陳振寅 王敏 高三惠 郭花 王桂珍 周光飚

免疫檢查點(diǎn)是調(diào)控T細(xì)胞活性的負(fù)調(diào)節(jié)因子。通過(guò)免疫檢查點(diǎn)抑制劑增強(qiáng)T細(xì)胞功能的腫瘤免疫治療在罹患不同類型腫瘤的患者中都起到了顯著的治療效果。其中，以程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed cell death 1, PD-1）和程序性細(xì)胞死亡受體配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）為靶點(diǎn)的抗體在抗腫瘤治療中的療效較為顯著[1]。PD-1/PD-L1抑制劑主要通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞的結(jié)合，從而幫助T細(xì)胞有效識(shí)別腫瘤細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行清除。研究[2]表明，應(yīng)用PD-L1單抗Pembrolizumab在難治性原發(fā)性縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤成人和兒童患者的有效率高達(dá)81%。

雖然免疫檢查點(diǎn)抑制劑在腫瘤治療中表現(xiàn)出了顯著的療效，但其在增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的同時(shí)，也可能會(huì)引起免疫相關(guān)的不良反應(yīng)（immune-related adverse events,irAEs）[3]。例如第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的免疫檢查點(diǎn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4），其抑制劑Ipilimumab于2011年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)用于黑色素瘤的治療[4]；但CTLA-4的阻斷在激活次級(jí)淋巴器官中的T細(xì)胞時(shí)，會(huì)導(dǎo)致irAEs的發(fā)生。常見(jiàn)的不良反應(yīng)如皮疹，發(fā)生率在43%-45%；消化系統(tǒng)不良反應(yīng)如結(jié)腸炎、腹瀉、肝炎；內(nèi)分泌不良反應(yīng)如下垂體炎、甲狀腺功能減退等，也有著較高的發(fā)生率；而其他irAEs如肺炎、腎炎、神經(jīng)系統(tǒng)和胰腺的不良反應(yīng)發(fā)生率則相對(duì)較低[5,6]。與之類似，PD-L1抑制劑在阻斷PD-1/PD-L1的作用時(shí)，主要通過(guò)重新激活效應(yīng)T細(xì)胞并促進(jìn)其產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子，發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)[7,8]，因而對(duì)正常的免疫系統(tǒng)也有可能產(chǎn)生局部和區(qū)域性的負(fù)面影響。隨著抗PD-1/抗PD-L1抗體在臨床上的抗腫瘤應(yīng)用越來(lái)越廣泛，其導(dǎo)致的不良反應(yīng)也有更多報(bào)道。Moslehi等[9]分析了世界衛(wèi)生組織Vigibase數(shù)據(jù)庫(kù)，報(bào)道了101例患者在應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑后發(fā)生嚴(yán)重心肌炎，且其中46例（46%）患者因之死亡。Al-Kindi等[10]利用FDA藥品不良反應(yīng)報(bào)告系統(tǒng)的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)250例患者在應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑后發(fā)生心肌炎，且其中124例（50%）患者因之死亡。和其他抗腫瘤藥物相比，免疫檢查點(diǎn)抑制劑引起心肌炎的比例明顯更高，且一些患者僅使用1劑-2劑的免疫檢查點(diǎn)抑制劑即可發(fā)生致命性心肌炎[9,10]。因此，在動(dòng)物水平研究免疫檢查點(diǎn)的心臟毒性及減輕毒性的方法，具有重要的實(shí)際意義。免疫檢查點(diǎn)抑制劑已被廣泛用于肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等多種癌癥患者的治療[11-13]?？筆D-1、抗PD-L1抗體的治療效果往往與PD-L1表達(dá)水平等有關(guān)，而其誘發(fā)的不良反應(yīng)在上述所有類型的癌癥患者中均有報(bào)道[14]。因此，在正常小鼠體內(nèi)研究抗PD-L1抗體的毒副作用，可能更具代表性。本文以C57BL/6小鼠為動(dòng)物模型，初步探索了多次尾靜脈注射抗PD-1/抗PD-L1抗體后對(duì)小鼠心臟功能所能產(chǎn)生的不良反應(yīng)及救治方法。

