)束時(shí)進(jìn)行強(qiáng)制游泳測(cè)試.將每只大鼠單獨(dú)放在一個(gè)開放的圓柱形玻璃容器中(高度40 cm,直徑20 cm),控制水溫在(25±0.5)℃,水面高度為15 cm.統(tǒng)計(jì)大鼠在水中5 min內(nèi)保持靜止?fàn)顟B(tài)的時(shí)間.靜止?fàn)顟B(tài)的定義是大鼠漂浮在水中只需要很小的動(dòng)作就可以使頭部保持在水上而沒有其他多余運(yùn)動(dòng).

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析

在所有行為實(shí)驗(yàn)之后,通過斷頭處死大鼠.快速取出海馬并保存在-80℃待測(cè).使用Trizol試劑從海馬組織中分離總RNA.使用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix Kit(thermo scientific)合成cDNA,使用TransStart Green qPCR Super Mix UDG 試劑盒(Sangon Biotech)以20μL 進(jìn)行qRT-PCR,并使用CFX Connect儀器(Bio-Rad)進(jìn)行分析.表2中顯示了該實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列.每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)到熒光信號(hào).熔解曲線分析用于確認(rèn)產(chǎn)物的特異性.每組定量PCR 分析重復(fù)3次.

表2 RT-PCR 序列Tab.2 RT-PCR sequence

1.8 免疫印跡分析

從海馬中獲取蛋白質(zhì)樣品,通過BCA 檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度,各組等蛋白質(zhì)量上樣.一抗采用1∶800體積比稀釋的抗NLRP3、抗Caspase-1、抗IL-1β、抗IL-6和抗TNF-α；抗-Bax和抗-Bcl2采用1∶500體積比例稀釋；抗Caspase-3、抗ASC 和抗IL-18采用1∶200體積比例稀釋.按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳.通過使用Image-Pro Plus(IPP 6.0)軟件的光密度測(cè)定法測(cè)定目的蛋白的條帶與對(duì)應(yīng)內(nèi)參的條帶的比值.

1.9 組織學(xué)分析

最后一次刺激24 h后,將大鼠麻醉并快速取出大腦,然后將其固定在4 g/m L多聚甲醛中,將腦包埋在石蠟中,并用切片機(jī)切成5μm 的切片.按標(biāo)準(zhǔn)操作對(duì)石蠟切片進(jìn)行染色,觀察海馬CA1和CA3的形態(tài).

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 芒果苷在CUMS抑郁模型中具有抗抑郁作用

在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(第0周)測(cè)得的蔗糖消耗量在各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.在CUMS處理4周后,應(yīng)激組的蔗糖消耗量顯著低于對(duì)照組.當(dāng)CUMS處理6周后,CUMS組的蔗糖攝入量顯著低于對(duì)照組.與溶劑組相比,口服芒果苷(20、40、80 mg/kg)或氟西汀(10 mg/kg)治療2周的大鼠蔗糖消耗量顯著增加(圖1a).當(dāng)CUMS刺激未開始時(shí)(第0周),每組大鼠的活動(dòng)對(duì)于自發(fā)運(yùn)動(dòng)評(píng)估幾乎沒有差異.實(shí)驗(yàn)4周后,CUMS組大鼠的自發(fā)活動(dòng)明顯降低.口服芒果苷(20、40、80 mg/kg)或氟西汀(10 mg/kg)處理2周的大鼠的自發(fā)活動(dòng)明顯增加(圖1b).在OFT實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(第0周)每組的數(shù)據(jù)無明顯差異.口服芒果苷(20、40、80 mg/kg)或氟西汀(10 mg/kg)2周后,模型組的穿線次數(shù)明顯減少(圖1c).在FST 實(shí)驗(yàn)中,開始時(shí)(第0周)各組靜止時(shí)間無顯著差異.CUMS處理4周后,CUMS各組與對(duì)照組相比,大鼠靜止時(shí)間顯著升高,結(jié)果具有明顯差異,口服芒果苷(20、40、80 mg/kg)或氟西汀(10 mg/kg)2周后,各給藥組大鼠水中靜止時(shí)間顯著降低,與對(duì)照組相比具有顯著性差異(圖1d).

