杜 杰，劉廷薇，馬 良，王洪霞，戴宏杰，余 永，朱翰昆，張宇昊

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

明膠是水溶性的熱可逆多功能天然高分子聚合物，由母體膠原蛋白部分水解得到。明膠具有可逆轉(zhuǎn)變的良好特性，被廣泛用于藥物控制釋放、生物組織工程、食品和化妝品行業(yè)[1]。明膠提取通常需要經(jīng)過兩個步驟——明膠化和熱提取[2]。明膠化過程破壞共價交聯(lián)和非共價鍵（主要是氫鍵），從而使膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)松散，產(chǎn)生充分的溶脹和膠原蛋白增溶作用[3]。熱處理會進(jìn)一步裂解氫鍵和共價鍵，破壞三螺旋的穩(wěn)定性，使螺旋結(jié)構(gòu)過渡到線圈結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化為可溶性明膠，此轉(zhuǎn)化常通過45 ℃以上的水浴加熱來實現(xiàn)[4]。

酸堿法是我國明膠生產(chǎn)中采用的主要方法[5]，使用酸堿處理可以破壞膠原蛋白中的共價鍵和一些次級鍵，以便原料在熱水提膠過程中釋放出膠原蛋白的亞基成分，從而形成明膠。酸和堿工藝都需要消耗大量的淡水，同時排放大量的廢水污染物，嚴(yán)重危害環(huán)境[6]。同時，熱水提膠過程通常為傳統(tǒng)水浴提取，時間在數(shù)小時至數(shù)十小時不等，這是明膠生產(chǎn)周期長的主要原因。

目前，誘導(dǎo)膠原明膠化的新方法以酶法為主。從20世紀(jì)90年代以來，已有采用酶法生產(chǎn)明膠的報道。酶法提取明膠主要利用胃蛋白酶[7]、胰蛋白酶[8]、木瓜蛋白酶[9]等破壞原料中雜蛋白和膠原蛋白的非螺旋區(qū)，使三螺旋結(jié)構(gòu)松散，從而使亞基組分在后期熱水提膠過程中可以被釋放。但該方法幾乎不能破壞維持膠原纖維穩(wěn)定的分子間共價鍵，因此提取的明膠得率較低[10-11]，且小分子成分含量高，明膠凝凍強度低，這使得酶法所制明膠的市場價值低且競爭力差。本課題組曾嘗試超高壓法制備明膠，發(fā)現(xiàn)超高壓會破壞原料膠原中的氫鍵平衡，使膠原分子的三螺旋結(jié)構(gòu)松散[12]。此外，本課題組還探索了快速凍融協(xié)同稀酸誘導(dǎo)膠原明膠化法[13]，發(fā)現(xiàn)該法可以有效打破氫鍵平衡，使膠原三螺旋結(jié)構(gòu)松散，從而顯著縮短豬皮膠原的明膠化時間。但這些方法因設(shè)備無法實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，或因未能完全脫離酸的使用而無法真正達(dá)到明膠綠色清潔制備的要求。

微波除了加熱作用外，對蛋白質(zhì)也有一定作用。Zhang Jinwei等[14]將微波應(yīng)用于清洗皮革時發(fā)現(xiàn)，微波會使膠原蛋白中的極性基團(tuán)以相同的電荷趨勢形成平行排列。Guan Junjun等[15]發(fā)現(xiàn)，微波首先可以破壞蛋白質(zhì)與巰基的二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)亞基的分解。Pi?tkowski等[16]發(fā)現(xiàn)在微波輻射下生物聚合物會發(fā)生降解。由此可知，微波可以打斷蛋白質(zhì)的共價鍵，破壞蛋白質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)。凍融過程是冷凍和解凍融化的統(tǒng)稱，凍融循環(huán)會引起蛋白質(zhì)的變化，尤其是次級鍵的變化。而疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵和離子相互作用等次級鍵的形成會導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，肌球蛋白頭部聚集[17]。

