石包圣，閆國(guó)珍，李愛華，李志遠(yuǎn)，何俊峰，劉 揚(yáng)

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院2018級(jí)研究生，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病房超聲科)

股骨頭壞死為常見的骨科疾病，股骨頭壞死致病機(jī)制尚未研究清楚，構(gòu)建合適的動(dòng)物模型可為治療提供新的選擇方案，研究致病過(guò)程中機(jī)體的變化。目前制備早期股骨頭壞死的方法有單激素制備法、激素聯(lián)合其他因子制備法、酒精制備法。Yamamoto等[1]首先對(duì)實(shí)驗(yàn)兔注射大劑量甲潑尼龍，43 %的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生血小板減少癥、低纖維蛋白原血癥及嚴(yán)重的股骨頭壞死。Bai等[2]研究發(fā)現(xiàn)單激素制備股骨頭壞死動(dòng)物模型需要長(zhǎng)期持續(xù)給予大劑量激素，制備時(shí)間長(zhǎng)，且多次注射僅增加股骨頭壞死率，但病灶范圍及嚴(yán)重程度無(wú)明顯變化。在研究激素聯(lián)合異體物質(zhì)過(guò)程中，內(nèi)毒素可造成血管內(nèi)皮損傷、炎癥反應(yīng)增加，股骨頭壞死發(fā)生率、血液微循環(huán)發(fā)生障礙率增加。Yamamoto等[3]注射內(nèi)毒素聯(lián)合大劑量激素改良股骨頭壞死制備方案，成模率升至85 %，但死亡率隨之升至50 %，證明減少內(nèi)毒素使用劑量降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率。因此，添加異體物質(zhì)可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨內(nèi)外血管處于高凝狀態(tài)，縮短制備時(shí)間，但會(huì)增加引起過(guò)度免疫反應(yīng)幾率，造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。

本實(shí)驗(yàn)用內(nèi)毒素聯(lián)合不同劑量激素制備早期股骨頭壞死。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇方面，兔子體型中等，動(dòng)物資源較易獲得，飼養(yǎng)難度低，且可通過(guò)頂端給水使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期處于站立狀態(tài)，使實(shí)驗(yàn)兔的受力方式更接近人類，故本實(shí)驗(yàn)選用兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[4]。骨陷窩中骨細(xì)胞消失情況的發(fā)生是股骨頭壞死發(fā)生病理診斷標(biāo)志，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較各組空骨陷窩陽(yáng)性率明確早期股骨頭壞死制備情況[5]。本實(shí)驗(yàn)首先使用小劑量?jī)?nèi)毒素聯(lián)合臀部肌肉注射不同劑量激素構(gòu)建早期股骨頭壞死，明確激素最佳使用時(shí)間，其次在超聲引導(dǎo)下向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射激素，觀察制備早期股骨頭壞死動(dòng)物模型，觀察是否可以減少構(gòu)建動(dòng)物模型的時(shí)間，以便為快速簡(jiǎn)便制備股骨頭壞死提供新的研究方法及思路。

1 材料與方法

1.1材料 新西蘭白兔(包頭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)；甲基強(qiáng)的松龍(天津金耀藥業(yè)有限公司)；內(nèi)毒素(北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司)；青霉素鈉(濟(jì)南允誠(chéng)生物科技有限公司)；生理鹽水(石家莊四藥有限公司)；戊巴比妥鈉(上海榕柏生物技術(shù)有限公司)；靶向藥物微泡造影劑(上海博萊科信誼藥業(yè)有限責(zé)任公司)。

1.2動(dòng)物模型制備方法 將35只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為7組，頂端供水、供食，分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后進(jìn)行分組：(1)A組：空白對(duì)照組；(2)傳統(tǒng)組：傳統(tǒng)制備法為內(nèi)毒素聯(lián)合臀部肌肉注射20 mg/kg甲基強(qiáng)的松，根據(jù)注射激素時(shí)間分為B組(3 d)、C組(5 d)、D組(7 d)；(3)改良組：超聲制備改良法為內(nèi)毒素聯(lián)合超聲下關(guān)節(jié)腔注射激素，根據(jù)激素注射時(shí)間分為E組(3 d)、F組(5 d)、G組(7 d)。首先傳統(tǒng)制備法和超聲制備改良法均經(jīng)耳緣靜脈注射10 μg/kg內(nèi)毒素，隨后注射激素，制備早期股骨頭壞死動(dòng)物模型。用戊巴比妥鈉(0.7 mL/kg)麻醉動(dòng)物，將其仰臥位固定四肢于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，碘伏消毒，下肢外展，超聲引導(dǎo)下將22 G穿刺針?biāo)腿腙P(guān)節(jié)腔內(nèi)，拔出針芯注射0.2 mL生理鹽水，明確穿刺針位置，更換注射器向關(guān)節(jié)囊內(nèi)注射等劑量激素；空白對(duì)照組注射等量生理鹽水。

