孫 莉，朱晉升，代蕾穎，宋 偉，楊 忠，王會如

（北京市醫(yī)療器械檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局體外診斷試劑質(zhì)量評價重點實驗室，北京101111）

0 引言

新型冠狀病毒肺炎(以下簡稱“新冠肺炎”)疫情自發(fā)生以來在全國迅速蔓延，嚴重威脅人民的生命安全和身體健康[1-2]。面對新冠肺炎疫情，只有做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，才能進一步控制疾病的傳播。目前，臨床診斷新冠肺炎主要采用病毒核酸檢測[3]，但由于該方法受到操作環(huán)境、儀器設(shè)備和操作人員等因素的限制，血清學(xué)檢測越來越引起人們的重視。目前，基于抗體的診斷指標(biāo)已經(jīng)被歸入《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第7版)》，以實現(xiàn)對核酸檢測的有效補充，這大大提升了新冠肺炎早期確診的準(zhǔn)確率，可為后期臨床治療進行輔助判定。截至2020年7月，在國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站可查到的取得注冊證的新型冠狀病毒(以下簡稱“新冠病毒”)檢測試劑盒為44種，其中抗體檢測試劑盒21種，占47．7%；核酸檢測試劑盒23種，占52．3%；新冠病毒免疫類試劑盒中膠體金法抗體檢測試劑盒取得注冊證的為7種，占15．9%；無抗原檢測試劑盒獲批。膠體金法抗體檢測試劑盒憑借其耗時較短、成本低、不易受到環(huán)境限制且操作簡便快捷等優(yōu)點在此次疫情防控中發(fā)揮了重要作用，但特異性差、陽性檢出率低、陰性樣本易出現(xiàn)假陽性結(jié)果、檢出限高是這類試劑盒的主要問題。本研究選擇具有代表性的6種國產(chǎn)IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)，測試15例陽性樣本，比較其陽性符合率，并通過20例陰性樣本和國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來比較試劑盒陰性符合率和檢出限。

1 材料與方法

1.1 樣本及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》中確診病例判斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇感染1周后的陽性滅活樣本15例以及同期健康體檢者陰性滅活血清樣本20例。

采用新冠病毒刺突糖蛋白(S蛋白)人源IgG單克隆抗體溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號：GBW(E)091109。使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)說明書中推薦的0．01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(pH=7．4)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶12、1∶16的比例稀釋，加上原倍液，共6個水平。本研究采用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是以新冠病毒重組刺突糖蛋白(S蛋白)為免疫原篩選出的IgG單克隆抗體進行人源化改造的模擬人血清。而6種試劑盒均為定性檢測，未規(guī)定檢出限。因此用不同梯度稀釋國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測試檢出限時，不對具體濃度進行關(guān)注，只橫向比較稀釋度。

1.2 試劑及儀器

新冠病毒IgG抗體檢測試劑盒分別來自于A、B、C、D、E、F 6個國內(nèi)生產(chǎn)廠家。檢測原理：在膠體金試條的檢測線位置包被重組新冠病毒抗原(S蛋白)，當(dāng)樣本中含有新冠病毒IgG抗體時，檢測線處的抗原與其結(jié)合，同時，該抗體與被膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgG單克隆抗體結(jié)合，則在檢測線處形成肉眼可見的條帶。當(dāng)質(zhì)控線處和檢測線處均顯示條帶時，則判為陽性；當(dāng)質(zhì)控線處顯示條帶，而檢測線處無條帶時，則判為陰性。

所需儀器和設(shè)備為生物安全柜[力新儀器(上海)有限公司，型號為HFsafe-1500]、移液器(德國Eppendorf公司，規(guī)格為2～20μL)。

1.3 方法

1.3.1 試劑盒檢測方法

應(yīng)嚴格按照試劑盒說明書的要求操作，注意說明書中對環(huán)境條件的要求。具體操作過程見表1，6個生產(chǎn)廠家說明書中對檢測條件的要求基本相同，其中有1個廠家沒有明確上樣量。

表1 試劑盒檢測方法說明

1.3.2 陽性符合率

按照試劑盒說明書進行操作，分別取6種檢測試劑盒測試15例滅活的臨床陽性樣本，每個樣本檢測1次。

1.3.3 陰性符合率

按照試劑盒說明書進行操作，分別取6種檢測試劑盒測試20例滅活的臨床陰性樣本，每個樣本檢測1次。

1.3.4 檢出限

按照試劑盒說明書進行操作，分別取6種檢測試劑盒測試國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋液，每個水平檢測3次，共6個水平。

