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        氣相色譜法測定藜麥中肌醇的方法研究

        2021-07-01 09:41:56張艷紅彭鐮心趙鋼
        江蘇農業(yè)科學 2021年10期
        關鍵詞:藜麥肌醇氣相色譜法

        張艷紅 彭鐮心 趙鋼

        摘要:采用氣相色譜法檢測藜麥中肌醇的含量。樣品用70%乙醇超聲提取30 min,取上清液減壓蒸發(fā)至干,加入4 mL硅烷化試劑80 ℃衍生20 min,經正己烷萃取后,經HP-5色譜柱分離,F(xiàn)ID檢測器測定,以出峰時間定性,外標法定量。結果表明,肌醇在0~20 μg/mL,肌醇的濃度與峰面積呈良好的線性關系,相關系數(shù)r2>0.999,檢出限和定量限分別為0.5 mg/100 g和1.5 mg/100 g,在3個添加水平下回收率為89.5%~102.3%,相對標準偏差為3.1%~4.9%。說明該檢測方法靈敏、準確、重復性好,適用于藜麥中肌醇含量的測定。

        關鍵詞:藜麥;肌醇;氣相色譜法

        中圖分類號: S512.901 ?文獻標志碼: A ?文章編號:1002-1302(2021)10-0162-04

        藜麥(Chenopodium quinoa Willd.)屬于莧科藜屬一年生雙子葉植物[1],是聯(lián)合國國際糧農組織(FAO)確認的唯一一種能滿足人體基本營養(yǎng)需求的單體植物,被正式推薦為最適宜人類的完美“全營養(yǎng)食品”,具有“超級谷物”之美譽。它含有豐富的蛋白質、淀粉、脂肪、礦物質和維生素等常規(guī)營養(yǎng)成分,還含有黃酮、多酚、槲皮素、皂苷、凝集素等生物活性營養(yǎng)成分[2],在抗氧化、抗癌、抗炎、降糖降脂、減肥等方面有著較為廣泛的應用[3]。

        肌醇,別稱環(huán)己六醇,廣泛存在于各種動植物和微生物體內,在蕎麥、南瓜、長角豆和柑橘等農作物中均含有豐富的肌醇[4-7]。肌醇是動物和微生物的生長因子,其化學結構類似于葡萄糖,因此具有多羥基化合物所具有的化學性質[8-9],且具有類似維生素B1和生物素的作用,它能促進脂肪代謝,降低體內膽固醇和甘油三酯水平,對脂肪肝、肝硬化和糖尿病等疾病有免疫、預防和治療的作用[10-11]。根據(jù)GB 14880―2012《食品安全國家標準 食品營養(yǎng)強化劑使用標準》要求,肌醇被允許在調制乳粉(僅限兒童用乳粉)、果蔬汁(肉)飲料(包括發(fā)酵型產品等)和風味飲料中限量添加[12]。

        目前尚未發(fā)現(xiàn)專門針對藜麥中肌醇含量測定的相關報道和研究。有關文獻報道的肌醇檢測方法多適用于嬰幼兒食品、乳品、飲料和保健食品等,常用的檢測方法有高碘酸鉀氧化法[13-14]、微生物法[15-16]、液相色譜法[4,17]、液相色譜-質譜法[18]、氣相色譜法[19-21]、氣相色譜-質譜法[22-23]、毛細管電泳法[24]、離子色譜法[25]等。本試驗在國家標準方法的基礎上[15,21],采用硅烷化衍生法對肌醇進行衍生后,采用氣相色譜法對藜麥中肌醇的衍生物進行定性定量分析,通過對前處理及衍生方法進行考察,并進行系統(tǒng)性的方法學驗證,建立了一種準確可行的藜麥中肌醇的氣相色譜測定方法,以期為藜麥中肌醇的檢測提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗儀器、試劑和材料

        7890B氣相色譜儀:帶FID檢測器,美國Agilent公司;CP224S電子天平:德國Sartorius公司;Allegra 64R離心機:美國Beckman Coulter公司;旋轉蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;KQ5200B型超聲波儀:昆山市超聲儀器有限公司;恒溫熱水浴槽:北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

