張翔宇，余鎂霞，譚景艾，王 鵬，李才敬，吳光亮，程 琴，王燕寧，蔣寧飛，黃詩穎，賀浩華，2，3，邊建民，2，3

(1.作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點實驗室，江西 南昌 330045；2.作物生理生態(tài)與遺傳育種江西省重點實驗室，江西 南昌 330045； 3.江西省水稻高水平工程研究中心，江西 南昌 330045)

水稻是世界上最重要的喜溫糧食作物之一，低溫冷害是水稻整個生長發(fā)育過程中經(jīng)常遭遇的一種自然災害，是限制其生長發(fā)育、地理分布以及產(chǎn)量品質(zhì)形成的主要環(huán)境因子之一。水稻因低溫冷害而造成的減產(chǎn)已經(jīng)是世界范圍內(nèi)普遍存在的問題，據(jù)統(tǒng)計中國每年因低溫損失稻谷約3×109～5×109kg。水稻芽期冷害影響水稻成活率、根和芽生長，導致幼苗活力降低[1]。其中根系是評判水稻能否繼續(xù)生長的重要因素之一[2]，因為根系活力是水稻生長情況的一個重要指標，根系活力越高，水稻地下部分對礦物質(zhì)元素的吸收能力越強，地上部分生長也越好[3]。水稻苗期冷害會影響根系發(fā)育，導致根系降低礦物質(zhì)吸收不足，影響水稻苗期的活力，進而導致水稻產(chǎn)量減少。多數(shù)研究結(jié)果表明，水稻苗期根數(shù)耐冷受數(shù)量性狀(QTL)控制[4]，因此，尋找水稻苗期根數(shù)耐冷QTL對于解析水稻耐冷分子遺傳基礎(chǔ)，選育耐冷新品種有重要的意義。

隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展，定位了多個低溫脅迫下影響水稻幼苗發(fā)育的QTL。比如，以水稻芽期發(fā)芽率為耐冷鑒定標準，王棋等[5]以秈稻品種瀘恢 99和粳稻品種沈農(nóng)265雜交所產(chǎn)生的144個家系為材料共檢測到了3個發(fā)芽期耐冷性QTLs分別位于第 3，5，9染色體上命名為qLTG-3、qLTG-5、qSCT-9；紀素蘭等[6]以Kinmaze/DV85重組自交系 (RILs) 群體為材料檢測到11個QTL，其中qLTG-7和qLTG-11可在 3個環(huán)境中穩(wěn)定表達。林靜等[7]利用以秈稻9311為受體、粳稻日本晴為供體的染色體片段置換系(CSSLs)，在5，7號染色體上鑒定出4個芽期耐冷QTL。

死苗率作為水稻耐冷評判標準，嚴長杰等[8]以秈稻品種南京11和粳稻品種巴利為親本構(gòu)建了67個家系，并在第7號染色體G379b～RG4區(qū)間發(fā)現(xiàn)存在耐冷有關(guān)的基因Cts7。Liu等[9]以存活率為指標，檢測到了分布在6條染色體上的6個QTLs。陳亮等[10]以發(fā)芽力作為水稻芽期耐冷評判標準，以珍汕97B與多年生稻 AAV002863為親本的198個家系，構(gòu)建了140個SSR標記的連鎖圖譜，并檢測到2個低溫發(fā)芽力相關(guān)的基因座；姜樹坤等[11]以芽期冷處理后恢復狀態(tài)為鑒定水稻耐冷評判標準，并把秧苗的恢復狀況分為5個等級；在水稻的1，3，9，11號染色體中檢測到5個芽期耐冷的QTL。韓龍植等[12]以秈粳交密陽23/吉冷1號的F2∶3200個家系作為作圖群體，以水稻根長、根質(zhì)量為指標在自然條件和12 ℃冷水脅迫下，檢測到在第1，2，6，11，12染色體上17個與根系性狀相關(guān)的QTL，對表型變異的解釋率為5.8%～15.2%，其中與最大根的根徑相關(guān)，位于第2染色體RM263～RM6區(qū)間的qCRD2和位于第11染色體RM21～RM206區(qū)間的qCRD11，以及與根干質(zhì)量相關(guān)，位于第2染色體RM262～RM263區(qū)間的qCRWT2和位于第11染色體RM229～RM21區(qū)間的qCRWT11貢獻率較大，分別為15.0%，15.2%，10.6%和12.2%。