基于微波對蛋白質(zhì)共價鍵的破壞和凍融對蛋白質(zhì)次級鍵的影響，本實驗創(chuàng)新性地提出微波-快速凍融耦合明膠化的方式，即膠原原料經(jīng)微波預(yù)處理后進(jìn)行快速凍融，然后再采用微波輔助提取。整個制備過程沒有酸堿的使用，提取時間短，綠色清潔。本研究擬通過明膠等電點、透射比、分子質(zhì)量分布、凝凍強度測定以及流變學(xué)特性、氨基酸組成和傅里葉變換紅外光譜分析對微波-快速凍融耦合魚皮明膠進(jìn)行理化性質(zhì)表征，并與傳統(tǒng)的酸法制備明膠相比較，以期對此種新型明膠的基本性質(zhì)、凝膠性能和明膠結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大目金槍魚皮 山東省中魯遠(yuǎn)洋（煙臺）食品有限公司。

液氮 沙坪壩區(qū)雙流液氮經(jīng)營部；鹽酸、十二烷基苯磺酸鈉（sodium dodecyl benzene sulfonate，SDBS）、溴化鉀（光譜純） 成都市科龍試劑廠；L-羥脯氨酸合肥博美生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MAS-II plus微波合成萃取反應(yīng)工作站 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；TA.XT2i物性測定儀 英國Stable Micro Systems公司；Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀美國PerkinElmer公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀日本日立公司；DHR-1流變儀 美國TA公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 微波-快速凍融耦合魚皮明膠提取工藝及提取率的計算

魚皮→室溫解凍→去鱗去脂肪→剪碎脫脂、去雜蛋白→清洗→微波預(yù)處理→快速凍融→微波輔助提取→過濾、烘干→成品明膠

去鱗去脂肪：魚皮解凍后，刮去表面鱗片、脂肪和多余的肉，清洗干凈。剪碎脫脂、去雜蛋白：魚皮剪成4 mm×4 mm片狀，加入SDBS溶液（0.75 g/100 mL），超聲脫脂2 h，每1 h更換一次脫脂液，超聲功率120 W、溫度25 ℃。將脫脂后清洗瀝干的魚皮按照料液比1∶5加入NaCl溶液（1.0 g/100 mL），磁力攪拌6 h，每2 h更換一次NaCl溶液。微波預(yù)處理：魚皮與去離子水按料液比1∶6混合，55 ℃、350 W條件下微波預(yù)處理15 min?？焖賰鋈冢簩Ⅳ~皮濾出，濾液備用，用液氮快速冷凍魚皮，之后放入濾液中，在30 ℃水浴條件下攪拌解凍。微波輔助提取：將魚皮與濾液混合物轉(zhuǎn)移至微波提取容器中，按體積比50∶1加入質(zhì)量濃度為6 g/100 mL的硅藻土溶液，55 ℃、350 W條件下微波加熱提取60 min。過濾、烘干：微波提取后，濾去魚皮，提取液經(jīng)中速濾紙抽濾后，在60 ℃熱風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干。明膠提取率按照下式計算。

1.3.2 傳統(tǒng)酸法魚皮明膠提取工藝

魚皮→室溫解凍→去鱗去脂肪→剪碎脫脂、去雜蛋白→清洗→堿處理→水洗→酸處理、水洗→水浴提取→過濾、烘干→成品明膠

按1.3.1節(jié)方法對魚皮進(jìn)行前處理。堿處理：用NaOH溶液（0.8 g/100 mL）處理魚皮1 h，料液比1∶6，堿處理完成后使用流動水沖洗魚皮至中性。酸處理、水洗：按1∶6料液比，用體積分?jǐn)?shù)2.2%的乙酸溶液處理魚皮2 h后，流動水沖洗至pH 4.5左右。水浴提取：55 ℃下水浴搖床中提取6 h，料液比1∶6。按1.3.1節(jié)方法對提取液進(jìn)行過濾烘干。

1.3.3 等電點測定

將明膠配制成pH 3～12質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的溶液，用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，在660 nm波長處測定溶液透光率。明膠的等電點可以用溶液透光率最低時對應(yīng)的pH值表示。