1.4 數(shù)據(jù)分析

計算試劑盒的陽性符合率和陰性符合率，對照檢出限結(jié)果，比較6種試劑盒之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 陽性符合率

分別對確診的15例新冠肺炎臨床陽性樣本進行檢測，計算每種試劑盒的陽性符合率。結(jié)果顯示，陽性符合率在90．0%～100．0%的有3種，80．0%～＜90．0%的有1種，70．0%～＜80．0%的有2種；其中，試劑盒D的陽性符合率最好，為100．0%，試劑盒C和E的陽性符合率均為93．3．%，試劑盒A的陽性符合率為80．0%，試劑盒B和F的陽性符合率最差，均為73．3%，詳見表2。

表2 新冠病毒IgG抗體檢測試劑盒陽性符合率結(jié)果比較

2.2 陰性符合率

分別對20例臨床陰性樣本進行檢測，計算每種試劑盒的陰性符合率。結(jié)果顯示，6種試劑盒的陰性符合率均為100．0%，詳見表3。

表3 新冠病毒IgG抗體檢測試劑盒陰性符合率結(jié)果比較

2.3 檢出限

采用6種試劑盒測試國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋成的不同梯度溶液，結(jié)果為在稀釋比1∶16水平檢出的試劑盒有1種，在1∶12水平檢出的有2種，在1∶8水平檢出的有3種，在1∶4和1∶2水平檢出的均有5種，原倍6種試劑盒均檢出。其中，試劑盒D的檢出限最低，試劑盒A、C、E的檢出限水平居中，試劑盒F的檢出限最高，6種試劑盒的檢出限呈梯度分布，詳見表4。

表4 新冠病毒IgG抗體檢測試劑盒檢出限結(jié)果比較

3 討論

在新冠肺炎疫情期間，雖然核酸檢測在臨床診斷中作為“金標(biāo)準(zhǔn)”存在，但新冠病毒感染患者主要表現(xiàn)為下呼吸道感染，且治療后體內(nèi)病毒含量逐漸降低，核酸檢測受樣本采樣部位和時間的影響易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。在核酸檢測前需對樣本進行病毒滅活處理，也有研究表明，病毒滅活過程對于病毒含量較高的樣本檢出率無明顯影響，但可能會導(dǎo)致病毒含量較低樣本的檢出率下降，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果[4]。目前已有回顧性研究表明，高度疑似新冠病毒感染患者的病毒核酸陽性檢出率僅為30%～50%[5]。另外，核酸檢測對儀器設(shè)備、檢測場地和環(huán)境條件以及操作人員的要求較高，存在檢測時間長、通量低等缺點。而膠體金法抗體檢測試劑盒的優(yōu)勢在于采集樣本容易、單個樣本即可測試、測試時間短、成本低、樣本處理和實驗操作簡單，非常適合基層大批量樣本的現(xiàn)場篩查[6-8]。因此，將膠體法抗體檢測試劑盒檢測和核酸檢測結(jié)合使用并聯(lián)合咽拭子、糞便和血液等多種樣本進行檢測診斷，對縮短檢測窗口期、盡早控制疫情發(fā)展非常重要[9]。

鑒于新冠病毒傳染性較強，早發(fā)現(xiàn)、早報告、早隔離、早治療對于疾病防控的意義重大[10]。而膠體金法抗體檢測試劑盒的檢出限與其在低值樣本中檢出陽性的能力有關(guān)，檢出限低的試劑盒漏診率也低[11]。因此，除了陽性符合率和陰性符合率以外，檢出限也是評價新冠病毒檢測試劑盒的重要指標(biāo)。當(dāng)然，這里需要明確的是，試劑盒的檢出限指的是由給定測量程序得到的測量值，對于此值，在給定聲稱物質(zhì)中存在某成分的誤判概率為α?xí)r，聲稱不存在該成分的誤判概率為β[12]，與臨床的“真陽”不盡相同。