雖然對水稻苗期耐冷性進行了較多的QTL定位，這些QTLs在水稻的12條染色體均有分布[13]，但是檢測到的水稻芽期耐冷QTL大多與發(fā)芽率或根長、根質(zhì)量相關(guān)，與芽期根數(shù)相關(guān)的QTL很少。另外，不同遺傳群體得出的結(jié)果也不盡相同，因此，有必要利用更多的遺傳群體對水稻芽期耐冷QTL進行分析，發(fā)掘更多的根數(shù)耐冷QTL，為水稻冷脅迫根數(shù)分子育種提供參考。基于此，本試驗以新構(gòu)建的9311(受體)/日本晴(供體)染色體片段置換系群體為材料，對低溫冷脅迫下控制水稻芽期根數(shù)QTL進行定位分析，以期為克隆水稻低溫脅迫下控制根數(shù)發(fā)育的基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

該試驗材料是以秈稻9311作為輪回親本，粳稻日本晴作為供體親本構(gòu)建獲得的包含121個株系群體。于2019年7月采集水稻葉片組織樣本，DNA提取、文庫構(gòu)建和全基因組測序由華大基因科技有限公司協(xié)助完成并得出高質(zhì)量bin標記。

1.2 發(fā)芽期耐冷性鑒定

苗期水稻耐冷鑒定采取的是李太貴[14]的方法并微做改動。從親本9311和日本晴以及CSSLs群體中選取30粒籽粒飽滿的種子先經(jīng)過5.5%的次氯酸鈉消毒后，用蒸餾水漂洗干凈。準備無菌培養(yǎng)皿，并將種子放置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中加入蒸餾水至剛好浸沒種子，待種子在常溫25 ℃環(huán)境下萌發(fā)后，置于恒溫培養(yǎng)箱15 ℃低溫條件下處理7 d，最后在25 ℃恢復生長7 d，測量根數(shù)。根數(shù)測定標準：每個家系選擇其中整齊一致的10個種子測定其根數(shù)。重復3次，計算其平均值用于后期計算分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

IciMapping V4.2軟件對CSSLs群體進行bin標記分析和QTLs定位。以LOD=2.5為檢測閾值，當QTL的LOD值大于2.5時，認為存在QTL。QTL命名見參考文獻[15]。用SPSS 22軟件與Microsoft Excel 2017內(nèi)置公式進行顯著性分析。候選基因分析通過查閱http：//rice.plantbiology.msu.edu/網(wǎng)站輸入QTLs所在的物理位置找到基因名稱并在http：//www.ricedata.cn/gene/分析其功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 根數(shù)分析

低溫脅迫后，對9311和日本晴根數(shù)進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)日本晴平均根數(shù)為4.50，9311平均根數(shù)為7.20，二者在P=0.01的水平上達到極顯著差異。CSSLs群體根數(shù)平均值為4.84，最高值為7.20，最低值為3.13，CSSLs群體根數(shù)表現(xiàn)為連續(xù)正態(tài)分布，其中水稻根數(shù)在3～4的為8個；4～5的為69個；5～6的為35個；6～7的為4個；7～8的為2個，存在明顯的超親分離現(xiàn)象，符合QTL定位要求(表1、圖1，2)。

表1 冷脅迫下親本及CSSLs群體根數(shù)Tab.1 The root number of the two parents and CSSLs population under cold stress

2.2 QTL定位

采用IciMapping V4.2軟件對低溫脅迫下影響水稻根數(shù)的QTL進行分析。在15 ℃低溫脅迫環(huán)境下共檢測到2個與水稻根數(shù)相關(guān)的QTLs(表2)，分別命名為qCSRN1.1和qCSRN3。這2個QTLs分別位于水稻第1號染色體chr1～bin43標記(31.75～33.15 Mb區(qū)間)和第3號染色體上chr3～bin179標記處(32.2～32.7 Mb區(qū)間)，加性效應值分別為0.78和-0.67，可解釋表型變異的16.26%，9.06%。其中qCSRN1.1增效等位基因來自供體親本日本晴，qCSRN3增效等位基因來自受體親本9311。

2.3 上位性QTL分析

本研究共檢測出2對低溫脅迫下影響水稻根數(shù)的上位性互作QTLs(表3)。QTLqCSRN1.1(第1號染色體chr1～bin43標記處)與QTLqCSRN1.2(第1號染色體chr1～bin52標記處)存在互作，LOD值為5.60，互作效應為-0.34；QTLqCSRN1.1(第1號染色體chr1～bin43標記處)與QTLqCSRN9(第9號染色體chr9～bin449標記處)存在互作，LOD值為5.75，互作效應為-0.43。

