賈洪川，魏華威，姚 華

1 北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京昌平區(qū) 102206

2 北京優(yōu)尼賽斯科技有限公司，北京朝陽區(qū) 100024

3 中華人民共和國北京海關(guān)，北京朝陽區(qū) 100006

0 引言

在奶牛養(yǎng)殖過程中，抗生素用于牛只疾病預(yù)防及治療，使用頻繁[1]。原奶中抗生素殘留既會對人類健康產(chǎn)生不利影響，也會讓奶牛產(chǎn)生抗生素耐藥性，增加疾病治療的難度等[2～4]。戴爾沃牛奶抗生素檢測試劑盒（Delvotest SP NT）是目前在奶牛養(yǎng)殖基層原奶抗生素殘留檢測應(yīng)用最普遍的方法之一，該方法采用嗜熱芽孢桿菌抑制法，是國際抗生素殘留檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]。其原理是培養(yǎng)基微孔中預(yù)先混合好嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢，并含有pH指示劑（溴甲酚紫），加入樣品并在64℃左右孵育，若樣品中不含有抗生素或者抗生素濃度低于檢出限，細菌芽孢在培養(yǎng)基中生長不受抑制，并利用糖產(chǎn)生酸，pH指示劑則會由紫色變成黃色。相反，如果加入的樣品含有抗生素或抗生素濃度高于檢出限，則細菌生長受抑制，培養(yǎng)基不會變色，仍為紫色[6]。本文參照牛乳中獸藥殘留國家要求[7]，對Delvotest SP NT靈敏度進行了驗證試驗。

1 試驗設(shè)備與材料

1.1 試驗設(shè)備

10μL、100μL和1L的移液槍頭及配套移液器，（64±2）℃恒溫水浴鍋或金屬溫育器，0.01g電子秤，100mL量筒，5mL一次性離心管。

1.2 試驗材料

Delvotest SP NT：批次17B20A35，青霉素G、頭孢氨芐、林可霉素各1mg/kg濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，脫脂牛乳粉，純凈水。

2 試驗步驟

2.1 脫脂乳的配置

使用離心管稱取1g脫脂牛乳分粉，然后加入9mL純凈水，混勻備用。

2.2 樣本制備

吸取10μL青霉素G標(biāo)品，加入990μL脫脂乳中，100.0倍稀釋，得到10μg/kg青霉素G的稀釋液，然后再進行2.5倍稀釋得到4μg/kg青霉素濃度的脫脂乳樣品。參考國家限量要求，方法同上，稀釋不同倍數(shù)，分別得到如表1濃度樣品。

表1 樣品加標(biāo)濃度

2.3 操作步驟

2.3.1 從冰箱取出試劑盒，恢復(fù)10～20min，至室溫。

2.3.2 每個樣品做雙平行，取出檢測試劑微孔板，按照相應(yīng)數(shù)量，使用壁紙刀沿線切開密封鋁箔。去掉鋁箔膜后，分別加入100μg/kg樣品，用試劑盒內(nèi)封口膜封好微孔。

2.3.3 將樣品放入設(shè)定好溫度（64±2）℃的金屬溫育器中。

2.3.4 等待2.75h和3.00h后，分別觀察微孔顏色變化。

3 驗證結(jié)果

試驗結(jié)果見表2，圖1、2。

表2 試驗結(jié)果

圖1 2.75 h顏色變化情況

圖1 3.00h顏色變化情況

4 結(jié)論

4.1 試劑盒靈敏度良好

青霉素G、頭孢氨芐、林可霉素三類抗生素均能在國家限量要求內(nèi)檢測陽性。

4.2 檢測時間

3.00h固定時間較2.75h的檢出限靈敏度降低，可以看到最后2個微孔，在3.00h固定時間較建議時間略有顯黃色，是因為含林可霉素150μg/kg濃度樣品，其接近試劑盒的檢出限。

5 小結(jié)

Delvotest SP NT試劑盒具有操作簡單，成本低，靈敏度高，檢測抗生素種類多等優(yōu)點，是目前牧場獸藥殘留檢測實用的的檢測方法。根據(jù)試劑盒的檢測原理，在牧場應(yīng)用過程中，可以選擇青霉素G加標(biāo)4μg/kg和陰性奶樣進行驗證。

6 注意事項

6.1 正確運輸及儲藏

Delvotest SP NT試試劑盒應(yīng)冷藏運輸，在2～8℃之間儲存，儲存時避免冷凍，盡量減少試劑盒與冰箱壁接觸，避免冰箱壁冷凍結(jié)霜；避免強陽光直射，遠離紫外線殺菌設(shè)備，保護好細菌芽孢活性。

6.2 正確操作

使用前恢復(fù)室溫，從冰箱取出后將試劑微孔立即放到高溫的溫育器中，會導(dǎo)致微孔中細菌芽孢失活。另外不能破壞試劑微孔的密封性，盡量使用壁紙刀切割微孔密封鋁箔，密封性破壞后培養(yǎng)基會出現(xiàn)風(fēng)干現(xiàn)象；使用溫育器或者水浴鍋時確保溫度恒定，溫度波動會影響芽孢正常生長。因為試劑盒靈敏度較高，操作時應(yīng)及時更換吸頭，化驗員注意佩戴手套，避免污染樣本。

6.3 異常情況

受異常乳的影響，樣品pH值發(fā)生變化（含堿或者酸化），會直接影響試劑的變色反應(yīng)；另外初乳中含有抑菌物質(zhì)[8]，檢測牛初乳可能會出現(xiàn)假陽性。

6.4 樣本選取

操作時，建議做雙平行樣，并進行陰性質(zhì)控樣本對照試驗。出現(xiàn)平行樣本不平行時，可以重新試驗；樣品變色不明顯時，對照陰性質(zhì)控樣顏色變化及時間。