1.3.4 透射比測定

配制質(zhì)量濃度為6.67 g/100 mL的明膠溶液，在450 nm和620 nm波長處測定透射比。

1.3.5 明膠樣品的分子質(zhì)量分布測定

通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）觀察明膠樣品的分子質(zhì)量分布。在60 ℃水浴條件下，將干明膠溶解到蒸餾水中，使最終明膠溶液質(zhì)量濃度為2 mg/mL。按照樣品和上樣緩沖液體積比3∶1添加還原性上樣緩沖液，混勻后煮沸5 min，立即冷卻上樣，上樣量為15 μL，Marker上樣量10 μL。電泳分離膠和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6%和5%，初始電流設(shè)置為15 mA，當(dāng)藍(lán)色指示條帶遷移至分離膠時將電流調(diào)至25 mA，待指示條帶遷移凝膠底部即停止電泳。流動水下取出電泳凝膠，加入考馬斯亮藍(lán)R-250染色2 h后脫色至條帶清晰，在凝膠成像儀中觀察明膠分子質(zhì)量分布并拍照記錄。

1.3.6 凝凍強度測定

參考Chen Liqing等[18]的方法測定樣品凝凍強度。在60 ℃水浴條件下，將干明膠溶解在蒸餾水中，使溶液最終質(zhì)量濃度為6.67 g/100 mL。將明膠溶液轉(zhuǎn)移至一次性膠凍杯中，于4 ℃條件下冷藏16～18 h后即可進(jìn)行測量。選用探頭TA 10，設(shè)置下壓位移4 mm、測試速率1 mm/s，讀數(shù)即為明膠的凝凍強度，單位為Bloom g。

1.3.7 流變學(xué)特性分析

1.3.7 .1 溫度掃描

使用DHR-1流變儀對質(zhì)量濃度為6.67 g/100 mL的明膠溶液進(jìn)行溫度掃描測試。夾具為40 mm的平板，間隙1 000 μm。設(shè)置溫度范圍5～40 ℃、溫度變化速率1 ℃/min、頻率1 Hz、應(yīng)變5%，首先進(jìn)行降溫過程，然后進(jìn)行升溫過程。膠凝/融化溫度用降溫過程或升溫過程中儲能模量G’和損耗模量G”的交叉點溫度表示。

1.3.7 .2 剪切黏度掃描

配制質(zhì)量濃度為6.67 g/100 mL的明膠溶液，用DHR-1流變儀進(jìn)行剪切黏度掃描，設(shè)置溫度40 ℃、剪切速率變化范圍0～100 s－1。

1.3.8 氨基酸組成測定

稱取明膠粉末20 mg置于水解管中，加入10 mL濃度為6 mol/L的鹽酸溶液，振蕩混勻，抽真空密封，放入熱風(fēng)干燥箱內(nèi)，110 ℃下沙浴水解24 h。水解完成后取出，冷卻至室溫，過濾到250 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。取1 mL水解液，氮吹至溶劑完全蒸發(fā)，再加入1 mL檸檬酸鈉緩沖液，振蕩混勻后，過0.22 μm的濾膜，送入全自動氨基酸分析儀中測定各氨基酸含量。其中羥脯氨酸含量參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》進(jìn)行測定。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜分析

將明膠粉末和溴化鉀粉末按照質(zhì)量比1∶400在瑪瑙研缽中充分研磨，至混合粉末無顆粒感，于40 ℃熱風(fēng)干燥箱中烘干12 h后壓成薄片，使用Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)以4 cm－1的分辨率掃描32 次[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每組實驗重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過Duncan檢驗分析各組數(shù)據(jù)的差異顯著性（P＜0.05），并使用Origin 9.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚皮明膠的提取率

微波-快速凍融耦合提取法和傳統(tǒng)酸法提取的魚皮明膠提取率分別為13.68%和22.01%，本課題組以往的工作中針對相同原料采取傳統(tǒng)酸法得到的魚皮明膠提取率為22.15%[20]。微波-快速凍融耦合提取魚皮明膠時，微波處理以及液氮凍融對魚皮中共價鍵的破壞力不如酸堿處理的破壞力強，提取過程中酸、堿液處理時間也遠(yuǎn)比微波處理和液氮凍融時間長，這可能是造成微波-快速凍融耦合提取法提取率較低的原因。與傳統(tǒng)酸法相比，微波-快速凍融耦合提取方法提取率較低，但不會產(chǎn)生大量廢水，提取效率更高，在綠色提取方向有較好的應(yīng)用前景。

