劉國艷，李思童，梁 麗，朱雯綺，周婉麗，徐 鑫

（揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚州 225009）

油茶籽油被譽為“東方橄欖油”與“食用油之王”，含有多種脂質(zhì)伴隨物，其中酚類化合物具有較強的抗氧化能力，是油茶籽油重要的活性成分[1-2]。天然存在的酚類化合物根據(jù)其與基質(zhì)中其他物質(zhì)結(jié)合與否分為游離酚（free phenolics，F(xiàn)P）與結(jié)合酚（bound phenolics，BP），而結(jié)合酚又因其結(jié)合對象或價鍵不同分為酯化酚（esterified phenolics，EP）及不溶性結(jié)合酚（insoluble-bound phenolics，ISP），其中EP又稱為可溶性結(jié)合酚[3-4]。研究表明，酚類化合物的形態(tài)與其抗氧化活性相關(guān)，然而這些研究大多集中于果蔬及谷物，在油脂體系中研究較少[5-6]。Wang Yukun等[7]研究發(fā)現(xiàn)豆類BP的抗氧化能力強于FP，但不同種類大豆中ISP與EP的物質(zhì)組成不同導(dǎo)致其抗氧化能力存在差異；裘芳成等[8]研究發(fā)現(xiàn)山茶油中糖苷態(tài)酚類化合物抗氧化能力最強，其次為ISP、EP及FP；Thiyam等[9]研究表明油菜籽中芥子酸及FP表現(xiàn)出較強的抗氧化作用，BP與總酚則因芥子堿的存在表現(xiàn)出一定的促氧化作用；Alu'datt等[10]利用亞油酸氧化法研究橄欖油中酚類化合物的抗氧化活性，結(jié)果表明相較于BP，F(xiàn)P抗氧化活性更強?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，不同原料中酚類化合物形態(tài)與抗氧化活性相關(guān)性不一致，因此有必要對油茶籽油中不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化能力進行研究。

油脂的氧化穩(wěn)定性是多種天然抗氧化成分共同作用的結(jié)果，而抗氧化成分之間常存在相加、協(xié)同及拮抗等互作關(guān)系[11]。油茶籽油中發(fā)揮重要抗氧化作用的酚類化合物種類多樣，如Wang Xiaoqin等[12]在油茶籽油中鑒定出24 種酚類化合物，其間存在的抗氧化互作關(guān)系錯綜復(fù)雜，因此基于酚類化合物單體研究其互作關(guān)系難度較大。故本實驗對油茶籽油酚類化合物進行形態(tài)區(qū)分，在不同形態(tài)下對其抗氧化互作關(guān)系進行初步研究。

本實驗以油茶籽油為研究對象，分析其中FP、EP及ISP的含量及主要物質(zhì)組成，并測定鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）、2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)，ABTS）陽離子自由基清除能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力及β-胡蘿卜素漂白能力，對比不同形態(tài)酚類化合物單獨作用及混合作用下的抗氧化效果，初步探究其互作關(guān)系類型，為闡明脂質(zhì)伴隨物中酚類物質(zhì)的抗氧化機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長林系列油茶籽 采購于江西。

甲醇、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、乙酸乙酯、福林酚、過硫酸鉀、氯化鐵、氯仿、吐溫20、醋酸鈉、冰乙酸、DPPH、ABTS、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TPTZ）、β-胡蘿卜素、亞油酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸阿拉丁試劑有限公司；乙腈、超純水 默克化工技術(shù)有限公司；甲酸 上海安譜實驗科技股份有限公司；2-氯苯丙氨酸 吉爾生化有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏試驗設(shè)備有限公司；DF-15連續(xù)投料粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；QYZ-230型自動液壓榨油機 山東省泰安市良君益友機械有限公司；SHJ-A6數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋上海比朗儀器有限公司；SHB-III真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RV-10 basic旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司；UV1000紫外分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司；Acquity UPLC-I級超高效液相色譜儀、Vevo G2-S質(zhì)譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 油茶籽油的制備

