智曉玉，李衛(wèi)威，燕 翔，陶海濤，張智博，葛祥偉，汪進良

1 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心 腫瘤內(nèi)科，北京 100039；2 解放軍總醫(yī)院研究生院，北京 100853；3 解放軍第八十一集團軍醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，河北張家口 075000；4 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 腫瘤內(nèi)科，北京 100853

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是全球癌癥最主要死亡原因之一[1]。免疫檢查點抑制劑抗程序性細胞死亡受體1/程序性細胞死亡配體1(PD-1/PD-L1)抑制劑正在改變NSCLC患者的治療模式。在精準治療的時代背景下，能夠篩選出PD-1/PD-L1抑制劑的潛在獲益者尤為重要。早先一項研究通過免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)對42例患者腫瘤細胞的PD-L1表達進行檢測，將PD-L1表達高于5%定義為PD-L1表達陽性，在25例PD-L1陽性表達患者中有9例(36%)對Nivolumab表現(xiàn)出客觀應(yīng)答，而另外17例PD-L1表達陰性患者均無客觀應(yīng)答[2]。該研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞PD-L1表達陽性患者對Nivolumab的治療反應(yīng)可能更好。Keynote研究結(jié)果也進一步體現(xiàn)了腫瘤細胞PDL1的表達水平對于預(yù)測Pembrolizumab治療療效的重要性[3-5]。目前，利用IHC檢測PD-L1表達水平是美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準用于晚期NSCLC患者一線Pembrolizumab治療的唯一生物標志物[3-4]。盡管PD-L1表達水平與PD-1/PD-L1抑制劑預(yù)后具有相關(guān)性得到廣泛認可，但其與患者臨床病理特征的關(guān)系仍然不清晰。因此，我們收集了NSCLC患者術(shù)后腫瘤組織中PD-L1表達情況的資料，并進一步探究其與臨床病理特征的關(guān)系。

資料與方法

1 資料 收集2019年3 - 8月在解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心確診并接受手術(shù)治療的NSCLC患者臨床資料。納入標準：1)病理學診斷為肺腺癌或肺鱗癌并同時運用22C3抗體完成免疫組化PD-L1檢測；2)病歷資料完整，包括年齡、性別、吸煙史、T分期、N分期、TNM分期、胸膜浸潤、Ki-67表達、EGFR基因突變狀態(tài)、ALK基因突變狀態(tài)。2)排除標準：1)病理診斷為腺鱗癌、大細胞癌或小細胞肺癌；2)合并其他原發(fā)性腫瘤；3)術(shù)前進行過抗腫瘤治療；4)肺腺癌未進行EGFR和ALK狀態(tài)檢測或具有多個基因突變的患者。TNM分期采用美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)第8版[6]。

2 免疫組織化學檢測PD-L1、ALK以及Ki-67表達 手術(shù)切除標本用10%甲醛固定并進行石蠟包埋。將4 μm厚的切片進行脫蠟抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源性過氧化物酶后進行封閉。然后分別滴加PDL1一抗(22C3，Agilent Technologies，美國)、ALK一抗(D5F3，Cell Signal Technology，美國)、Ki-67一抗(MIB1，Santa Cruz，中國上海)，并于4℃冰箱中過夜。二抗孵育DAB顯色蘇木素復(fù)染分化、脫水、透明封片。按以下方法進行各項檢測結(jié)果判讀：1)PD-L1表達腫瘤比例評分(tumor proportion score，TPS)為任意強度下部分或完全膜染色腫瘤細胞的百分比，TPS＜1%為PD-L1表達陰性，≥ 1%為陽性[4]。2)ALK 陽性判定標準：細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)強棕黃色顆粒狀染色為陽性，無強顆粒狀染色為陰性。3)Ki-67染色結(jié)果評估：細胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達，不著色為陰性。染色結(jié)果由兩名病理科副高級職稱醫(yī)師獨立評估，如果評估結(jié)果存在差異，則一起審查切片以達成共識。