2.2 魚皮明膠的等電點

魚皮明膠的等電點如圖1所示。蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，當(dāng)正負(fù)電荷數(shù)相等即凈電荷為零時溶液的pH值為蛋白質(zhì)的等電點。當(dāng)溶液pH值處于等電點時，蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥作用最弱，溶解度最低，所以明膠的等電點可以用溶液透光率最低時對應(yīng)的pH值表示。通常，根據(jù)明膠化方式的不同，明膠分為A型明膠和B型明膠兩種，A型明膠由酸法預(yù)處理后熱提取得到，等電點為pH 6～9；B型明膠由堿法預(yù)處理后熱提取得到，等電點為pH 5左右[21]。不同于A型和B型明膠，微波-快速凍融魚皮明膠等電點為7.0。預(yù)處理方式的不同導(dǎo)致明膠等電點存在差異的原因可能是，堿處理可使谷氨酰胺脫氨為谷氨酸，天冬酰胺脫氨為天冬氨酸[22]，使明膠等電點降低，而酸處理因保留了酰胺而使明膠帶更多的正電荷?，F(xiàn)有研究表明，在微波場作用下，微波的極化效應(yīng)使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的酰胺鍵發(fā)生松弛、斷裂或重組[23]，這可能與微波-快速凍融耦合魚皮明膠的等電點低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠有關(guān)。

圖1 傳統(tǒng)酸法（A）和微波-快速凍融耦合（B）魚皮明膠的等電點Fig.1 Isoelectric points of gelatins prepared by the traditional acid method (A) and the sequential microwave and rapid freezing-thawing method (B)

2.3 魚皮明膠的透射比

魚皮明膠透射比如表1所示。透射比越大，樣品的透明度越高。GB 6783—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 明膠》中規(guī)定，明膠的透射比應(yīng)滿足在450 nm波長處不低于30%；在620 nm波長處不低于50%。由表1可知，微波-快速凍融耦合提取的明膠滿足GB 6783—2013要求。同時，無論是450 nm波長處還是620 nm波長處均顯示微波-快速凍融耦合魚皮明膠比傳統(tǒng)酸法魚皮明膠的透明度更低。兩種明膠化方式出現(xiàn)透明度差異的原因可能是，使用傳統(tǒng)酸法進(jìn)行明膠化時魚皮先經(jīng)過堿處理后再進(jìn)行酸處理，使膠原原料中影響明膠品質(zhì)的有機物雜質(zhì)溶出，在后續(xù)的水洗過程中隨流動水除去[24]，而微波-快速凍融耦合明膠化不使用酸和堿，也不經(jīng)過水洗，明膠中可溶性雜質(zhì)難以除去。為了解決這個問題，本實驗中，采用多次多級過濾的方式，去除明膠中影響品質(zhì)的可溶性有機物。即在微波-快速凍融耦合處理過程中，熱提取后的明膠溶液先用中速濾紙過濾，再依次過0.45 μm和0.22 μm的濾膜，使透明度得到很大程度的提高，但仍低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠。

表1 魚皮明膠透射比Table 1 Transmittance of fish skin gelatins

2.4 魚皮明膠的分子質(zhì)量分布

魚皮明膠的分子質(zhì)量分布如圖2所示。明膠中高分子亞基主要是指分子質(zhì)量超過100 kDa的組分，主要是γ、β、α亞基，其中γ組分為α亞基的三聚體，β組分為α亞基的二聚體，高分子亞基的存在是影響明膠凝膠強度的主要因素之一，高凝膠強度的明膠往往具有更多的高分子亞基。SDS-PAGE圖清晰地展示出了兩種明膠化方式亞基組成的差異。微波-快速凍融耦合魚皮明膠的高分子亞基組分明顯少于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠，這可能會導(dǎo)致前者凝膠特性更低。