1 材料與方法

1.1 抗體與藥品 抗PD1抗體購(gòu)自Bio X Cell（BE0090, USA），在4oC冰箱避光保存，使用時(shí)用PBS稀釋至2.5 μg/μL?？筆D-L1抗體購(gòu)自Bio X Cell（BE0101, USA），在4oC冰箱避光保存，使用時(shí)用PBS稀釋至2 μg/μL。同型對(duì)照IgG購(gòu)自Bio X Cell（BE0273, USA），在4oC冰箱避光保存，使用時(shí)用PBS稀釋至2 μg/μL。L-甲狀腺素（Levothyroxine）購(gòu)自Solarbio（T9621，北京），在4oC冰箱避光保存，使用時(shí)用1 mol/L NaOH溶液稀釋至50 μg/mL。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) C57BL/6小鼠（雌性，5周齡-6周齡）和A/J小鼠（雌性，5周齡-6周齡）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，在無(wú)特異病原體環(huán)境（specific pathogen free,SPF）飼養(yǎng)1周左右，稱重，體重（20±0.5）g。分組予抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體處理。實(shí)驗(yàn)方法遵循中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物所動(dòng)物管理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)的指南進(jìn)行操作。

1.2.1 抗PD-1抗體 取12只C57BL/6小鼠，通過(guò)尾靜脈注射抗PD-1抗體，劑量按小鼠體重計(jì)算為12.5 μg/g（平均為250 μg/只），每5天注射1次，共注射6次（表1），觀察小鼠存活情況。

1.2.2 抗PD-L1抗體 預(yù)實(shí)驗(yàn)：小鼠分為3組，分別接受抗PD-L1抗體尾靜脈注射，劑量分別為5 μg/g、10 μg/g、15 μg/g，每周注射1次，共注射6次，觀察小鼠存活情況（表1）。根據(jù)小鼠存活情況及臨床患者用量，確定10 μg/g每周注射1次共注射6次的劑量用于正式實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)：34只C57BL/6小鼠分為3組，第一組接受同型對(duì)照IgG尾靜脈注射（n=12），劑量為10 μg/g每周注射1次共注射6次；第二組接受抗PD-L1抗體尾靜脈注射（n=12），劑量為10 μg/g每周注射1次，共注射6次。以體表面積比折算，所使用抗PD-L1抗體劑量相當(dāng)于成年人以1.11 mg/kg用量給藥；第三組為抗PD-L1抗體與L-甲狀腺素聯(lián)合應(yīng)用組（n=10），先腹腔注射L-甲狀腺素0.25 μg/g，30 min后注射抗PD-L1抗體，后者的用法與用量同第二組。

在注射抗PD-L1抗體后，通過(guò)無(wú)創(chuàng)鼠尾動(dòng)脈測(cè)壓儀BP-98A（Softron, Japan）檢測(cè)小鼠的心率和血壓；通過(guò)Vevo 770 High-Resolution Imaging System儀器（Visual Sonics公司）進(jìn)行小鼠心臟超聲檢測(cè)分析；通過(guò)Mouse MonitorTM實(shí)時(shí)小動(dòng)物生命體征監(jiān)護(hù)儀進(jìn)行小鼠心電圖（electrocardiogram,ECG）檢測(cè)分析。小鼠死亡后收集心臟組織，于-80oC保存待用。

1.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色 將福爾馬林固定、石蠟包埋的小鼠心肌組織標(biāo)本切成厚5 μm的切片，通過(guò)二甲苯脫蠟和不同濃度的乙醇對(duì)切片進(jìn)行脫蠟處理。隨后用蘇木精染色5 min后，用鹽酸酒精分化后，用伊紅染液染色1 min-3 min；經(jīng)過(guò)不同濃度梯度的酒精與二甲苯徹底脫水透明后，用中性樹(shù)膠封蓋，在普通光鏡下觀察組織形態(tài)。

