趙世康 金鑫 徐嵩

肺癌是現(xiàn)今全球發(fā)病率第二及致死率最高的惡性腫瘤[1]。據(jù)中國癌癥統(tǒng)計2015年數(shù)據(jù)[2]顯示，我國因癌癥死亡的病人數(shù)目已達(dá)281.4萬人，其中肺癌是導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率最高的癌種。肺癌根據(jù)病理組織類型主要被分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）。其中腺癌是NSCLC中最常見的類型[3]。近年來隨著靶向治療及免疫治療的興起，肺癌死亡率較前有所下降，但免疫治療在癌癥患者中有效率僅為20%-30%。現(xiàn)已有多種針對免疫治療療效預(yù)測的生物標(biāo)志物，例如程序性死亡受體配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）、腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden,TMB）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability, MSI）等，但其靈敏性及特異度均差強(qiáng)人意[4]，因此迫切需要找到更好的免疫治療生物標(biāo)志物。

Ras蛋白特異鳥嘌呤核苷酸釋放因子2（RASGRP2）是Ras蛋白鳥氨酸釋放蛋白家族（RASGRP）中的一員，可以激活小GTPases蛋白中Ras家族中的Rap1[5]。Wu等[6]研究結(jié)果提示RASGRP2可以有效預(yù)測結(jié)腸癌患者的預(yù)后，此外，Essa等[7]發(fā)現(xiàn)RASGRP2表達(dá)量與肝癌患者總生存期相關(guān)。然而針對RASGRP2在肺腺癌患者中的表達(dá)情況及其對免疫微環(huán)境影響均未有報道。在本項研究中，我們通過收集癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）的肺癌測序結(jié)果及臨床數(shù)據(jù)，在分析RASGRP2在肺腺癌患者人群中表達(dá)情況的基礎(chǔ)上，又通過多項數(shù)據(jù)庫分析其表達(dá)量對免疫微環(huán)境的影響，幫助我們確定可以預(yù)測肺癌預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，并希望有助于篩選更適合免疫治療獲益的患者人群。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫檢索 研究主要通過檢索TCGA數(shù)據(jù)庫（https://www.cancer.gov/tcga）搜集數(shù)據(jù)[8]。TCGA包括RNA測序、miRNA測序、DNA測序等多種測序結(jié)果以及相關(guān)患者的臨床信息。我們從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了所有LUAD患者的轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù)，整理得到523例患者的轉(zhuǎn)錄組信息及臨床數(shù)據(jù)。

1.2 人類蛋白質(zhì)圖譜 人類蛋白質(zhì)圖譜項目（Human Protein Atlas, HPA）（https://www.proteinatlas.org/）致力于研究人類蛋白質(zhì)的組織和細(xì)胞分布信息，我們通過該數(shù)據(jù)庫中病理圖譜來探討RASGRP2在肺腺癌中分布情況。

1.3 計算免疫相關(guān)淋巴細(xì)胞浸潤情況 使用TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）和TIMER 2.0（http://timer.cistrome.org/）數(shù)據(jù)庫計算出RASGRP2表達(dá)量對B細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤情況的影響。

1.4 功能富集分析 通過RASGRP2表達(dá)量將TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者分為高低表達(dá)兩組，使用R語言“Cluster Profiler”包行后續(xù)基因富集分析。

1.5 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫 通過使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）[9]繪制生存曲線。探索RASGRP2的基因與蛋白水平表達(dá)對于肺腺癌患者生存期的影響。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 使用Wilcoxon檢驗對兩組樣品進(jìn)行顯著性分析，應(yīng)用Pearson卡方檢驗分析RASGRP2表達(dá)與臨床特征變量的相關(guān)性。單因素和多因素分析采用Cox比例風(fēng)險回歸模型。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RASGRP2高低表達(dá)患者臨床資料分析 本研究通過檢索TCGA數(shù)據(jù)庫，共下載了523例肺腺癌患者的轉(zhuǎn)錄組信息及臨床數(shù)據(jù)，其中RASGRP2高表達(dá)患者259例，RASGRP2低表達(dá)患者264例。通過性別、年齡、吸煙情況、腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TMN）分期對其細(xì)分后，我們發(fā)現(xiàn)RASGRP2低表達(dá)患者中，女性患者比例較高。而RASGRP2表達(dá)情況與年齡及吸煙狀況之間沒有統(tǒng)計學(xué)意義。通過TNM分期可以看到，RASGRP2高表達(dá)患者分期較早（表1）。

表1 RASGRP2高低表達(dá)肺腺癌患者臨床基本信息Tab 1 Analysis of clinical data of lung adenocarcinoma patients with high and low expression of RASGRP2