采用冷榨法制備油茶籽油。油茶籽脫殼，于60 ℃烘干后粉碎，用榨油布包裹放于榨油機中常溫加壓壓榨，壓力40～60 MPa，收集油茶籽油，用紗布過濾除去不溶性雜質(zhì)，得到油茶籽油。

1.3.2 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的提取

油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物提取工藝參考Ayouba[13]、Kang[14]等的方法并優(yōu)化后得到。

FP、EP提取及FP提取液制備：稱取5 g油茶籽油按照料液比1∶15（m/V）加入體積分數(shù)60%甲醇溶液，45 ℃下提取1.5 h后離心，取甲醇層（上層），重復(fù)提取3 次，合并甲醇層；收集油相（下層）進行ISP提取。于40 ℃下將合并的甲醇層真空濃縮至20 mL后用正己烷萃取除去殘余油相，水相按照1∶1體積比添加乙酸乙酯重復(fù)萃取3 次，合并乙酸乙酯層于40 ℃下真空蒸干得到FP，使用5 mL無水甲醇溶解以獲得FP甲醇提取液；乙酸乙酯萃取后的水相用于EP甲醇提取液制備。

EP甲醇提取液制備：向上述乙酸乙酯萃取后的水相按照1∶3體積比加入0.25 mol/L NaOH溶液，于45 ℃下避光堿解6 h，所得堿解液調(diào)節(jié)pH值至2后適量濃縮至20 mL，再用正己烷萃取除去殘余油相，水相按照體積比1∶1加入乙酸乙酯重復(fù)萃取3 次，合并乙酸乙酯層于40 ℃下真空蒸干，使用5 mL無水甲醇溶解以獲得EP甲醇提取液。

ISP提取及其甲醇提取液制備：向提取FP后的油相中按照料液比1∶3（m/V）加入0.25 mol/L NaOH溶液，于45 ℃下避光堿解6 h后調(diào)節(jié)pH值至2，分離油相和水相，收集水相（下層），并用正己烷萃取除去殘余油相，再按照體積比1∶1加入乙酸乙酯重復(fù)萃取3 次，合并乙酸乙酯層于40 ℃下真空蒸干，使用5 mL無水甲醇溶解以獲得ISP甲醇提取液。

FP、EP、ISP甲醇提取液用于后續(xù)指標測定。

1.3.3 酚類化合物含量及純度測定

采用Folin-Ciocalteu法[15]。以沒食子酸為標準品繪制標準曲線：y＝0.012 1x－0.000 6，R2＝0.999；其中y為吸光度，x為酚類化合物質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

不同形態(tài)酚類化合物的純度測定參考文獻[16]。

1.3.4 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的組成分析

參考文獻[16]，使用超高效液相串聯(lián)二級質(zhì)譜法對油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物進行分析鑒定。

色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：A為0.05%（體積分數(shù)，后同）甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫：0.0～1.0 min，95% A；1.0～12.0 min，95% A～5% A；12.0～13.5 min，5% A；13.5～13.6 min，5% A～95% A；13.6～16.0 min，95% A。柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：3 μL；自動進樣器溫度：4 ℃。

質(zhì)譜條件：加熱器溫度300 °C；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）電壓：3.0 kV（ESI+）及3.2 kV（ESI－）；毛細管溫度：350 ℃；S-Lens RF Level：30%（ESI+）及60%（ESI－）。掃描模式：一級全掃描，離子掃描范圍70～1050m/z；數(shù)據(jù)依賴性二級質(zhì)譜掃描（dd-MS2, TopN＝10）；一級質(zhì)譜與二級質(zhì)譜分辨率分別為70 000與17 500。碰撞模式：高能量碰撞解離。

1.3.5 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化能力測定

分別測定1.3.2節(jié)提取所得不同形態(tài)酚類化合物甲醇提取液的FRAP、ABTS陽離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力及β-胡蘿卜素漂白能力，并計算其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50），單位為mg/mL。