1.4 酶聯(lián)免疫標(biāo)記 小鼠血液在室溫自然凝固4 h，3,000 rpm離心20 min，收集上層血清，用樣品稀釋液稀釋5倍后，取50 μL加入包被小鼠游離甲狀腺素（tetraiodothyronine, T4）抗體的微孔板（DUMA biotech，上海，中國(guó)），并在每孔中加入100 μL辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體，用封板膜封住反應(yīng)孔，37oC孵育1 h。孵育完成后，棄去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1 min后棄去洗滌液，如此洗板5次后，每孔加入50 μL底物，在37oC下避光孵育15 min。之后每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到小鼠血清內(nèi)的T4濃度。

1.5 Western blot 將健康C57BL/6小鼠用頸椎脫臼的方式處死，取出小鼠心臟組織，對(duì)組織進(jìn)行研磨后，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液（50 mmol/L TrisHCl pH 7.4、150 mmol/L NaCl、0.1% SDS、1%脫氧膽酸鈉、1% TritonX-100、1 mmol/L EDTA、5 mmol/L NaF、1 mmol/L釩酸鈉和Cocktail蛋白酶抑制劑）在冰上對(duì)研磨后的組織裂解30 min，12,000 rpm離心5 min后棄去沉淀并通過(guò)BCA法對(duì)蛋白提取物進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)（20 μg）經(jīng)10%-15%的SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。用5%脫脂牛奶/Tris緩沖液封閉1 h后，用TBST洗膜。所使用的anti-Mouse-PD-L1一抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司（Beverly, MA,USA），anti-GAPDH一抗購(gòu)自Sigma公司（St.Louis, MO,USA）。經(jīng)一抗與二抗的孵育后用LSA 4000（GE, Fairfield,CO, USA）檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)情況。

1.6 免疫組織熒光 將健康C57BL/6小鼠的心臟組織用組織冰凍切片OTC包埋劑（Sakura Finetek公司，Tokyo，Japan）進(jìn)行包埋，之后用冷凍切片機(jī)（Leica Biosystems, Buffalo Grove,USA）對(duì)包埋樣品進(jìn)行切片，切片厚度為10 μm。所獲得的切片經(jīng)0.3% Triton X-100/PBS室溫破膜處理20 min，之后用5% BSA封閉1 h。切片與anti-PD-L1一抗于4oC孵育過(guò)夜，用PBS清洗切片后加入Alexa Flour 488/647標(biāo)記的二抗（Life technologies），室溫孵育1 h。之后清洗切片，用含DAPI的封片劑封片后保存于4oC。圖像由激光掃描共聚焦顯微鏡（N-STOR, Nikon, Japan）拍攝。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 除非特殊說(shuō)明，所獲得的結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示；采用GraphPad Prism 8.0軟件做圖；采用雙尾Student’s t檢驗(yàn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1在小鼠心臟組織中有較高的表達(dá)水平 PD-L1在黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、頭頸癌、惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等多種腫瘤類型中有較高的表達(dá)，臨床上使用抗PD-L1抗體治療這些癌癥患者也表現(xiàn)出了良好的療效。PD-L1在正常組織中也有一定水平的表達(dá)。首先，我們通過(guò)Western blot檢測(cè)了小鼠心臟組織中的PD-L1的表達(dá)水平，并通過(guò)光密度掃描且以GAPDH為參照對(duì)PD-L1表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD-L1在小鼠心臟組織中有著較高的表達(dá)水平，且在不同小鼠個(gè)體之間有一定（約2.5倍）的差異（圖1A）；免疫組織熒光成像結(jié)果顯示，PD-L1蛋白在心肌細(xì)胞中有著較為廣泛的分布（圖1B）。以上這些結(jié)果表明，PD-L1在小鼠心臟組織中有著較高的表達(dá)水平。

圖1 PD-L1在健康小鼠的心臟組織中高表達(dá)。A：Western blot檢測(cè)小鼠心臟組織中的PD-L1表達(dá)水平。PD-L1條帶下的數(shù)字為光密度掃描并以GAPDH為參照的PD-L1相對(duì)定量值；B：用免疫組織熒光檢測(cè)小鼠心肌組織中PD-L1表達(dá)情況。Fig 1 PD-L1 is highly expressed in heart tissues of healthy mice. A: PD-L1 expression levels in mouse heart tissues were detected by Western blot.Numbers under Western blot bands are the relative expression values to GAPDH determined by densitometry analysis; B: PD-L1 expression in mouse myocardial tissues was detected by immunohistochemical fluorescence. PD-L1: programmed cell death ligand 1.