2.2 RASGRP2在肺腺癌中表達(dá)情況及預(yù)后分析 通過TIMER數(shù)據(jù)庫我們發(fā)現(xiàn)RASGRP2在肺腺癌患者的癌旁組織中顯著高表達(dá)（圖1A），之后為證實其在肺腺癌中低表達(dá)，我們使用HPA數(shù)據(jù)庫搜尋RASGRP2在肺腺癌組織中免疫組化染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)RASGRP2在癌旁組織中相比癌組織顯著高表達(dá)（圖1B）。進(jìn)一步通過Kaplan-MeierPlotter數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)RASGRP2高表達(dá)的患者總生存期顯著優(yōu)于低表達(dá)患者（圖1C）。以上結(jié)果說明RASGRP2在肺腺癌癌旁組織相比癌組織顯著高表達(dá)，且RASGRP2高表達(dá)患者預(yù)后更佳。

圖1 RASGRP2在肺腺癌中表達(dá)與預(yù)后情況。A：TIMER數(shù)據(jù)庫預(yù)測RASGRP2在肺腺癌組織表達(dá)情況；B：RASGRP2在肺腺癌及癌旁組織中蛋白表達(dá)情況；C：RASGRP2表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。Fig 1 The expression level and prognostic value of RASGRP2 in patients with lung adenocarcinoma. A: Increased or decreased expression of RASGRP2 in cancers compared with adjacent normal tissue in TIMER database; B: RASGRP2 protein expression in normal tissue and tumor tissue of patients with lung adenocarcinoma; C: The relationship between RASGRP2 expression and prognosis of patients with lung adenocarcinoma.

2.3 通路富集分析明確RASGRP2調(diào)節(jié)相關(guān)通路 對TCGA數(shù)據(jù)庫中RASGRP2高表達(dá)及低表達(dá)患者進(jìn)行基因富集分析后，我們發(fā)現(xiàn)共有234個基因上調(diào)以及3個基因下調(diào)（圖2A）。通過GO及KEGG富集分析后，我們發(fā)現(xiàn)其參與造血細(xì)胞形成及細(xì)胞黏附進(jìn)程中（圖2B），且在GO富集分析中可以發(fā)現(xiàn)RASGRP2在T細(xì)胞活化進(jìn)程中其著重要作用，這提示我們該基因可能可以參與免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)。

圖2 RASGRP2高表達(dá)患者基因通路富集分析。A：火山圖；B：KEGG及GO富集分析。Fig 2 GSEA pathways enriched in samples with high RASGRP2 expression. A: Volcanic map; B: KEGG and GO analysis.

2.4 探索在肺腺癌中與RASGRP2共表達(dá)的基因 在明確RASGRP在肺腺癌中低表達(dá)且可能參與免疫調(diào)節(jié)過程后，我們通過TCGA數(shù)據(jù)庫探索在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，與RASGRP2可能存在共表達(dá)的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZAP70、TBC1D10C、RASAL3、FGD2、CD37、ACAP1與RASGRP2顯著相關(guān)（圖3A），之后我們又通過TIMER數(shù)據(jù)庫對此結(jié)果進(jìn)行了驗證（圖3B）。

圖3 RASGRP2共表達(dá)基因分析。使用TCGA（A）及TIMER（B）數(shù)據(jù)庫分析與RASGRP2共表達(dá)的基因。Fig 3 Co-expressed genes of RASGRP2 in lung adenocarcinoma. The genes co-expressed with RASGRP2 in lung adenocarcinoma were assessed in TCGA (A) and TIMER (B) database.

2.5 RASGRP2及其共表達(dá)基因?qū)Ψ伟┙M織免疫相關(guān)細(xì)胞浸潤水平的影響分析 利用TIMER數(shù)據(jù)庫分析RASGRP2對免疫相關(guān)細(xì)胞浸潤水平影響，研究共分析22種免疫細(xì)胞，包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RASGRP2高表達(dá)會引起CD8+T細(xì)胞、記憶CD4+T細(xì)胞比例升高，中性粒細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例降低（圖4A），這說明RASGRP2高表達(dá)會促進(jìn)免疫效應(yīng)細(xì)胞的募集并降低免疫抑制細(xì)胞比例，從而對腫瘤起到抑制作用。同時，我們發(fā)現(xiàn)RASGRP2的共表達(dá)基因也對免疫浸潤細(xì)胞起到相似的調(diào)節(jié)作用（圖5）。

圖4 RASGRP2不同表達(dá)的肺腺癌患者免疫微環(huán)境改變（G1：高表達(dá)，G2：低表達(dá)）Fig 4 Changes of immune microenvironment in lung adenocarcinoma patients with different expression of RASGRP2 (G1: high expression of RASGRP2, G2: low expression of RASGRP2). *P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001. NK: natural killer.