3 分析指標 1)對比肺腺癌與肺鱗癌臨床病理特征差異；2)分別評估肺腺癌、肺鱗癌腫瘤組織PD-L1表達水平與患者臨床病理特征(年齡、性別、吸煙史、T分期、N分期、TNM分期、胸膜浸潤、Ki-67表達、EGFR基因突變狀態(tài)、ALK基因突變狀態(tài))的關(guān)系。

4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS26.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，采用t檢驗；不符合正態(tài)分布且方差不齊時采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，采用χ2檢驗；當樣本量＜40或理論頻數(shù)＜1時采用Fisher確切概率法。采用Spearman方法分析PD-L1與Ki-67表達的相關(guān)性?；趩我蛩胤治鼋Y(jié)果構(gòu)建logistic多因素回歸模型以評估PD-L1表達水平的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 被納入患者的臨床特征 共178例患者納入本研究。其中82例(46.1%)男性，96例(53.9%)女性，中位年齡58.7(38～79)歲。42例(23.6%)既往有吸煙史。T分期為T1期83例(46.6%)，≥ T2期95例(53.4%)。N分期為N0期149例(83.7%)，≥ N1期29例(16.3%)。術(shù)后TNM病理分期為Ⅰ期120例(67.4%)，≥Ⅱ期58例(32.6%)。病理類型為腺癌151例(84.8%)，鱗癌27例(15.2%)。侵及胸膜的患者有69例(38.8%)。TPS＜1%有86例(48.3%)，≥ 1%有92例(51.7%)。EGFR突變患者有60例(33.7%)。ALK融合突變患者有18例(10.1%)。共有163例(92%)患者進行了Ki-67檢測，表達水平為20.4%±21.3%。患者臨床特點見表1。

表1 NSCLC患者一般資料與臨床病理特征Tab.1 Clinical and biological characteristic in the NSCLC patients

2 腺癌與鱗癌組臨床病理特征比較 腺癌組出現(xiàn)侵及胸膜的患者比例高于鱗癌組(44.4% vs 7.4%，P＜0.05)。EGFR、ALK基因突變病理均為腺癌。鱗癌組年齡大于腺癌組(64.4歲 vs 57.7歲，P＜0.05)，男性多于腺癌組(96.3% vs 37.1%，P＜0.001)，PDL1表達水平高于腺癌組(77.8% vs 47.0%，P＜0.05)，Ki-67表達水平明顯高于腺癌組(53.6% ±18.8% vs 16.3% ±17.7%，P＜0.05)。見表2。

表2 腺癌組和鱗癌組的臨床特征比較Tab.2 Clinicopathological features comparison between the lung adenocarcinoma group and squamous cell carcinoma group

3 PD-L1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系 考慮到肺腺癌與肺鱗癌臨床病理特征本身存在差異性，本研究接下來將分別探究二者臨床病理特征與PD-L1表達水平的關(guān)系。在肺腺癌組中，單因素分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki-67表達水平與PDL1表達水平相關(guān)(P＜0.05)。多因素分析中應(yīng)變量為PD-L1表達狀況，賦值1為PD-L1表達 ≥ 1%，賦值0為PD-L1表達＜1%。自變量為單因素分析中P＜0.15的指標(T分期、TNM病理分期、EGFR基因突變狀態(tài)、N分期以及Ki-67表達水平)?；貧w過程采用全模法?；貧w結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者PD-L1表達水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(OR=3.392，95% CI：1.055～10.90，P=0.040)；Ki-67表達水平較高的患者PD-L1表達水平較高(OR=1.028，95% CI：1.004～1.054，P=0.024)。EGFR、ALK基因突變狀態(tài)與PD-L1表達水平無顯著相關(guān)性，見表3。Spearman相關(guān)性分析顯示PD-L1與Ki-67表達水平呈正相關(guān)(r=0.363，P＜0.001)，見圖1。肺鱗癌組由于病例數(shù)太少未做進一步分析。

表3 多因素logistic分析PD-L1表達水平與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系(n, %)Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of clinicopathological features to predict PD-L1 expression in lung adenocarcinoma (n, %)