實(shí)驗(yàn)兔繼續(xù)飼養(yǎng)4周后，經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞法處死動(dòng)物，取出雙側(cè)股骨頭及干垢端，用福爾馬林液固定3 d后，每周更換脫鈣液脫鈣，直至穿刺針輕易穿刺插入脫鈣組織，終止脫鈣；取材脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，病理切片行病理形態(tài)學(xué)觀察。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1一般情況 給藥后3組動(dòng)物食量、脫毛情況、體重及步態(tài)變化。記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡時(shí)間，并立即解剖分析死因，統(tǒng)計(jì)各組死亡數(shù)量。

1.3.2影像學(xué)觀察 (1)二維彩超檢查方法：術(shù)前使用脫毛劑對(duì)耳緣靜脈、股骨頭觀察區(qū)域備皮，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉，實(shí)驗(yàn)兔取仰臥位，四肢固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，碘伏消毒，下肢外展，使用9 MHz淺表探頭掃查兔股骨頭長(zhǎng)軸，觀察骨皮質(zhì)及關(guān)節(jié)腔形態(tài)。(2)超聲造影檢查：用5 mL生理鹽水溶解造影劑，用力振搖直至凍干粉末完全分散。經(jīng)耳緣靜脈注入聲諾維造影劑0.4 mL，同時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器，檢查時(shí)保持探頭不動(dòng)，連續(xù)觀察2 min，并存儲(chǔ)動(dòng)態(tài)影像。觀察股骨頭周圍血供情況，有無(wú)血管數(shù)目減少。(3)X射線平片觀察觀察股骨頭骨皮質(zhì)是否連續(xù)完整，有無(wú)骨質(zhì)缺損，有無(wú)出現(xiàn)新月征(crescent sign)或壞死灶被硬化骨包繞及節(jié)段性塌陷。

1.3.3病理學(xué)檢查 光鏡下觀察組織學(xué)切片，觀察股骨頭形態(tài)學(xué)變化及病理學(xué)改變，任選5個(gè)400倍視野，記數(shù)視野內(nèi)的全部骨陷窩數(shù)和空骨陷窩數(shù)，計(jì)算空骨陷窩陽(yáng)性率=(空骨陷窩數(shù)/全部骨陷窩數(shù))×100 %。

2 結(jié)果

2.1一般情況 傳統(tǒng)組注射激素7 d后進(jìn)食量增大，14 d時(shí)開始出現(xiàn)飲食差，活動(dòng)度減低，臀部激素注射區(qū)域出現(xiàn)區(qū)域性脫毛，21 d時(shí)出現(xiàn)精神萎靡，稀便。改良組注射后出現(xiàn)上述情況早于傳統(tǒng)組3 d，關(guān)節(jié)腔注射激素后，2只兔穿刺部位滲血，下肢腫脹，給予穿刺部位紗布包扎及白眉蛇毒凝血針1 kU皮下注射后，下肢腫脹好轉(zhuǎn)。

2.2影像學(xué)觀察

2.2.1二維超聲及造影表現(xiàn) 對(duì)照組股骨頭骨皮質(zhì)完整，表面光滑，未見骨贅形成，關(guān)節(jié)囊無(wú)積液，周圍軟組織未見水腫，彩色多普勒(CDFI)可見周邊可見豐富血流信號(hào)，傳統(tǒng)組、改良組股骨頭形態(tài)結(jié)構(gòu)及超聲表現(xiàn)未見明顯異常。超聲造影顯示對(duì)照組圍血管顯影良好，未見局部充盈缺損，傳統(tǒng)組及改良組股骨頭周圍血管顯影數(shù)目減少。見圖1。

圖1 股骨頭二維超聲及造影圖

2.2.2X線影像學(xué)表現(xiàn) 對(duì)照組、傳統(tǒng)組及改良組股骨頭骨皮質(zhì)連續(xù)完整，改良組少部分股骨頭可見骨密度不均，但無(wú)特異性表現(xiàn)，未見骨質(zhì)彌漫性病變、囊性病變，未見微骨折及股骨頭壞死特征性表現(xiàn)“新月征”或壞死灶被硬化骨包繞及節(jié)段性塌陷。見圖2。

圖2 股骨頭X線顯像比較

2.3病理學(xué)檢查及相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 空白對(duì)照組股骨頭顏色潤(rùn)白，股骨頭及軟骨形態(tài)完整，無(wú)缺損，骨質(zhì)硬，切割阻力大，軟骨表面光滑、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞排列整齊，骨小梁排列規(guī)則整齊，空骨陷窩細(xì)胞少見，可見正常脂肪細(xì)胞分布。傳統(tǒng)組及改良組病理：部分骨細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)血管擴(kuò)張、淤血，隨激素注射時(shí)間延長(zhǎng)，脂肪細(xì)胞數(shù)量增多，骨小梁數(shù)目減少，分布稀疏，兩組動(dòng)物模型均未見骨小梁斷裂。