2.2 抗PD-1抗體不引起小鼠死亡 我們通過(guò)尾靜脈注射，用抗PD-1抗體處理小鼠，在250 μg/只、每5天注射一次連續(xù)注射6次的條件下，所有12只小鼠均未見(jiàn)明顯異常，且在最后一劑抗體注射后2周未見(jiàn)小鼠死亡（表1），說(shuō)明抗PD-1抗體在小鼠是安全的。

2.3 多次靜脈注射抗PD-L1抗體能引起小鼠的死亡 由于健康小鼠心臟組織中PD-L1表達(dá)水平較高，當(dāng)小鼠注射PD-L1抑制劑后，其心臟組織有可能會(huì)受到一定程度的影響。因此，我們通過(guò)多次尾靜脈注射抗小鼠PD-L1抗體至小鼠體內(nèi)，劑量為10 μg/g（約為200 μg/只），每周注射1次，首先觀察了PD-L1抑制劑對(duì)小鼠的狀態(tài)和生存的影響。結(jié)果表明，當(dāng)連續(xù)給予3次-4次抗小鼠PD-L1抗體后，小鼠狀態(tài)表現(xiàn)為蜷縮不動(dòng)，毛發(fā)蓬松臟亂無(wú)光澤，對(duì)外界刺激反應(yīng)明顯減弱、遲緩；當(dāng)連續(xù)給予3次以上抗小鼠PD-L1抗體后，小鼠出現(xiàn)了死亡（圖2A），死亡率為8/12（66.7%）。注射相同劑量的同型對(duì)照IgG并不引起小鼠死亡（表1）。分離死亡小鼠心臟，并對(duì)其稱重后發(fā)現(xiàn)，注射抗PD-L1抗體組的小鼠心臟/體重比值和心臟/脛骨比值均顯著高于IgG組小鼠（圖2B和圖2C）。而組織切片檢查發(fā)現(xiàn)，抗PD-L1抗體處理組心肌細(xì)胞的形態(tài)并非常見(jiàn)的梭形，而表現(xiàn)為肥大的形態(tài)，并出現(xiàn)透明化，血管外可見(jiàn)淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2D）。以上結(jié)果提示多次靜脈注射抗PD-L1抗體能明顯引起小鼠心臟組織毒性反應(yīng)。

圖2 多次尾靜脈注射抗PD-L1抗體導(dǎo)致小鼠生存期縮短和心肌非化膿性炎癥。A：注射抗PD-L1抗體對(duì)小鼠生存時(shí)間的影響；B、C：抗PD-L1抗體治療組小鼠的心重/體重比（B）和心重/脛骨長(zhǎng)（C）比均高于對(duì)照組；D：小鼠接受抗PD-L1治療后心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。Fig 2 Multiple doses of anti-PD-L1 antibody causes mortality and non-suppurative myocarditis in recipient mice. A: The effect of anti-PD-L1 antibody on the overall survival of the mice; B, C: The heart weight/body weight ratio(B) and heart weight/tibial length ratio (C) of mice in the anti-PD-L1 antibody treated group were higher than those in the control group; D: Mice treated with anti-PD-L1 showed significant changes in cardiomyocyte morphology.

