侯 偉，周紅輝，謝瀟瀟，李江華，姜淑芳，高志英，游艷琴

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 婦產(chǎn)科，北京 100853

基于胎兒游離DNA(cell free DNA，cf-DNA)檢測的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(noninvasive prenatal test，NIPT)用于檢測胎兒常見的非整倍體及部分性染色體異常，敏感度：21-三體為0.994(0.983～0.998)，18-三體為0.977(0.952～0.989)，13-三體為0.906(0.823～0.958)；特異性均達(dá)到0.999以上，是目前最準(zhǔn)確的產(chǎn)前篩查方法[1]。母體外周血中的胎兒cf-DNA主要來源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，其遺傳成分并不總是與胎兒一致，因此NIPT無法替代侵入性產(chǎn)前診斷(羊水穿刺術(shù)或絨毛膜穿刺術(shù))[2]。目前NIPT的適用人群為血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)、有侵入性產(chǎn)前診斷禁忌者以及錯過血清學(xué)篩查最佳時(shí)間者，高齡孕婦(預(yù)產(chǎn)期年齡 ≥ 35歲)為NIPT的慎用人群[3]。同時(shí)高齡也是侵入性產(chǎn)前診斷的指征，因此臨床上建議高齡孕婦可直接行侵入性產(chǎn)前診斷[4]。研究認(rèn)為35～38歲孕婦的胎兒非整倍體發(fā)生率并無明顯上升，孕婦35歲時(shí)孕中期胎兒21-三體的患病率為4.0‰，38歲時(shí)為8.7‰，而42歲時(shí)為24.1‰；18-三體和13-三體的發(fā)病率在38歲后也明顯升高[5]。有學(xué)者因此提出，在NIPT日趨成熟的情況下，部分風(fēng)險(xiǎn)相對較低的高齡孕婦可行NIPT篩查，即37歲前可先行NIPT，篩查陽性者行侵入性產(chǎn)前診斷驗(yàn)證，陰性者不再行產(chǎn)前診斷[6]。以往研究證實(shí)NIPT在高危孕婦中有著很高的敏感度和特異性[7]。本研究對接受侵入性產(chǎn)前診斷的孕婦進(jìn)行NIPT，比較不同產(chǎn)前診斷指征與胎兒染色體異常的相關(guān)性，探討擴(kuò)展NIPT的適用人群及臨床應(yīng)用價(jià)值。

對象和方法

1 對象 選取2018年1月16日- 2020年6月30日，在解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心就診的孕婦。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)年齡 ≥ 18歲；2)單胎妊娠；3)在解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心行侵入性產(chǎn)前診斷，侵入性產(chǎn)前診斷的臨床指征主要有預(yù)產(chǎn)期年齡 ≥35歲、血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)或灰區(qū)、NIPT結(jié)果異常、胎兒超聲結(jié)構(gòu)異?；蜍浿笜?biāo)異常、不良妊娠史或遺傳學(xué)家族病史(自身為患者或攜帶者、生育過遺傳病患兒或家族中有遺傳病患者)；4)經(jīng)過咨詢并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)妊娠合并惡性腫瘤；2) 1年內(nèi)接受過異體輸血、移植手術(shù)、異體細(xì)胞治療。本研究獲得解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

2 檢測方法 1) NIPT：本研究入組孕婦均行NIPT，在侵入性產(chǎn)前診斷前兩周內(nèi)進(jìn)行。每名入組孕婦采集8 mL外周血于cfDNA采血管 (Streck,USA)，分離血漿后使用DNeasy Blood Kit (Qiagen)提取基DNA，基因組DNA打斷成小片段 (Covaris，S220，USA)，并使用KAPA Hyper Prep Kit (KAPA，KK8504，USA)構(gòu)建文庫。高通量測序在Nextseq CN500平臺(Illumina，San Diego，CA)進(jìn)行，以檢測染色體非整倍體的情況。NIPT的結(jié)果表示為胎兒染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)或低風(fēng)險(xiǎn)；若胎兒游離DNA濃度小于4%，NIPT無結(jié)果(no call)。2) 侵入性產(chǎn)前診斷：獲得的羊水細(xì)胞或絨毛膜細(xì)胞行核型分析、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)或染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA)。

3 危險(xiǎn)因素分析及計(jì)算公式 采用多因素logistic回歸分析，比較不同產(chǎn)前診斷指征與胎兒染色體異常的關(guān)系。NIPT的篩查方案：低風(fēng)險(xiǎn)者不再行侵入性產(chǎn)前診斷，高風(fēng)險(xiǎn)或無結(jié)果需行進(jìn)一步產(chǎn)前診斷。當(dāng)不同高危因素的孕婦應(yīng)用該NIPT篩查方案后，計(jì)算侵入性產(chǎn)前診斷的需求量、異常檢出率及NIPT的陰性預(yù)測值。計(jì)算公式如下：