目前，新冠病毒抗體檢測試劑盒分為刺突糖蛋白S或核衣殼蛋白N作為包被抗原。S蛋白是病毒感染人體細胞的武器，SARS冠狀病毒和新冠病毒都是通過S蛋白結(jié)合呼吸道上皮細胞的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2，從而侵入肺組織，導(dǎo)致肺炎[13]。新冠病毒N蛋白與SARS冠狀病毒N蛋白具有高度同源性[14]，N蛋白是冠狀病毒中產(chǎn)生最早且含量較多的蛋白質(zhì)，具有很強的免疫原性和特異性，是抗體診斷材料的首選。但是N蛋白抗體基本上在發(fā)病10 d才開始大量產(chǎn)生，有研究認為N蛋白抗體作為早期診斷指標(biāo)可能存在一定的不足[15-16]。因此，市面上絕大多數(shù)抗體檢測試劑盒選擇重組S蛋白包被檢測線。本研究選擇的6種國產(chǎn)試劑盒均為抗新冠病毒S蛋白IgG抗體檢測試劑盒。

通過研究結(jié)果可知：(1)試劑盒A和B的檢出限較低，但陽性符合率分別為80．0%和73．3%，不及檢出限居中的試劑盒C和E(陽性符合率均為93．3%)?？紤]以下幾方面原因：①選擇的國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是以新冠病毒重組刺突糖蛋白(S蛋白)為免疫原篩選出的IgG單克隆抗體進行人源化改造的模擬人血清，當(dāng)試劑盒選擇的特異性識別位點以及肽段長度接近于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時，則檢出限低；②有研究表明，重組蛋白誘導(dǎo)的免疫效率較低，可能與免疫途徑相關(guān)[17-18]。同時，選擇的蛋白表達系統(tǒng)不同，也會影響試劑盒的陰性符合率、陽性符合率和檢出限[19-20]。③定性試劑盒的說明書中對檢驗方法的操作描述并不規(guī)范，比如，雖然樣本稀釋液都是2滴，但實際這6家生產(chǎn)廠家對2滴樣本稀釋液的具體體積解釋最低的約為60μL，最高的約為100μL，跨度較大，對檢出限的檢測結(jié)果也有影響。

(2)試劑盒D的檢出限最低，且陽性符合率為100．0%，陰性符合率也為100．0%。試劑盒D為多點抓取，多種重組蛋白嵌合抗原覆蓋的抗原表位比單一重組蛋白要多得多[21-22]，而檢出限最高且陽性符合率為73．3%的試劑盒F則為兩點識別。因此，試劑盒D檢測臨床樣本的陽性符合率和陰性符合率都更好。

(3)試劑盒F的檢出限最高，且陽性符合率為73．3%，陰性符合率為100．0%，與其他試劑盒相比差異較大。分析除了上面提及的特異性識別位點不同、蛋白表達系統(tǒng)不同、樣品稀釋液的量值解釋不同以外，上樣量也是影響檢出限檢測結(jié)果的一個原因。有研究表明，上樣量、樣品稀釋液、反應(yīng)時間和檢測環(huán)境均會對膠體金法檢測試劑盒的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響[23-24]。試劑盒F說明書中關(guān)于上樣量的描述是“吸管1滴”，不同操作者及手法、不同環(huán)境條件都會對上樣量產(chǎn)生影響，從而影響檢測結(jié)果。

綜上所述，對膠體金試條而言，樣本經(jīng)過試條的時間長短、操作環(huán)境以及標(biāo)記抗體的純度都會影響金顆粒的聚集以及非特異性結(jié)合，進而影響結(jié)果判定[25]。為了提高國產(chǎn)新冠病毒抗體檢測試劑盒的性能，建議生產(chǎn)廠家從以下幾方面優(yōu)化產(chǎn)品：(1)加大研發(fā)投入，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)廠家可以同步采用原核和真核表達系統(tǒng)進行新冠肺炎多種病毒蛋白表達，并針對多種蛋白質(zhì)特異多肽片段進行融合表達，優(yōu)化組合，篩選出具有較強免疫原性和特異性的蛋白質(zhì)或設(shè)計蛋白聯(lián)合檢測，以提高試劑盒的陽性符合率、陰性符合率和檢出限；(2)做好供應(yīng)商評價，嚴格把握出廠檢驗，生產(chǎn)廠家內(nèi)部質(zhì)控盤的設(shè)定應(yīng)盡量貼近臨床實際使用情況；(3)通過規(guī)范說明書中對操作方法和環(huán)境要求的描述來提高試劑盒的穩(wěn)定性，在操作過程中應(yīng)嚴格按照說明書操作。

本研究僅為初步探索，納入樣本數(shù)較少，觀點具有一定的局限性，有待后續(xù)進一步研究。