圖2 魚皮明膠的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE patterns of fish skin gelatins

2.5 魚皮明膠的凝凍強度

GB 6783—2013中規(guī)定，明膠的凝凍強度應(yīng)不低于50 Bloom g。由圖3可知，本研究所提取的明膠（傳統(tǒng)酸法魚皮明膠凝凍強度620.54 Bloom g、微波-快速凍融耦合魚皮明膠凝凍強度524.40 Bloom g）均達(dá)到GB 6783—2013要求。傳統(tǒng)酸法魚皮明膠凝凍強度顯著高于微波-快速凍融耦合魚皮明膠（P＜0.05）。

圖3 魚皮明膠的凝凍強度Fig.3 Gel strength of fish skin gelatins

明膠中高分子亞基和亞氨基酸含量是影響凝凍強度的兩個主要因素。從2.4節(jié)明膠分子質(zhì)量分布結(jié)果可知，傳統(tǒng)酸法魚皮明膠化的明膠中α、β、γ等高分子亞基組分更多，而微波-快速凍融耦合明膠化的明膠在提取過程中更容易降解，高分子亞基含量少，小分子組分含量高。這是微波-快速凍融耦合魚皮明膠凝凍強度低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠的重要原因。

2.6 魚皮明膠的流變學(xué)特性分析結(jié)果

2.6.1 溫度掃描分析結(jié)果

評價溫度對明膠黏彈性影響的指標(biāo)包括G’、G”以及tanδ。G’為儲能模量，其越大，樣品體系內(nèi)儲存的能量越高，樣品彈性越大；G”為損耗模量，其越大，樣品由內(nèi)部摩擦而損耗的能量越高，體系黏性越大[25]；損耗角正切tanδ＝G”/G’，是衡量體系黏彈性的指標(biāo)，反映了高聚物的內(nèi)耗性，tanδ越大意味著分子鏈段運動越難，內(nèi)耗越多，體系偏向黏性；tanδ越小說明體系偏向彈性，固性增強。當(dāng)tanδ＞1時，體系中黏性占主導(dǎo)；當(dāng)tanδ＜1時，體系中彈性占主導(dǎo)[26]；當(dāng)tanδ＝1時G”＝G’，所對應(yīng)的溫度即為膠凝/融化溫度，通常情況下，明膠的融化溫度高于膠凝溫度，這個現(xiàn)象是凝膠融化時吸收能量而導(dǎo)致的[27]。

由圖4、5可知，初始降溫過程中，所有明膠tanδ均大于1，G”＞G’，表明降溫的初始狀態(tài)為黏性占主導(dǎo)的明膠溶液。當(dāng)下降到一定溫度時，G’和G”迅速上升，tanδ快速下降，說明此時體系彈性增加，固性增強，值得注意的是，G’開始迅速上升的溫度低于G”，當(dāng)溫度降低到G’開始快速上升的溫度時，tanδ到達(dá)最高值，溫度繼續(xù)下降到低于膠凝溫度后，tanδ＜1并繼續(xù)減小，整個體系轉(zhuǎn)化為以彈性為主的凝膠體系。升溫過程中，所有明膠初始tanδ均小于1，接近0，G”＜G’，表明升溫的初始狀態(tài)為彈性占主導(dǎo)的彈性凝膠體系。當(dāng)上升到一定溫度時，G’和G”迅速下降，tanδ快速上升，說明此時體系黏性增加，流動性增強。當(dāng)溫度升高超過凝膠熔化溫度后，tanδ＞1并繼續(xù)增大，整個體系已經(jīng)轉(zhuǎn)化為黏性為主的溶液體系。同樣地，由于G”趨于穩(wěn)定時對應(yīng)的溫度高于G’趨于穩(wěn)定時對應(yīng)的溫度，所以當(dāng)G’剛開始穩(wěn)定時，tanδ達(dá)到峰值，溫度繼續(xù)上升，tanδ逐漸下降，待溫度上升至G”穩(wěn)定后，tanδ也趨于平穩(wěn)，最終均大于1，說明體系最終以黏性為主。