侵入性產(chǎn)前診斷的需求量=入組孕婦總數(shù)-NIPT低風(fēng)險(xiǎn)數(shù)斷，高風(fēng)險(xiǎn)或無結(jié)果需行進(jìn)一步產(chǎn)前診斷。當(dāng)不同高危因素的孕婦應(yīng)用該NIPT篩查方案后，計(jì)算侵入性產(chǎn)前診斷的需求量、異常檢出率及NIPT的陰性預(yù)測值。計(jì)算公式如下：

產(chǎn)前診斷的異常檢出量=胎兒異?？倲?shù)-NIPT為低風(fēng)險(xiǎn)的胎兒異常數(shù)斷，高風(fēng)險(xiǎn)或無結(jié)果需行進(jìn)一步產(chǎn)前診斷。當(dāng)不同高危因素的孕婦應(yīng)用該NIPT篩查方案后，計(jì)算侵入性產(chǎn)前診斷的需求量、異常檢出率及NIPT的陰性預(yù)測值。計(jì)算公式如下：

產(chǎn)前診斷的陽性率=產(chǎn)前診斷的異常檢出量/產(chǎn)前診斷的需求量

NIPT的陰性預(yù)測值=(NIPT低風(fēng)險(xiǎn)數(shù)-NIPT為低風(fēng)險(xiǎn)的胎兒異常數(shù))/NIPT低風(fēng)險(xiǎn)數(shù)

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS22.0軟件進(jìn)行。計(jì)量資料以表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，多因素分析采用logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 孕婦一般情況及產(chǎn)前診斷信息 總計(jì)有1 261例孕婦納入本研究，平均年齡(34.65±5.02)歲，行產(chǎn)前診斷時(shí)的平均孕周為(20.18±1.73)周，侵入性產(chǎn)前診斷的臨床指征及檢測項(xiàng)目見表1。

表1 1 261例孕婦的臨床指征及產(chǎn)前診斷Tab.1 Clinical indications and methods of prenatal diagnosis in 1 261 pregnant women

2 侵入性產(chǎn)前診斷與NIPT結(jié)果比較 侵入性產(chǎn)前診斷檢出胎兒染色體異常87例，異常檢出率為6.90%，包括21-三體35例，18-三體6例，13-三體1例，性染色體非整倍體12例，胎兒嵌合體9例，微缺失重復(fù)22例，雜合性缺失1例，單親二倍體1例。NIPT高風(fēng)險(xiǎn)或無結(jié)果82例，低風(fēng)險(xiǎn) 1179例。對于上述胎兒染色體異常，NIPT整體的特異性為97.61%(1 146/1 174)，陰性預(yù)測值為97.20%(1 146/1 179)，診斷符合率為95.16%(1 200/1 261)(表2)。NIPT低風(fēng)險(xiǎn)但產(chǎn)前診斷證實(shí)胎兒異常33例，其中32例來源于NIPT檢測范圍之外的染色體異常，包括胎兒微缺失重復(fù)22例、胎兒嵌合體7例、雜合性缺失1例、單親二倍體1例、等臂雙著絲粒Y染色體1例(表3)。

表2 1 261例孕婦的NIPT及產(chǎn)前診斷結(jié)果(n, %)Tab.2 Results of NIPT and prenatal diagnosis of 1 261 pregnant women (n, %)

表3 產(chǎn)前診斷結(jié)果為異常而NIPT為低風(fēng)險(xiǎn)的33例孕婦信息Tab.3 Inconsistency between NIPT and invasive prenatal diagnosis in 33 cases

3 胎兒染色體異常的相關(guān)性分析 以胎兒是否存在染色體異常作為因變量，在接受侵入性產(chǎn)前診斷的孕婦中比較不同產(chǎn)前診斷指征與胎兒染色體異常的相關(guān)性。多因素logistic全?；貧w分析顯示：在這一人群中，高齡(OR=0.470，P=0.010)和超聲異常(OR=2.939，P＜0.001)與胎兒染色體異常的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而血清學(xué)篩查異常(OR=0.075)和不良孕產(chǎn)史及家族史(OR=0.492)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。臨床意義：在接受侵入性產(chǎn)前診斷的孕婦中，單純高齡孕婦的胎兒染色體異常風(fēng)險(xiǎn)低于這一人群的平均風(fēng)險(xiǎn)，而超聲異常的孕婦高于這一人群的平均風(fēng)險(xiǎn)。

表4 胎兒染色體異常的多因素logistic回歸分析(n, %)Tab.4 Multivariate logistic regression analysis of factors related to fetal chromosome abnormalities (n, %)