表1 抗PD1、抗PD-L1抗體對(duì)小鼠生存的影響Tab 1 Effect of anti-PD-1 and anti-PD-L1 antibodies on the survival of mice

2.4 抗PD-L1抗體能引起小鼠心臟射血功能下降 為了進(jìn)一步驗(yàn)證抗PD-L1抗體對(duì)小鼠心臟功能的影響，我們?cè)谶B續(xù)給予4次-5次抗小鼠PD-L1抗體至小鼠后，對(duì)小鼠的血壓與心肌收縮功能進(jìn)行了檢查。通過(guò)超聲心動(dòng)儀對(duì)注射抗體后小鼠的心臟射血功能進(jìn)行檢測(cè)（圖3A），在注射抗體15 min后，小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)（ejection fractions, EF）、左心室短軸縮短率（fractional shortening, FS）和左心室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume, LVEDV）均顯著降低（圖3B），表明小鼠心臟收縮減弱，射血功能下降。同時(shí)，小鼠心率加快（圖C）。此外，通過(guò)鼠尾動(dòng)脈測(cè)壓儀測(cè)量小鼠血壓發(fā)現(xiàn)，相較于IgG組，小鼠注射抗PD-L1抗體后收縮壓和舒張壓均顯著降低（圖3D），且隨著注射次數(shù)增加，變化趨勢(shì)愈發(fā)明顯，說(shuō)明抗PD-L1抗體對(duì)小鼠心臟的毒性可能有一定的累積性。以上結(jié)果說(shuō)明，多次靜脈注射抗PD-L1抗體能明顯引起小鼠心臟射血功能的下降。

圖3 多次尾靜脈注射抗PD-L1抗體導(dǎo)致小鼠心臟射血功能下降。A：小鼠在注射抗PD-L1單抗0 min、5 min、10 min后的超聲心動(dòng)圖；B：注射抗PD-L1單抗的小鼠射血分?jǐn)?shù)、分?jǐn)?shù)縮短率和左室舒張末期容積顯著降低；C：心率變化；D：小鼠血壓變化。Fig 3 Multiple injections of anti-PD-L1 antibody results in decreased cardiac ejection in mice. A: Echocardiograms of the mice 0, 5 and 10 min after injection of anti-PD-L1 antibody; B: Ejection fraction, fractional shortening and left ventricular end-diastolic volume of the mice; C: Heart rate of the mice; D: Systolic, diastolic, and mean blood pressure of the mice.

2.5 抗PD-L1抗體引起小鼠心電傳導(dǎo)異常 在驗(yàn)證抗PD-L1抗體對(duì)小鼠心臟射血功能的影響的同時(shí)，我們也監(jiān)測(cè)了多次給予抗小鼠PD-L1抗體后，其對(duì)小鼠心電傳導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，在給藥前與給藥15 min后，注射抗PD-L1抗體的小鼠心電圖發(fā)生顯著變化（圖4），小鼠ECG顯示ST段上斜型壓低，TP段出現(xiàn)異常波動(dòng)，提示心臟前壁和外膜下可能已經(jīng)出現(xiàn)缺血，從而導(dǎo)致小鼠心肌收縮力受損。

圖4 小鼠注射抗體后的心電傳導(dǎo)異常Fig 4 Electrocardiographic images of mice treated with anti-PD-L1 antibody

2.6 抗PD-L1抗體引起小鼠體溫調(diào)節(jié)功能異常 小鼠在注射抗小鼠PD-L1抗體后，除了其心臟組織表現(xiàn)出明顯的異常外，還出現(xiàn)顫抖、萎靡等表現(xiàn)，其體溫也表現(xiàn)出了明顯的變化。當(dāng)給予抗小鼠PD-L1抗體后，小鼠體溫顯著降低，30 min逐漸恢復(fù)正常體溫，但其靜息體溫較IgG組則無(wú)顯著變化（圖5A）。小鼠的體溫主要由垂體-下丘腦-甲狀腺軸調(diào)節(jié)。免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療能導(dǎo)致甲狀腺功能受損。因此，我們檢測(cè)了小鼠甲狀腺功能的相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)抗PD-L1抗體組小鼠血清中的游離T4含量較IgG組顯著降低（圖5B），說(shuō)明抗PD-L1抗體能抑制小鼠甲狀腺素的分泌，從而負(fù)反饋調(diào)節(jié)小鼠的體溫。