圖1 肺腺癌患者PD-L1與Ki-67表達水平相關(guān)性散點圖(n=151)Fig.1 Scatter plot depicting the relationship between PD-L1 expression and Ki-67 index in lung adenocarcinoma.Statistical analysis of the data was performed using the nonparametric Spearman test (n=151)

討 論

免疫治療的飛速發(fā)展帶來了肺癌治療的新曙光。PD-L1表達水平是NSCLC患者進行PD-1/PDL1抑制劑治療的重要生物標志物。然而，PDL1表達水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性仍存在爭議。目前，通過IHC檢測PD-L1表達的抗體主要包括SP263、SP142(Ventana)以及28-8、22C3(Dako，Carpinteria，CA，U.S)[7]。在我國，運用22C3抗體通過IHC進行NSCLC腫瘤組織PDL1表達水平檢測的報道較少。并且，既往研究顯示經(jīng)過不同的抗腫瘤藥物治療后會影響腫瘤組織PD-L1表達水平[8-9]。因此，本研究收集了術(shù)前未進行過抗腫瘤治療并且通過IHC(22C3抗體)檢測PD-L1表達水平的NSCLC患者臨床資料，分析了PD-L1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系。

本研究中，納入患者PD-L1陽性表達率為51.7%，這與之前的研究結(jié)果基本一致[10-11]。肺鱗癌組PD-L1表達明顯高于腺癌組，但未發(fā)現(xiàn)鱗癌組臨床病理特征與PD-L1表達水平存在相關(guān)性。肺腺癌組中，單因素及多因素分析發(fā)現(xiàn)PD-L1表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及Ki-67表達水平有相關(guān)性，這與Xue等[12]和Lee等[13]的研究結(jié)果一致。既往研究結(jié)果顯示，Ki-67表達于增殖性腫瘤細胞中，與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切[14-15]。Pawelczyk等[16]在研究過程中發(fā)現(xiàn)NSCLC患者PD-L1表達水平較高，與腫瘤的增殖及侵襲性增強相關(guān)，并且這種相關(guān)性在肺腺癌中更為顯著。我們在研究過程中通過Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)了Ki-67及PD-L1表達水平呈正相關(guān)，但目前它們之間的具體影響機制尚未明確，需要進一步探索。

由于東亞國家NSCLC患者EGFR基因突變概率明顯高于西方國家[17]，因此存在EGFR基因突變的NSCLC患者對PD-1/PD-L1抑制劑的響應(yīng)受到廣泛關(guān)注。但多項臨床研究顯示PD-1/PD-L1抑制劑對存在EGFR基因突變的NSCLC患者治療療效欠佳[4,18-20]。在深入研究的過程中發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變狀態(tài)以及不同突變位點可能是通過影響PD-L1表達水平對治療療效產(chǎn)生影響，但目前的研究結(jié)果卻存在不一致性[21-23]。因此，對該研究方向的進一步探討是十分有必要的。本研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變的狀態(tài)對PD-L1表達水平無特異性影響。同時，我們也并未發(fā)現(xiàn)ALK基因突變與PD-L1表達水平的相關(guān)性，該研究結(jié)果與Yang等[23]以及Koh等[24]的研究結(jié)果一致。

本研究存在一定的局限性：1)本研究為回顧性研究，納入病例數(shù)量較少；2)本研究納入的是早期可手術(shù)肺癌患者，淋巴結(jié)分期多為N0/N1期，因此未能將其他不同淋巴結(jié)分期(N2/N3)單獨與PD-L1表達水平的相關(guān)性進行分析；3)參加本研究的患者大部分尚未接受抗腫瘤藥物治療，缺乏生存隨訪數(shù)據(jù)。

綜上所述，肺鱗癌以及存在Ki-67高表達或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者PD-L1表達水平可能較高。期待本研究結(jié)果可以為篩選PD-L1表達水平較高的NSCLC患者提供參考依據(jù)，使更多患者受益于PD-1/PD-L1抑制劑治療。