4 單純高齡孕婦應(yīng)用NIPT對產(chǎn)前診斷的影響 1 261例孕婦的胎兒異常檢出率為6.90%。本研究中高齡孕婦占55.51%(700/1 261)，其中高齡為唯一危險(xiǎn)因素的孕婦占44.09%(556/1 261)。38歲以下的單純高齡孕婦應(yīng)用NIPT時(shí)，產(chǎn)前診斷的需求數(shù)量減少16.34%(217/1 261)，產(chǎn)前診斷的陽性率為7.87%。42歲以下的單純高齡孕婦應(yīng)用NIPT時(shí)，產(chǎn)前診斷的需求數(shù)量減少35.77%(472/1 261)，產(chǎn)前診斷的陽性率為10.00%。所有單純高齡孕婦應(yīng)用NIPT時(shí)，產(chǎn)前診斷需求量下降42.19%(532/1 261)，產(chǎn)前診斷陽性率達(dá)11.11%，陰性預(yù)測值為98.92%(圖1)。單純高齡孕婦中共發(fā)現(xiàn)6例胎兒染色體異常而NIPT為低風(fēng)險(xiǎn)，其中1例為性染色體嵌合 [X0(26%)/XY(74%)]，1例為10號染色體單親二倍體，4例為微缺失重復(fù)(缺失/重復(fù)片段大小1.2～2.4 Mb)，均在NIPT檢測范圍外。

圖1 改變NIPT的年齡限制對產(chǎn)前診斷的需求量及陽性率的影響Fig.1 Effects of changing age limits for NIPT on demand for prenatal diagnosis and positive rate

5 其他單一高危因素的孕婦應(yīng)用NIPT對產(chǎn)前診斷的影響 唯一危險(xiǎn)因素為超聲異常的孕婦占6.66%(84/1 281)，應(yīng)用NIPT可減少6.58%(83/1 261)的產(chǎn)前診斷，陰性預(yù)測值91.57%(76/83)；血清學(xué)篩查異常為唯一危險(xiǎn)因素的孕婦占19.19%(242/1 261)，應(yīng)用NIPT可減少18.87%(238/1 261)的產(chǎn)前診斷，陰性預(yù)測值98.32%(234/238)；不良孕史或家族史為唯一危險(xiǎn)因素的孕婦占9.60%(121/1 261)，應(yīng)用NIPT可減少9.60%(121/1 261)的產(chǎn)前診斷，陰性預(yù)測值97.52%(118/121)。不同危險(xiǎn)因素的孕婦應(yīng)用NIPT篩查后產(chǎn)前診斷的陽性率：血清學(xué)篩查異常為8.11%，超聲異常為6.79%，不良孕史或家族史為7.37%(表5)。

表5 單一高危因素孕婦應(yīng)用NIPT對產(chǎn)前診斷的影響Tab.5 Effect of NIPT on need of prenatal diagnosis in pregnant women with a single risk factor

討 論

隨著我國二胎政策的開放以及生育觀念的改變，產(chǎn)前診斷的服務(wù)量逐年提高，并且2013年以后高齡成為產(chǎn)前診斷的最主要指征[8]。與此同時(shí)，NIPT在近十年發(fā)展迅速，2020年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會提出：無論年齡或其他風(fēng)險(xiǎn)因素如何，均建議對所有孕婦進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測[9]。NIPT屬于一項(xiàng)篩查技術(shù)而非診斷技術(shù)，其結(jié)果存在一定的不確定性。NIPT假陽性的原因包括局限性胎盤嵌合體、孕婦本身為染色體非整倍體、母源性的拷貝數(shù)變異、母源性惡性腫瘤、雙胎之一胎死宮內(nèi)等；假陰性的原因包括胎兒濃度較低、胎盤低比例嵌合、胎兒嵌合但胎盤正常等[10]。目前各專業(yè)結(jié)構(gòu)推薦的NIPT檢測范圍包括211813號染色體以及部分性染色體的異常，尚不推薦將檢測范圍擴(kuò)展至微缺失重復(fù)以及其他染色體異常[11-12]。因此，能否通過擴(kuò)展NIPT適用人群來減少產(chǎn)前診斷值得討論。