2.4 候選基因分析

對qCSRN1.1和qCSRN3候選基因分析發(fā)現(xiàn)，qCSRN1.1區(qū)間內(nèi)包含138個基因，68個與蛋白合成相關(guān)的基因，42個與酶合成相關(guān)的基因，3個轉(zhuǎn)錄因子(圖3)；其中LOC_Os01g56200[16]、LOC_Os01g56470[17]、LOC_Os01g57340[18]已被克隆，這3個基因與稻瘟病、白葉枯病相關(guān)。qCSRN3區(qū)間內(nèi)包含88個基因，62個與蛋白合成相關(guān)的基因，9個與酶合成相關(guān)的基因，3個轉(zhuǎn)錄因子(圖3)，LOC_Os03g56950[19]、LOC_Os03g57190[20]、LOC_Os03g57220[21]、LOC_Os03g57240[22]已被克??；LOC_Os03g57190與冷脅迫相關(guān)，是OsPCF6的候選基因，其負向調(diào)節(jié)水稻耐冷性，可能為qCSRN3的候選目標基因。

表2 檢測到的耐冷性QTL位點Tab.2 QTL for clod resistant detected at germination stage and seedling stage

表3 水稻芽期耐冷性的上位性效應位點Tab.3 Epistasis effect of locus for cold tolerance at germination stage in rice

3 討論

水稻根系既是吸收養(yǎng)分和水分的重要器官又是多種激素、有機酸和氨基酸合成的重要場所，其形態(tài)和生理特征與地上部的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)形成均有著密切的聯(lián)系[22]。2011年袁隆平院士將“根系發(fā)達”作為水稻新株型的主要性狀之一，根系是否發(fā)達與水稻品種的好壞直接相關(guān)。根數(shù)是水稻根系的一個重要組成因素，有研究表明，水稻根數(shù)多少會影響水稻的產(chǎn)量與品質(zhì)[23]。因此，對水稻根系的研究是非常必要的。而溫度的變化對水稻根數(shù)影響較大。為研究低溫脅迫下水稻芽期根數(shù)遺傳表現(xiàn)，本研究利用9311/日本晴衍生的CSSLs群體對低溫(15 ℃)條件下控制根數(shù)進行了遺傳分析。結(jié)果顯示低溫脅迫下，水稻苗期根數(shù)生長除受QTL控制的同時還受到上位性QTL互作的影響，表明水稻上位性互作位點對于可能調(diào)控苗期根數(shù)冷脅迫起到了重要作用。

根數(shù)作為評判水稻苗期耐冷性的一個重要指標研究相對較少。前人在水稻根系研究中由于選用品種不同，處理方法不同，因此，檢測到的水稻根數(shù)QTL位置、數(shù)目、貢獻率都存在著較大差異。本研究利用9311(受體)和日本晴(供體)的染色體置換系群體，在15 ℃條件下檢測出2個根數(shù)QTLs(qCSRN1.1和qCSRN3)。通過與前人根數(shù)QTL比較發(fā)現(xiàn)，qCSRN1.1與前人定位耐冷相關(guān)QTL(基因)位置不同，表明qCSRN1.1可能是一個新的耐冷QTL。qCSRN3與 Andaya等[24]定位的QTLqPSST-3(Chr3，32.0～35.1 MB)位置重疊，qPSST-3是控制水稻芽期耐冷的QTL，表明qCSRN3可能為一個冷脅迫控制水稻的主效位點。

水稻苗期耐冷性狀屬于數(shù)量性狀，易受環(huán)境影響，不同環(huán)境、不同栽培條件、不同群體定位到的QTL不同[25]，使用遺傳背景復雜的重組自交系群體為后續(xù)克隆和解析這些耐冷基因增加了難度。本研究采用染色體置換系進行了苗期耐冷試驗，該群體只存在群體之間片段代換的差異，并且該群體遺傳背景簡單，QTL定位消除了其他背景的干擾，可以通過進一步雜交形成F2次級分離群體把QTL定位到更小的區(qū)間，從而實現(xiàn)基因的克隆。并且本研究的優(yōu)勢在于前人對于水稻芽期根數(shù)耐冷研究較少，定位出的QTL可以補充苗期根系耐冷QTL數(shù)據(jù)，為今后聚合耐冷基因，提升育種效率打下堅實基礎(chǔ)。