2.7 L-甲狀腺素顯著抑制抗PD-L1抗體引起的小鼠死亡 由于抗PD-L1抗體注射后，小鼠出現(xiàn)的明顯癥狀是寒顫和體溫降低，且血清中游離T4明顯降低，我們因此提出，補(bǔ)充甲狀腺素能否拯救小鼠免于死亡。我們于是在注射抗PD-L1抗體前30 min預(yù)先通過(guò)腹腔注射0.25 μg/g L-甲狀腺素，發(fā)現(xiàn)與單用抗PD-L1抗體組小鼠相比，L-甲狀腺素的使用可顯著抑制小鼠體溫的降低（圖5B），小鼠的不活躍狀態(tài)得到了很大的緩解，且無(wú)小鼠死亡（圖6）。這些結(jié)果說(shuō)明，L-甲狀腺素可拮抗抗PD-L1抗體的毒性，使小鼠死亡率降低。

圖5 多次尾靜脈注射抗PD-L1抗體引起小鼠體溫降低及游離T4水平下降。A：注射抗PD-L1抗體的小鼠體溫顯著降低，補(bǔ)充甲狀腺素后體溫恢復(fù)正常；B：注射抗PD-L1抗體的小鼠游離T4水平較對(duì)照組低。Fig 5 Multiple injections of anti-PD-L1 antibody causes a decrease in body temperature and free T4 levels in mice. A:Body temperature of mice injected with anti-PD-L1 antibody; B: Serum free T4 levels of mice injected with anti-PD-L1 antiboy. T4:tetraiodothyronine.

圖6 補(bǔ)充L-甲狀腺素可顯著降低抗PD-L1抗體引起的小鼠死亡率Fig 6 Levothyroxine significantly reduces anti-PD-L1 antibodyinduced mortality in mice

3 討論

目前，抗PD-L1的抗體Atezolizumab、Durvalumab（MEDI4736）與Avelumab均已被FDA批準(zhǔn)用于多種癌癥的臨床治療，且取得了較好的治療效果[15-17]。與具有嚴(yán)重全身副作用的免疫檢查點(diǎn)CTLA-4抑制劑相比，阻斷PD-1/PD-L1相互作用所出現(xiàn)的臨床不良反應(yīng)相對(duì)較少[5]。然而在臨床應(yīng)用中，使用抗PD-1/PD-L1抗體也會(huì)出現(xiàn)多種不良反應(yīng)，較典型的irAEs往往出現(xiàn)于皮膚、胃腸道、肝臟與內(nèi)分泌系統(tǒng)[18]，也會(huì)影響眼和大腦組織等免疫豁免區(qū)域[19-21]。而在各種免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)用中，抑制劑對(duì)心臟的不良反應(yīng)近來(lái)引起了廣泛關(guān)注。在一項(xiàng)抗PD-L1抗體的I期臨床試驗(yàn)中，有1例患者用藥后出現(xiàn)了明顯的心肌炎；而抗PD-1抗體Pembrolizumab與CTLA-4抗體Ipilimumab引起心臟損傷也已有報(bào)道[4,22,23]。盡管免疫檢查點(diǎn)阻斷劑所引起的心臟的不良反應(yīng)的報(bào)道相對(duì)較少，但一旦誘發(fā)產(chǎn)生心臟損傷，其后果往往較為嚴(yán)重。在近年的報(bào)道中，嚴(yán)重的心臟不良反應(yīng)發(fā)生率有所上升：在2012年-2015年僅報(bào)道了18例，2016年報(bào)道了70例，而2017年報(bào)道了162例[9]。在250例發(fā)生心肌炎的患者中，死亡率在不同年齡、性別、治療方案（抗PD-1/PD-L1或抗CTLA-4）及報(bào)告年份的患者中基本相同。心臟不良反應(yīng)的發(fā)生往往具有暴發(fā)性，發(fā)展較為迅速，并經(jīng)常伴隨著與危重病相關(guān)的并發(fā)癥，而這些并發(fā)癥同樣可能成為最直接的死亡原因[24]。相對(duì)于心臟不良反應(yīng)的高死亡率及嚴(yán)重性，對(duì)它的研究則略顯不足。除了臨床用藥時(shí)的警告和不良反應(yīng)發(fā)生后的補(bǔ)救治療外，對(duì)心臟不良反應(yīng)的基礎(chǔ)研究與動(dòng)物建模也應(yīng)逐步開(kāi)展。