本研究主要探討擴(kuò)展NIPT的適用人群及應(yīng)用評價(jià)。胎兒非整倍體風(fēng)險(xiǎn)隨孕婦年齡增大而升高，35歲孕婦胎兒非整倍體風(fēng)險(xiǎn)與產(chǎn)前診斷導(dǎo)致的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)大致相當(dāng)(約1/200)，據(jù)此大多數(shù)國家的醫(yī)療機(jī)構(gòu)對35歲及以上的孕婦提供產(chǎn)前診斷[13]。孕婦年齡作為篩查的敏感度和陽性預(yù)測值低，高齡作為產(chǎn)前診斷指征受到越來越多的質(zhì)疑[6]。本研究中高齡與胎兒染色體異常的相關(guān)性低于其他產(chǎn)前診斷指征，因此在高危孕婦中優(yōu)先選擇高齡孕婦應(yīng)用NIPT。在單純高齡孕婦中，依據(jù)年齡逐步擴(kuò)展NIPT的應(yīng)用范圍，產(chǎn)前診斷的需求量下降達(dá)42.19%，產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)胎兒異常比例由6.90%升至11.11%，提高了產(chǎn)前診斷的效率，同時(shí)陰性預(yù)測值達(dá)98.92%。因此單純高齡孕婦可行NIPT，根據(jù)篩查結(jié)果決定是否行侵入性產(chǎn)前診斷。

超聲異常包括胎兒結(jié)構(gòu)異常和軟指標(biāo)異常，這些異常很有可能與某個遺傳綜合征或遺傳缺陷疾病相關(guān)。導(dǎo)致超聲異常的遺傳學(xué)因素很多，相當(dāng)一部分超出了NIPT的檢測范圍，如染色體拷貝數(shù)異常(copy number variation，CNV)、胎兒嵌合體等，僅行NIPT無法除外這些遺傳學(xué)異常。Wapner等[14]研究發(fā)現(xiàn)超聲提示結(jié)構(gòu)異常但核型分析正常的胎兒，可額外檢出6.7%的CNV，高于高齡孕婦(1.6%)，提示胎兒結(jié)構(gòu)異常與CNV之間存在相關(guān)性[14]。本研究中，當(dāng)孕婦合并超聲異常時(shí)NIPT漏診風(fēng)險(xiǎn)明顯升高，NIPT陰性預(yù)測值僅為91.57%。因此對于超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕婦，不建議行NIPT篩查，仍需侵入性產(chǎn)前診斷。

除了擴(kuò)展適用人群之外，擴(kuò)展NIPT的檢測范圍同樣意義重大。理論上基于全基因組測序的NIPT可以發(fā)現(xiàn)胎兒的染色體拷貝數(shù)異常，即NIPT-plus。NIPT通常采用低深度測序，增加測序的深度可以提高檢出胎兒CNV的能力，同時(shí)減少假陽性率[15]。并不是所有的CNV都適合進(jìn)行篩查，需要考慮到CNV的大小、外顯率、表型、發(fā)病率等因素。CNV越小，需要的測序深度及成本越高；CNV越大，包含的基因越多，致病的可能性越高。目前已有商業(yè)化的NIPT涵蓋表型明確、外顯率高、發(fā)病率相對較高的CNV，如DiGeorge Syndrome (DGS)、1p36 Deletion、16p12.2-p11.2 Syndrome、Angelman/Prader-Willi Syndrome、Cridu-chat Syndrome等[16]。與非整倍體不同，胎兒CNV的發(fā)病率與孕婦年齡無關(guān)[17]。本研究共檢出22例微缺失重復(fù)，其中5例在NIPT中有相應(yīng)發(fā)現(xiàn)，敏感度為27.3%(6/22)。還有部分NIPT發(fā)現(xiàn)的微缺失重復(fù)缺乏CMA檢測及臨床驗(yàn)證，本研究尚無法計(jì)算NIPT對于微缺失重復(fù)的陽性預(yù)測值，待完善新生兒隨訪作為臨床驗(yàn)證，可計(jì)算NIPT檢出胎兒微缺失重復(fù)的陽性預(yù)測值及特異度。目前還需要大規(guī)模的隊(duì)列研究證實(shí)NIPT-plus效能，作為臨床常規(guī)應(yīng)用的方案尚不成熟[18-19]。

綜上所述，在NIPT應(yīng)用日趨完善的今天，高齡孕婦在排除其他產(chǎn)前診斷指征之后可以選擇NIPT進(jìn)行篩查，出現(xiàn)陽性結(jié)果時(shí)再行產(chǎn)前診斷，從而避免有創(chuàng)操作帶來的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。將NIPT的適用人群擴(kuò)展至單純高齡孕婦可以顯著減少產(chǎn)前診斷數(shù)量，并提高產(chǎn)前診斷的效率。對于合并超聲異常、血清學(xué)篩查異常、不良孕史或遺傳學(xué)家族史的孕婦，選擇NIPT將承擔(dān)更大的漏診風(fēng)險(xiǎn)，并且漏診風(fēng)險(xiǎn)主要來源NIPT檢測范圍之外的染色體異常，如胎兒嵌合體、微缺失重復(fù)等。因此要嚴(yán)格把握NIPT適用指征，合并高齡以外產(chǎn)前診斷指征的孕婦仍需行侵入性產(chǎn)前診斷。