圖1 芒果苷和氟西汀對(duì)CUMS處理大鼠行為學(xué)的影響Fig.1 Effects of mangiferin and fluoxetine on the behavior of CUMS-treated rats

2.2芒果苷阻斷CUMS大鼠的海馬區(qū)損傷

根據(jù)結(jié)果所示(圖2),模型組的CA1和CA3區(qū)與對(duì)照組相比顯示出明顯的損傷.陽性對(duì)照藥物氟西汀可減輕大鼠海馬損傷.用免疫印跡法檢測(cè)海馬中的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3,Bax和Bcl-2.與對(duì)照組相比,模型組的Caspase-3和Bax蛋白水平顯著升高,而Bcl-2蛋白水平顯著降低,Bax/Bcl-2比值也是如此.口服芒果苷或氟西汀可顯著逆轉(zhuǎn)Caspase-3,Bax和Bcl-2蛋白的水平(圖3).這些結(jié)果表明:芒果苷可阻斷海馬區(qū)的損傷.

圖2 芒果苷對(duì)CUMS誘導(dǎo)抑郁癥大鼠海馬區(qū)的保護(hù)作用Fig.2 Protective effects of mangiferin on hippocampus of rats with depression induced by CUMS

圖3 芒果苷對(duì)CUMS誘導(dǎo)大鼠海馬區(qū)凋亡蛋白的影響Fig.3 Effect of mangiferin on apoptosis protein in hippocampus of rats induced by CUMS

2.3 芒果苷抑制CUMS大鼠模型中NLRP3炎癥小體的活化

研究表明,抑郁癥患者的NLRP3被激活.在蛋白質(zhì)和mRNA 水平上檢查了每組大鼠海馬區(qū)中的NLRP3炎癥小體復(fù)合物(圖4).與對(duì)照組相比,在CUMS處理的大鼠海馬區(qū)中NLRP3表達(dá)水平顯著增加.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,氟西汀會(huì)降低NLRP3蛋白的水平.高劑量的芒果苷(40和80 mg/kg)也抑制ASC和Caspase-1的蛋白水平.此外,在CUMS處理的大鼠中,NLRP1 m RNA、ASC m RNA、Caspase-1 m RNA 的水平明顯高于對(duì)照組.芒果苷和氟西汀能夠抑制由于CUMS模型誘導(dǎo)ASC mRNA、Caspase-1 mRNA、NLRP3 m RNA 的升高.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在該CUMS模型中,芒果苷可以抑制NLRP3炎癥小體的活化.

圖4 芒果苷對(duì)CUMS誘導(dǎo)的大鼠海馬區(qū)NLRP3炎癥小體表達(dá)的影響Fig.4 Effect of mangiferin on the expression of NLRP3 inflammasome in the hippocampus of rats induced by CUMS

2.4 芒果苷抑制大鼠CUMS模型中海馬區(qū)炎性因子的表達(dá)

作為先天免疫和炎性反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,炎癥小體可以直接或間接促進(jìn)炎性細(xì)胞因子(例如1L-1β,IL-6,IL-18和TNF-α)的分泌.作者通過免疫印跡法檢測(cè)了大鼠海馬區(qū)中1L-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的蛋白水平(圖5),結(jié)果顯示芒果苷降低1L-1β和TNF-α蛋白的表達(dá)水平；高濃度的芒果苷(40,80 mg/kg)抑制了IL-6和IL-18的水平.這些結(jié)果表明:MGF可以抑制CUMS模型中NLRP3的激活.

圖5 芒果苷對(duì)CUMS誘導(dǎo)的大鼠海馬區(qū)炎癥因子表達(dá)的影響Fig.5 Effects of mangiferin on the expression of inflammatory factors in the hippocampus of rats induced by CUMS