FRAP測定：參考王俐娟[17]的方法并加以修改。FRAP試劑配制：將300 mmol/L pH 3.6醋酸緩沖液、20 mmol/L FeCl3、10 mmol/L TPTZ（溶劑為4 mmol/L HCl）按體積比10∶1∶1混合。取上述FRAP試劑2.7 mL與0.3 mL不同質(zhì)量濃度梯度樣品混合均勻，室溫下反應(yīng)8 min后，于593 nm波長處測定吸光度A，用甲醇替代樣品按照相同方法測定吸光度A0，F(xiàn)RAP按式（1）計算。

ABTS陽離子自由基清除能力測定：參考文獻[17]。

DPPH自由基清除能力測定：參考文獻[18]。

β-胡蘿卜素漂白能力測定：參考文獻[10]。

1.3.6 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化互作關(guān)系分析

以1.3.2節(jié)提取所得FP、EP、ISP甲醇提取液為對象，將其兩兩或3 種形態(tài)酚復(fù)配（復(fù)配比（質(zhì)量濃度比）為1∶1或1∶1∶1），測定其不同質(zhì)量濃度下的抗氧化能力，計算IC50實驗值，兩兩復(fù)配分別按照公式（2）、（3）計算復(fù)配的IC50理論值及相互作用指數(shù)（γ）[19]，3 種形態(tài)酚復(fù)配分別按照公式（4）、（5）計算復(fù)配的IC50理論值及γ。采用t檢驗對IC50實驗值與IC50理論值進行統(tǒng)計比較，IC50實驗值＜IC50理論值，即為協(xié)同作用。γ評價協(xié)同作用及拮抗作用的程度，γ＝1表示為相加作用；γ＜1表示為協(xié)同作用，γ值越小表明協(xié)同作用越強；γ＞1表示為拮抗作用。

式中，IC50實驗值是根據(jù)酚類化合物在不同質(zhì)量濃度下的抗氧化能力繪制標準曲線后計算得到，IC50A、IC50B及IC50C為FP、EP和ISP單獨作用時的IC50實驗值；IC50Amix、IC50Bmix及IC50Cmix為復(fù)配組中FP、EP和ISP的IC50實驗值，即復(fù)配組實驗下得到IC50實驗值與酚類化合物在復(fù)配組中所占比例的乘積（兩兩復(fù)配與3 種形態(tài)復(fù)配樣中酚類化合物在復(fù)配組中所占比例分別為1/2與1/3）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗中所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實驗的平均值，實驗所得結(jié)果采用平均值±標準偏差表示。采用Origin軟件繪圖，采用Excel 2016、SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，通過單因素方差分析Student-Newman-Keuls檢驗進行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶籽油中不同形態(tài)酚類化合物的含量及主要物質(zhì)組成

對油茶籽油FP、EP及ISP進行提取，有機溶劑可直接提取的為可溶性酚類化合物（FP及EP），含水有機溶劑會破壞酚類化合物分子間的氫鍵，有利于酚類化合物的溶出，故采用體積分數(shù)60%甲醇溶液對可溶性酚類化合物（FP及EP）進行提取[18,20]。另外，而ISP的釋放則需要經(jīng)過酸解或堿解，相較于酸解的高溫條件，堿解條件下酚類化合物損失較小，并且堿解會破壞酯鍵更有利于釋放出與酯類化合物結(jié)合的酚類化合物，故采用堿解方式對ISP進行提取[21-22]。油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的含量及純度如圖1所示。油茶籽油總酚含量為（137.97±5.14）mg/kg，其中油茶籽油中ISP含量顯著高于FP及EP（P＜0.05），約為總酚含量的47.74%；EP含量最低，約為總酚含量的20.78%。ISP的純度顯著低于其他兩種形態(tài)的酚類化合物（P＜0.05），EP純度最高。

圖1 油茶籽油中不同形態(tài)酚類化合物的含量及其在提取物中的純度Fig.1 Contents of different forms of phenolic compounds in camellia seed oil and purities of phenolic compounds extracted from the oil