圖4 魚皮明膠的儲能模量（G’）和損耗模量（G”）Fig.4 Elastic modulus (G’) and loss modulus (G”) of fish skin gelatins

圖5 魚皮明膠的損耗角正切（tan δ）Fig.5 Loss tangent (tan δ) of fish skin gelatins

在溫度掃描過程中，微波-快速凍融耦合魚皮明膠的儲能模量G’和損耗模量G”均低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠。由圖6可知，溫度降低時，傳統(tǒng)酸法魚皮明膠、微波-快速凍融耦合魚皮明膠由溶液體系轉(zhuǎn)化為凝膠體系（tanδ＝1）的溫度依次為18.44 ℃和10.30 ℃；溫度升高時，明膠由凝膠體系轉(zhuǎn)化為溶液體系的溫度（tanδ＝1）分別為20.64 ℃（微波-快速凍融耦合魚皮明膠）和25.56 ℃（傳統(tǒng)酸法魚皮明膠）。上述結(jié)果表明傳統(tǒng)酸法魚皮明膠體系中儲存的能量更大，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)固，類三螺旋含量更高[28]，微波-快速凍融耦合法明膠更易融化。在此基礎(chǔ)上，本研究做了進(jìn)一步的溶解實驗，結(jié)果表明，微波-快速凍融耦合明膠化所制明膠在冷水中輕輕搖晃約10 min即可溶解，對于明膠應(yīng)用的拓展具有一定的意義。市場上，明膠為粉末狀時被稱為吉利丁粉，為片狀時又被稱為吉利丁片，常用于制作慕斯、果凍和奶酪等各種需在低溫下保存的甜點。在使用吉利丁粉或吉利丁片時需先用冷水浸泡后加熱才能將其融化[29]，而微波-快速凍融耦合明膠化制備的明膠省略了加熱的步驟，可直接在冷水中溶解后混入慕斯?jié){，與打發(fā)的奶油混合均勻后即可冷藏，為甜品制作提供了方便。

圖6 魚皮明膠的膠凝/融化溫度Fig.6 Gelling and melting temperatures of fish skin gelatins

2.6.2 剪切黏度掃描分析結(jié)果

魚皮明膠的剪切黏度掃描分析結(jié)果如圖7所示。在剪切速率從0 s－1增大到100 s－1的過程中，原本在溶液中相互纏結(jié)碰撞的明膠分子隨著剪切應(yīng)力的增加而發(fā)生解纏，黏度下降，直至解纏速率等于纏結(jié)速率時，明膠溶液的黏度不再發(fā)生變化，表現(xiàn)為假塑性流體。微波-快速凍融耦合魚皮明膠黏度低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠。通常流體中高分子成分越多，越容易在流動時產(chǎn)生分子鏈間的纏結(jié)，從宏觀上看表現(xiàn)為黏度上升。這說明微波-快速凍融耦合魚皮明膠溶液中分子鏈更短，鏈間的纏結(jié)更少，因而黏度更低，流動性更好。

圖7 魚皮明膠的剪切黏度掃描Fig.7 Viscosity versus shear rate curves of fish skin gelatins

2.7 魚皮明膠的氨基酸組成分析結(jié)果

魚皮明膠的氨基酸組成分布如表2所示。膠原蛋白中重復(fù)著Gly-X-Y序列[30]，其中X和Y位置分別被脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（Hyp）占據(jù)，由膠原部分水解得到的明膠也保持著這樣的氨基酸組成和排列方式。在膠原蛋白的氨基酸組成中，甘氨酸（Gly）含量最高，約占全部氨基酸殘基含量的1/3，由表2可知，Gly是兩種明膠中含量最高的氨基酸，傳統(tǒng)酸法魚皮明膠、微波-快速凍融耦合魚皮明膠的甘氨酸含量分別為238、241 g/kg，彼此間相差不明顯。Pro和Hyp又稱為亞氨基酸，富含Pro和Hyp的區(qū)域可能參與成核區(qū)的形成，亞氨基酸的吡咯環(huán)對三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有重要作用，在宏觀上表現(xiàn)為影響明膠的凝膠強度等凝膠性能。由表2可知，兩種明膠的亞氨基酸含量僅次于甘氨酸，傳統(tǒng)酸法魚皮明膠和微波-快速凍融耦合魚皮明膠的亞氨基酸含量分別為194、182 g/kg，兩種明膠其余的氨基酸含量同樣沒有太大差別?？梢钥闯?，兩種明膠制備方式均不會影響亞氨基酸所占比例，也不會因此而影響明膠性質(zhì)。綜上，因提取方法不同而產(chǎn)生的明膠性質(zhì)差異與氨基酸組成基本無關(guān)。