圖5 RASGRP2共表達(dá)基因?qū)γ庖呓櫦?xì)胞變化水平影響Fig 5 Relationship between RASGRP2 co-expressed genes and tumor-infiltrating immune cells

2.6 RASGRP2表達(dá)與免疫檢查點密切相關(guān) 匯總RASGRP2高低表達(dá)患者并將其分別G1（高表達(dá)）及G2（低表達(dá)）組，使用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，RASGRP2表達(dá)量與常見免疫檢查點CD274、CTLA4、LAG3、TIGIT等表達(dá)量顯著相關(guān)（圖6），提示我們RASGRP2可能與免疫檢查點密切相關(guān)，且有望在免疫治療中發(fā)揮作用。

圖6 RASGRP2表達(dá)量對免疫檢查點表達(dá)的影響Fig 6 The relationship between RASGRP2 and immune checkpoints. ***P＜0.001.

3 討論

肺癌作為當(dāng)今發(fā)病率及死亡率極高的惡性腫瘤，其治療方式也日益增多[10]。目前以PD-1/PD-L1為靶點的免疫檢查點抑制劑無論在晚期NSCLC的一線和二線治療，局部晚期NSCLC的鞏固治療，還是早期NSCLC的新輔助治時我們發(fā)現(xiàn)免疫抑制細(xì)胞比例的降低。對其共表達(dá)基因進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)他們伴隨著RASGRP2表達(dá)改變時也會引起免疫效應(yīng)細(xì)胞如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比例的升高。免疫微環(huán)境中效應(yīng)細(xì)胞比例的升高往往提示患者的較好預(yù)后[13,14]。最后，我們通過TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫分析免疫檢查點的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RASGRP2表達(dá)與免疫檢查點聯(lián)系緊密，這提示著該基因有望成為用于預(yù)測免疫治療的生物標(biāo)志物。療均可以為患者帶來獲益，在NSCLC的綜合治療中顯示出重要地位[11,12]。盡管腫瘤免疫治療在一些患者身上取得了顯著且持久的療效，但抗PD-1/PD-L1治療的整體響應(yīng)率只有20%-30%。一方面，預(yù)測反應(yīng)率的生物標(biāo)志物研究的不足限制了臨床患者治療策略的有效性的提高；另一方面，由于機(jī)體免疫調(diào)節(jié)信號通路錯綜復(fù)雜，耐藥成為免疫治療發(fā)展的一大難題和挑戰(zhàn)。在本項研究中，我們主要探討了RASGRP2在肺腺癌中表達(dá)情況以及其對免疫浸潤細(xì)胞的影響。

本研究首先發(fā)現(xiàn)RASGRP2在肺腺癌組織中低表達(dá)并通過多個數(shù)據(jù)庫對此結(jié)果進(jìn)行驗證，通過TCGA數(shù)據(jù)庫患者的臨床資料匯總，我們發(fā)現(xiàn)RASGRP2與患者性別及分期相關(guān)，并且RASGRP2高表達(dá)患者的分期較早。在確定RASGRP2在腺癌癌旁組織高表達(dá)后，我們發(fā)現(xiàn)RASGRP2高表達(dá)患者同樣具有更好的生存期，以上結(jié)果提示RASGRP2可能是一個抑癌基因。為了進(jìn)一步探索RASGRP2在腺癌中調(diào)控機(jī)制，我們進(jìn)行了通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RASGRP2高表達(dá)與T細(xì)胞活化密切相關(guān)，這提示我們RASGRP2可能參與了免疫浸潤細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中。

同時我們使用TCGA數(shù)據(jù)庫基因譜分析發(fā)現(xiàn)部分與RASGRP2可能存在共表達(dá)的基因，這些基因伴隨著RASGRP2在腺癌組織中低表達(dá)。在TIMER數(shù)據(jù)庫中，我們探索了RASGRP2表達(dá)對于免疫微環(huán)境的影響。結(jié)果如預(yù)期，RASGRP2高表達(dá)會引起免疫效應(yīng)細(xì)胞的比例升高，同

綜上所述，本研究通過使用多種數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)RASGRP2在肺腺癌中的表達(dá)情況及對免疫微環(huán)境的影響。我們發(fā)現(xiàn)RASGRP2在肺腺癌中低表達(dá)且與肺腺癌患者預(yù)后相關(guān)，其可能通過激活效應(yīng)T細(xì)胞從而對腫瘤起到殺傷功能。此外，RASGRP2與免疫檢查點密切相關(guān)，有望在今后免疫治療過程中起到指導(dǎo)作用。