表1列出了超高效液相串聯(lián)二級質(zhì)譜法鑒定所得主要存在于油茶籽油中的12 種酚類化合物，由此可知，不同形態(tài)酚類化合物的主要物質(zhì)組成僅在含量上存在差異。油茶籽油酚類化合物主要以酚酸衍生物存在，約占總酚的82%左右，其余為類黃酮。FP中含量較高為苯甲酸衍生物（主要為異香蘭素及甲基香蘭素），類黃酮中則主要為橙皮苷；EP則以水楊酸含量最高，約占總EP的62%；ISP中3,4-二羥基扁桃酸含量最高，約占總ISP的53%，其次為熊果酸甲酯（約15%）。

表1 油茶籽油中不同形態(tài)酚類化合物的主要物質(zhì)組成Table 1 Major components of phenolic compounds in different forms extracted from camellia seed oil

2.2 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化能力及其互作關(guān)系

2.2.1 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化能力

FRAP及ABTS陽離子自由基清除能力均基于單電子轉(zhuǎn)移（single electron transfer，SET）機制，酚類化合物給出電子將氧自由基轉(zhuǎn)化為陰離子，達到抗氧化作用[14,23]。如圖2A～B所示，各樣品均具有一定的電子轉(zhuǎn)移能力及自由基清除能力，且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。油茶籽油酚類化合物的FRAP及ABTS陽離子自由基清除能力排序分別為：FP＞EP＞ISP、ISP＞FP＞EP。SET機制下物質(zhì)的抗氧化能力取決于其活性基團的電離勢，不同形態(tài)酚類化合物的電離勢存在差異，從而導(dǎo)致酚類化合物抗氧化能力存在差異[18,24]。

DPPH自由基清除能力基于氫原子轉(zhuǎn)移（hydrogen atom transfer，HAT）機制及SET機制結(jié)合作用，酚類化合物給出氫原子或電子與氧自由基結(jié)合以清除自由基[25-26]。如圖2C所示，酚類化合物的DPPH自由基清除能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，不同形態(tài)酚類化合物DPPH自由基清除能力由高到低排序為：EP＞ISP＞FP?？赡苁怯捎趬A解破壞了EP的酯鍵，釋放出與基質(zhì)相結(jié)合的酚類化合物，暴露的羥基更容易與自由基結(jié)合。Wang Yukun[7]、王俐娟[17]等研究表明大豆及茶葉籽油中BP的DPPH自由基清除能力強于FP，Kaisoon[27]、Chandrasekara[28]等發(fā)現(xiàn)可食用花卉及谷物中ISP的DPPH自由基清除能力顯著低于EP（P＜0.05），與本研究結(jié)果相似。

β-胡蘿卜素漂白法通過測定亞油酸氧化程度反映待測物抗氧化活性，因此適于評價油脂提取物[29]。如圖2D所示，油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物均具有抑制脂質(zhì)氧化的能力，且與其質(zhì)量濃度相關(guān)，其根據(jù)表2中β-胡蘿卜素漂白能力實驗中的IC50實驗值比較β-胡蘿卜素漂白能力，不同形態(tài)酚類化合物的β-胡蘿卜素漂白能力由高到低排序為：EP＞ISP＞FP，與DPPH自由基清除能力趨勢相同。但Alu'datt等[10]研究發(fā)現(xiàn)，橄欖油中FP的β-胡蘿卜素漂白能力高于BP，與本研究結(jié)果不一致?？赡苁情蠙煊秃陀筒枳延椭蟹宇惢衔锝M成也有所區(qū)別，因而其活性基團組成及排列不同，影響其抗氧化活性，導(dǎo)致其研究結(jié)果存在一定差異[17,20]。

圖2 不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant activity of extracted phenolic compounds in different forms at different concentrations