表2 魚皮明膠氨基酸組成Table 2 Amino acid compositions of fish skin gelatins

2.8 魚皮明膠的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

魚皮明膠的傅里葉變換紅外光譜結(jié)果如圖8所示。其特征譜帶信息如表3所示。酰胺A帶代表N—H基團(tuán)的伸縮振動，當(dāng)其向低波數(shù)移動時，表明N—H基團(tuán)參與的氫鍵含量增加[31]。由表3可知，微波-快速凍融魚皮明膠中，酰胺A帶波數(shù)為3 444.79 cm－1，低于傳統(tǒng)酸法明膠（3 466.37 cm－1）。這表明微波-快速凍融明膠中N—H參與形成的氫鍵含量更高，而傳統(tǒng)酸法魚皮明膠使明膠分子內(nèi)部氫鍵破壞更為嚴(yán)重。通常使用酰胺III帶的吸收峰強度與1 454 cm－1波數(shù)處的吸收峰強度的比值（AamideIII/A1454cm－1）衡量膠原蛋白三螺旋的完整性。由于明膠是膠原蛋白的部分水解產(chǎn)物，故其AamideIII/A1454cm－1都要小于1，AamideIII/A1454cm－1越接近1，表明三螺旋結(jié)構(gòu)保留越完整[32]，傳統(tǒng)酸法魚皮明膠AamideIII/A1454cm－1為0.75，微波-快速凍融耦合魚皮明膠AamideIII/A1454cm－1為0.72，說明兩種明膠三螺旋結(jié)構(gòu)都相對完整，但微波-快速凍融耦合魚皮明膠的三螺旋結(jié)構(gòu)保留更少，與2.6.1節(jié)中水溶性實驗結(jié)果相印證。

表3 魚皮明膠傅里葉變換紅外光譜圖的特征譜帶信息Table 3 FTIR spectra major band information of fish skin gelatins

圖8 魚皮明膠的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.8 FTIR spectra of fish skin gelatins

結(jié)合2.5節(jié)凝凍強度和2.6.1節(jié)溫度掃描結(jié)果來看，盡管微波-快速凍融耦合魚皮明膠的氫鍵較多，但其高分子亞基的含量明顯低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠，因此，微波-快速凍融耦合魚皮明膠的凝凍強度和G’、G”均較低。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，微波-快速凍融耦合魚皮明膠等電點為7，凝凍強度為524.40 Bloom g，透明度較好，以上指標(biāo)均符合GB 6783—2013要求。微波-快速凍融耦合魚皮明膠的模量（儲能模量G’和損耗模量G”）、膠凝/融化溫度和黏度均低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠。微波-快速凍融耦合魚皮明膠比傳統(tǒng)酸法魚皮明膠中氫鍵含量更高，但由于高分子亞基含量低，故凝膠性能低于傳統(tǒng)酸法魚皮明膠。微波-快速凍融耦合魚皮明膠與傳統(tǒng)酸法魚皮明膠氨基酸組成相似，說明兩種明膠制備方式不影響明膠的氨基酸組成。微波-快速凍融耦合提取魚皮明膠的方式不涉及到大量酸、堿的使用，對環(huán)境綠色友好，且得到的明膠具有較好的性質(zhì)，其較低的膠凝/融化溫度可實現(xiàn)冷水?dāng)嚢枞诨÷粤思訜岵襟E，為實際生產(chǎn)提供了方便。