3 討論

抑郁癥是一種廣泛的神經(jīng)精神疾病,具有高發(fā)病率和高復(fù)發(fā)率.抑郁癥是一種復(fù)雜的疾病,現(xiàn)有的治療方法存在較多的不良影響.炎癥被認(rèn)為是抑郁產(chǎn)生的重要原因之一,在抑郁癥患者中常伴隨著神經(jīng)炎癥反應(yīng)[8].但神經(jīng)炎癥如何導(dǎo)致抑郁,目前尚不清楚.患有嚴(yán)重抑郁癥的患者通常表現(xiàn)出炎癥癥狀,具體表現(xiàn)為外周血和腦脊液中炎癥因子水平的升高.慢性應(yīng)激誘發(fā)的抑郁癥(CUMS)模型是研究抑郁癥的有效方法,被廣泛用于探索疾病和抗抑郁藥篩選的病理學(xué)基礎(chǔ).CUMS模型模擬了抑郁癥的核心癥狀,包括攝入蔗糖、運(yùn)動(dòng)和穿線次數(shù)行為的減少以及在水中靜息時(shí)間的增加[9].非甾體抗炎藥(NSADs)和細(xì)胞因子抑制劑已被用作重度抑郁癥(MDD)患者的抗抑郁治療.環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸代謝為前列腺素的限速酶.COX具有2種主要的亞型,即COX-1和COX-2,在患有慢性不可預(yù)測(cè)壓力的個(gè)體的皮質(zhì)和海馬中,COX的表達(dá)增加.此外,在抑郁癥患者中,促炎性前列腺素E2(PG-E2)水平顯著增加[10].建立CUMS模型,通過實(shí)驗(yàn)表明,CUMS治療6周后,大鼠表現(xiàn)出明顯的抑郁癥狀,而MGF 可以明顯改善抑郁癥狀.通過評(píng)估糖水偏愛測(cè)試(SPT)、自發(fā)活動(dòng)測(cè)試(SAT)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)和強(qiáng)迫游泳測(cè)試(FST),顯示芒果苷改善了大鼠的抑郁癥行為(圖1).

在抑郁癥的動(dòng)物模型中,外部壓力刺激會(huì)減少成年海馬體內(nèi)的神經(jīng)元再生,而抗抑郁藥可以阻止這種作用[11].抑郁癥患者的多個(gè)腦區(qū)域通常都有病理變化.海馬區(qū)經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)具有明顯的萎縮,萎縮的程度與抑郁癥的嚴(yán)重程度相關(guān)[12].抑制海馬神經(jīng)元再生是抑郁癥的關(guān)鍵病理生理機(jī)制之一.抗抑郁藥可以促進(jìn)海馬神經(jīng)元的再生,IL-1β可以通過抑制海馬神經(jīng)元的再生來介導(dǎo)CUMS誘導(dǎo)的抑郁行為[13].芒果苷以劑量依賴性方式減少CUMS治療后大鼠海馬CA1和CA3 區(qū)的萎縮(圖2).此外,芒果苷以劑量依賴性方式抑制Caspase-3的表達(dá),并增加Bcl-2的表達(dá)(圖3).這些結(jié)果表明,芒果苷可以抑制抑郁癥大鼠的海馬損傷.

炎癥是一種自我保護(hù)機(jī)制,可限制有害刺激和對(duì)身體的損害.神經(jīng)炎癥是許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理過程的組成部分,例如自身免疫性疾病,神經(jīng)退行性疾病,癲癇和抑郁癥.炎性小體蛋白復(fù)合物首次發(fā)現(xiàn)于2002年,當(dāng)被激活時(shí)會(huì)釋放多種炎性因子,包括IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α.炎性小體介導(dǎo)的途徑可產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害并誘發(fā)動(dòng)物行為改變[14].最近的研究表明抑郁癥患者的NLRP3和Caspase-1水平升高.筆者已經(jīng)證明了MGF在大鼠模型CUMS中具有抗抑郁和神經(jīng)保護(hù)作用.為了進(jìn)一步研究MGF的神經(jīng)保護(hù)作用,評(píng)估了MGF對(duì)NLRP3途徑激活的作用.與以前的報(bào)道相似,大鼠CUMS模型在m RNA 和蛋白質(zhì)水平上增加了NLRP3、Caspase-1和ASC的表達(dá).在本實(shí)驗(yàn)研究中,筆者證明了芒果苷以劑量依賴性的方式抑制其表達(dá).芒果苷對(duì)NLRP3炎性小體的具體作用機(jī)制尚不清楚,需要進(jìn)一步研究.