2.2.2 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化互作關(guān)系

分析FP、EP及ISP復(fù)配后在不同評價方法下的IC50及其相互作用指數(shù)，其抗氧化互作關(guān)系如表2所示。FP+ISP組合及EP+ISP組合在不同抗氧化機制下均表現(xiàn)出一定的相加或協(xié)同作用，且后者的抗氧化活性更強，可能是由于兩種組合中的強抗氧化劑相互再生或弱抗氧化劑再生強抗氧化劑，提高了整體的抗氧化強度從而表現(xiàn)出相加或協(xié)同效應(yīng)[11,17]。另一方面，F(xiàn)P+EP組合在ABTS陽離子自由基清除能力及β-胡蘿卜素漂白能力測定方法下，F(xiàn)P+EP+ISP組合在DPPH自由基清除能力及β-胡蘿卜素漂白能力測定方法下均表現(xiàn)出明顯的拮抗作用，可能是由于體系中強抗氧化劑也可再生弱抗氧化劑，使整體抗氧化活性降低，產(chǎn)生拮抗效應(yīng)[11,30]。FP+EP組合在FRAP及DPPH自由基清除能力測定方法下，F(xiàn)P+EP+ISP組合在FRAP及ABTS陽離子自由基清除能力測定方法下均表現(xiàn)出相加作用。有研究發(fā)現(xiàn)，酚類化合物的還原電位越低，其給電子能力越強，與過氧自由基結(jié)合能力就越強，因此含較高質(zhì)量濃度低還原電位物質(zhì)的組合表現(xiàn)出較強的抗氧化作用[11,23]。此外，油脂中不同形態(tài)酚類化合物的物質(zhì)組成及含量均有區(qū)別，其所包含的活性基團存在差異，影響了酚類化合物的氫原子及電子轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致復(fù)配組合在不同機制下表現(xiàn)出不同的抗氧化互作關(guān)系[5,20]。如，ISP中含量較高的3,4-二羥基扁桃酸、熊果酸甲酯及高車前素分子中，苯鄰位、間位羥基與基質(zhì)結(jié)合形成分子間氫鍵，并降低其酚羥基及碳碳雙鍵的解離能及電離勢，發(fā)揮出更強的抗氧化能力，因此含ISP的兩兩復(fù)配組合主要呈協(xié)同作用。

表2 不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化能力Table 2 Antioxidant interaction of phenolic compounds in different forms

油脂自動氧化過程中，氫過氧化物分解形成大量自由基，抗氧化劑提供氫原子與氧自由基結(jié)合形成非自由基產(chǎn)物或更穩(wěn)定的抗氧化劑自由基，終止自由基鏈式反應(yīng)以達到延緩脂質(zhì)氧化的作用，這一機理與酚類化合物在HAT機制下清除DPPH自由基相似。另外，在SET機制中發(fā)現(xiàn)酚類化合物具有較強的電子轉(zhuǎn)移能力，表明其具有較低的還原電位及在鏈式反應(yīng)中將氫原子提供給過氧自由基的能力[31]。由此可以推斷酚類化合物可增強油脂穩(wěn)定性，且EP+ISP組合可能發(fā)揮明顯的協(xié)同作用。

3 結(jié) 論

本研究以油茶籽油為原料，分析其中FP、EP及ISP的含量及其主要物質(zhì)組成，結(jié)果表明，油茶籽油FP、EP及ISP含量分別為（43.43±2.05）、（28.67±1.51）mg/kg及（65.87±1.34）mg/kg，其中ISP含量顯著高于FP及EP（P＜0.05），為油茶籽油總酚的47.74%，而EP含量最低，約為總酚含量的20.78%。另外，F(xiàn)P中以苯甲酸衍生物含量較高（主要為異香蘭素及甲基香蘭素），EP中主要為水楊酸，ISP中主要為3,4-二羥基扁桃酸。通過測定DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP及β-胡蘿卜素漂白能力，對油茶籽油中不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化活性及其互作關(guān)系進行研究。結(jié)果表明，不同形態(tài)酚類化合物在不同機制下的抗氧化能力存在差異。不同形態(tài)酚類化合物的抗氧化互作關(guān)系結(jié)果顯示，F(xiàn)P+ISP組合及EP+ISP組合在不同抗氧化機制下均表現(xiàn)出一定的協(xié)同或相加作用，且后者的抗氧化活性更強；而FP+EP組合及FP+EP+ISP組合則表現(xiàn)出拮抗或相加作用。本研究揭示了油茶籽油中3 種形態(tài)酚類化合物的互作關(guān)系，有助于闡明脂質(zhì)伴隨物的抗氧化機理，同時為具有協(xié)同增效作用酚類化合物的應(yīng)用提供理論依據(jù)。