甲狀腺功能受損是較為常見(jiàn)的不良反應(yīng)。在PD-1或PD-L1抑制劑的臨床試驗(yàn)中，甲狀腺功能障礙的發(fā)生率一般在4%-19.5%之間[25]。而在一項(xiàng)Pembrolizumab治療非小細(xì)胞肺癌的臨床研究中，7.8%的患者發(fā)生了甲狀腺功能減退[14]。

本研究中，抗PD-L1抗體對(duì)小鼠的影響大致可分為兩個(gè)時(shí)期：一是注射后約1 h內(nèi)的急性期，在這段時(shí)間內(nèi)，小鼠表現(xiàn)出明顯的不活躍、蜷縮不動(dòng)的狀態(tài)，心臟功能受到較顯著的影響，包括心臟射血功能下降和心電傳導(dǎo)異常，體溫顯著下降，小鼠死亡一般出現(xiàn)在此時(shí)期。當(dāng)小鼠能渡過(guò)此急性毒性期后，小鼠的狀態(tài)和體溫能夠恢復(fù)到正常；這些變化雖然沒(méi)有引起小鼠急性的毒性反應(yīng)，但這些心臟異常反應(yīng)和體溫異常變化可能對(duì)小鼠造成慢性毒性。此外，通過(guò)L-甲狀腺素的補(bǔ)充可以有效緩解由抗PD-L1抗體引起的急性癥狀，并顯著降低抗PD-L1抗體引起的死亡率，說(shuō)明甲狀腺功能障礙可能也是抗PD-L1抗體引起小鼠死亡的重要原因之一。另外，抗PD-L1抗體可引起小鼠致命性心肌炎，而抗PD-1抗體不會(huì)引起，說(shuō)明小鼠心肌細(xì)胞表達(dá)的PD-L1在其中可能發(fā)揮重要作用。詳細(xì)的作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

自從將irAEs描述為一種新的臨床實(shí)體以來(lái)，人們對(duì)在小鼠中建立irAEs模型的興趣日益濃厚，以期開(kāi)發(fā)出克服這些毒副作用的方法，從而促進(jìn)癌癥免疫治療的發(fā)展[26]。然而動(dòng)物模型的研究進(jìn)展卻較為緩慢，其原因可能是由于小鼠腫瘤模型與免疫系統(tǒng)與人類的差異較大；另一方面，小鼠通常對(duì)irAE具有更強(qiáng)的抵抗力，因此難以找到能夠真實(shí)再現(xiàn)irAEs的方法。本項(xiàng)研究的局限性在于，小鼠所使用的抗PD-L1抗體與臨床上所應(yīng)用的PD-L1抑制劑不盡相同，抗PD-L1抗體導(dǎo)致的免疫相關(guān)不良反應(yīng)是否具有明顯的藥物特異性則仍有待研究。因此本文小鼠實(shí)驗(yàn)中由抗PD-L1抗體所表現(xiàn)的對(duì)小鼠心臟的不良反應(yīng)和體溫過(guò)低癥狀對(duì)臨床指導(dǎo)用藥僅作一定的參考借鑒。

目前，免疫治療導(dǎo)致的甲狀腺功能障礙的具體機(jī)制尚未探明。而抗PD-L1抗體導(dǎo)致的甲狀腺功能減退說(shuō)明抑制PD-1/PD-L1的免疫調(diào)節(jié)極有可能是原發(fā)性甲減發(fā)生的原因之一。因此，本研究結(jié)果表明，在應(yīng)用PD-1/PD-L1抑制劑的腫瘤免疫治療的同時(shí)，應(yīng)該警惕其所導(dǎo)致的心臟損傷以及其對(duì)神經(jīng)免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的負(fù)調(diào)節(jié)作用。