        肌醇標準品(≥99%):美國Sigma-Aldrich公司;正己烷:美國Fisher公司;無水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺:北京迪馬科技有限公司;三甲基氯硅烷:梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;六甲基二硅胺烷:瑞士Fluka公司。

        測試樣品藜麥購買于成都家樂福超市,分別為晨億、眾恬、尚貢、倉天然和 CASA VERDE GOURMET共5個品牌的藜麥米。

        1.2 肌醇含量測定方法

        1.2.1 色譜條件和系統(tǒng)適應性試驗 色譜柱:HP-5(30 m×0.32 mm,0.25 μm);氮氣流速:1.0 mL/min;進樣口溫度:280 ℃;檢測器溫度:300 ℃;進樣體積:1.0 μL;進樣模式:分流;分流比:10 ∶ 1;溫度程序:120 ℃,保持2 min,以10 ℃/min 升溫至280 ℃,保持5 min。檢測器:氫火焰離子化檢測器(FID)。在上述色譜條件下,肌醇保留時間為11 min左右,且達到峰形對稱,分離良好,標準溶液圖譜和藜麥樣品中肌醇代表性圖譜見圖1和圖2。

        1.2.2 溶液配制 肌醇標準溶液:稱取100 mg(精確到0.1 mg)經過105 ℃烘干2 h的肌醇標準物質于100 mL容量瓶中,用70%乙醇溶解并定容至刻度,混勻,配制成 1.0 mg/mL肌醇標準儲備液,4 ℃ 條件下保存。取1 mL肌醇標準儲備液用70%乙醇定容至100 mL,得到濃度為10 μg/mL的標準工作液。硅烷化試劑:分別吸取體積比為 1 ∶ 2 ∶ 8的三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、N,N-二甲基甲酰胺,混勻,臨用現(xiàn)配。

        1.2.3 樣品前處理 (1)試驗處理。稱取試樣2 g于25 mL容量瓶中,加入2/3體積70%乙醇溶液,超聲提取30 min,用70%乙醇定容至刻度,混勻,過濾。取過濾后溶液5 mL于旋轉蒸發(fā)瓶中。(2)衍生。向濃縮瓶中加入10 mL無水乙醇,在 80 ℃ 水浴旋轉濃縮至近干時再加入5 mL無水乙醇繼續(xù)濃縮至徹底干燥。向濃縮瓶中加入4 mL硅烷化試劑,溶解后轉移至有螺紋蓋的離心管中,放置于(80±2) ℃水浴鍋中進行衍生反應20 min,反應后取出冷卻至室溫,加入10 mL水,混勻后再加入 5 mL正己烷,渦旋 2 min,離心分層后,取上層清液供氣相色譜儀測定。

        2 結果與分析

        2.1 超聲時間對肌醇含量的影響

        設置超聲時間為10、20、30、40、50、60 min進行含量測定試驗,結果見圖3。結果表明,超聲時間對藜麥中肌醇含量的影響較為明顯,肌醇含量隨超聲時間的延長而升高,當超聲時間到達30 min時,肌醇含量達到最大,當超聲時間大于30 min時,肌醇含量基本持平。因此,確定超聲時間為30 min。

        2.2 不同濃度的乙醇提取對肌醇含量的影響

        試驗以純水、10%~100%乙醇(共11個濃度梯度)作為提取溶劑進行考察,結果見圖4。結果表明,不同濃度乙醇對藜麥中肌醇含量的影響較小,總體看來,隨著乙醇濃度的升高肌醇的含量隨之增加,當乙醇濃度達到70%時,從藜麥中提取的肌醇含量達到最大,當乙醇濃度高于70%時,肌醇的含量有明顯的下降。因此,選擇70%乙醇作為提取溶劑。

        2.3 硅烷化條件的考察

        選擇“1.2.2”節(jié)中的硅烷化試劑作為衍生化試劑,按照“1.2.3”節(jié)的方法對藜麥進行前處理,比較肌醇衍生物在氣相色譜儀測得的峰面積,考察硅烷化試劑用量、 衍生溫度和時間對藜麥中肌醇含量測

        定的影響。

        2.3.1 衍生劑用量的考察 選取硅烷化試劑用量分別為2、4、6、8、10 mL肌醇進行衍生反應,于80 ℃水浴中反應20 min,再加入5 mL正己烷萃取肌醇衍生物后,上機測定,得到不同條件肌醇衍生物的峰面積響應,結果見圖5。結果顯示,當硅烷化試劑用量為4 mL時,試樣中的肌醇已經完全被衍生化,因此,選擇衍生劑的用量為4 mL。

        2.3.2 衍生溫度的考察 選擇硅烷化試劑用量為4 mL,選取衍生溫度為50、60、70、80、90 ℃,衍生反應時間為20 min,結果見圖5。結果表明,衍生溫度在50、60 ℃時,肌醇衍生物的峰面積低于其他溫度,70~90 ℃肌醇衍生物峰面積響應較高且無明顯差別。有文獻報道,肌醇衍生溫度高于80 ℃時,才可生成化學結構穩(wěn)定的六(三甲硅氧基)環(huán)己烷[26],因此選擇80 ℃作為肌醇硅烷化衍生溫度。

        2.3.3 衍生時間的考察 選擇衍生劑用量為 4 mL,衍生溫度為80 ℃,選取衍生時間為5、10、20、30、40 min,結果見圖5。結果表明,隨著衍生時間不斷的增加,衍生物峰面積變化趨勢不明顯。綜合考慮,確定衍生化試劑用量為4 mL,衍生溫度為 80 ℃,衍生時間為20 min,該條件能滿足藜麥中肌醇測定的衍生化反應。

        2.4 方法學考察

        2.4.1 標準曲線、檢出限(LOD)和定量限(LOQ) 分別吸取0.0、0.2、0.5、2.0、5.0、8.0、10.0 mL肌醇標準工作溶液于旋轉蒸發(fā)瓶中,按照“1.2.2”步驟操作,獲得0~20 μg/mL肌醇標準系列溶液,在氣相色譜條件下分析測定。以肌醇的濃度為橫坐標(x),對應的峰面積為縱坐標(y),進行線性回歸,以信號噪音比值(S/N)計算方法檢出限(LOD)和方法定量限(LOQ),其中3倍S/N作為LOD,10倍 S/N 作為LOQ,結果見表1。

        2.4.2 精密度試驗 稱取8份藜麥樣品,按本試驗方法進行前處理和上機測定,結果見表2。平均值為13.2 mg/100 g,RSD為2.10%。

        2.4.3 加標回收試驗 采用標準添加法,在樣品中添加100、250、500 μg 3個濃度梯度的肌醇進行加標回收試驗,每次各濃度進行3個平行試驗,并重復3次,計算加標回收率和批內、批間的RSD值,結果見表3。由表3可知,方法回收率為89.5%~102.3%,批內和批間RSD值均小于10%,表明該方法具有良好的準確性和重現(xiàn)性。

        2.4.4 實際樣品測定 采用本方法對超市購買的5種不同品牌藜麥的肌醇進行含量測定,肌醇的含量分別為16.3、13.6、20.8、12.4、15.2 mg/100 g,采用該方法測定藜麥中的肌醇,能較好地進行目標物的定性和定量測定,可準確測定藜麥中的肌醇含量。

        3 結論與討論

        3.1 樣品前處理方法的選擇

        本研究分別比較了不同超聲時間、不同濃度乙醇提取和不同硅烷化衍生條件,結果以70%乙醇超聲提取30 min,衍生劑用量為4 mL在80 ℃條件下衍生20 min,肌醇的提取效率最高,衍生后上機測定的峰面積最大。

        3.2 測定方法的選擇

        目前,有關文獻報道的肌醇檢測方法中,高碘酸鉀氧化法適用于肌醇含量較高樣品的檢測,微生物法步驟繁瑣,檢測周期長,液相色譜法一般采用示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器,該方法靈敏度低,且檢測器類型不太常見,應用受到一定限制,液相色譜-質譜法、氣相色譜-質譜法和氣相色譜-質譜/質譜法靈敏度高,選擇性好,但儀器價格昂貴,很多實驗室不具備檢測條件。

        本研究建立了藜麥中肌醇的氣相色譜測定方法,該方法檢出限低、定量準確、靈敏度高、重復性好,可消除雜質對目標物的影響,各項技術指標均能滿足日常藜麥分析檢測要求,可為藜麥中肌醇測定提供可靠的檢測方法依據(jù)。

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