傳統(tǒng)組及改良組與對(duì)照組行空骨陷窩陽(yáng)性率比較，三組間比較采用方差分析，其中注射3 d的各組空骨陷窩陽(yáng)性率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，注射時(shí)長(zhǎng)為5 d、7 d的各組空骨陷窩陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；改良組空骨陷窩陽(yáng)性率均高于傳統(tǒng)組(P<0.05)。見圖3、表1。

圖3 對(duì)照組、傳統(tǒng)組、改良組病理學(xué)改變

表1 各組兔股骨頭壞死空骨陷窩細(xì)胞率(%)

3 討論

在制備激素性股骨頭壞死中，內(nèi)毒素可增加股骨頭壞死發(fā)生率。喻鈞倫等[6]發(fā)現(xiàn)，單純內(nèi)毒素注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率高達(dá)80 %，而使用小劑量?jī)?nèi)毒素聯(lián)合激素方法死亡率僅為18 %，注射5 μg/kg內(nèi)毒素聯(lián)合甲強(qiáng)龍第8周成功造模。我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，注射10 μg/kg內(nèi)毒素后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)差，精神差，出現(xiàn)1只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡，給予青霉素及間隔24 h后給予實(shí)驗(yàn)性激素后，動(dòng)物一般情況改善。針對(duì)于上述情況，后期實(shí)驗(yàn)給予提前12 h預(yù)防性注射青霉素，10 min內(nèi)緩慢推注內(nèi)毒素，后期實(shí)驗(yàn)中無(wú)動(dòng)物死亡。頂端給水可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物站立，使其受力接近人類，但未長(zhǎng)期持續(xù)性站立，相關(guān)因素仍未能量化，下一步需設(shè)計(jì)相關(guān)飼養(yǎng)籠使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期站立，使其長(zhǎng)時(shí)間保持受力與人類相近；而且在食物方面，兔為素食性，是否可改變其食物譜來(lái)縮短構(gòu)建股骨頭壞死動(dòng)物模型時(shí)間仍可進(jìn)行相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)行超聲及X線未見到特殊性新月征表現(xiàn)，但目前在嚴(yán)重股骨頭壞死中可發(fā)現(xiàn)微骨折，而早期股骨頭壞死僅表現(xiàn)為空骨陷窩細(xì)胞異常，在早期及晚期股骨頭壞死的漸變過(guò)程中目前無(wú)標(biāo)準(zhǔn)，下一步實(shí)驗(yàn)可延長(zhǎng)造模時(shí)間，觀察出現(xiàn)微骨折時(shí)間，為中晚期激素性股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建提供相關(guān)數(shù)據(jù)。田媛媛等[7]研究發(fā)現(xiàn)，注射內(nèi)毒素及激素導(dǎo)致骨質(zhì)內(nèi)微血管數(shù)目減少，行病理學(xué)微血管計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)模型組數(shù)目較空白組減少，但本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行骨質(zhì)微血管相關(guān)研究，下一步可推進(jìn)相關(guān)骨質(zhì)微循環(huán)MRI表現(xiàn)及病理學(xué)表現(xiàn)的相關(guān)研究。

近年來(lái)超聲儀器分辨率的提高和超聲介入技術(shù)提升使超聲微創(chuàng)治療及診斷快速發(fā)展。超聲監(jiān)視下制備動(dòng)物模型具有微創(chuàng)性、安全性、快速性、有效性，避免部分并發(fā)癥發(fā)生等優(yōu)勢(shì)，目前在心臟驟停模型，肺部腫瘤、心包積液、關(guān)節(jié)出血、重癥胰腺炎[8-10]的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備中發(fā)揮了重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超聲引導(dǎo)下注射激素，可實(shí)時(shí)明確穿刺部位及周圍有無(wú)血管，避免損傷周圍血管造成對(duì)于股骨頭供血影響，確保穿刺針進(jìn)入關(guān)節(jié)囊腔內(nèi)，大幅度提升了目標(biāo)區(qū)域的藥物濃度，避免了大劑量激素對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的全身性損傷，穿刺過(guò)程中觀察關(guān)節(jié)周圍出血及滲液情況，必要時(shí)給予抗凝對(duì)癥治療。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，改良組的空骨陷窩細(xì)胞數(shù)目數(shù)量多于傳統(tǒng)組。減少藥物注射時(shí)間，可降低因持續(xù)藥物注射導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。但兔關(guān)節(jié)囊腔容積量小，并且術(shù)后兔下肢活動(dòng)度大，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)藥物因肌肉擠壓而外滲，影響藥物吸收，因此如何修改注射部位及明確最佳藥物濃度可作為下一步研究方向。本實(shí)驗(yàn)為注射激素后繼續(xù)飼養(yǎng)四周，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可延長(zhǎng)飼養(yǎng)時(shí)間觀察延長(zhǎng)飼養(yǎng)時(shí)間能否增加股骨頭空骨陷窩細(xì)胞發(fā)生率。

綜上所述，超聲引導(dǎo)下制備股骨頭壞死可縮短實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備時(shí)間，具體實(shí)驗(yàn)方法可進(jìn)一步改進(jìn)，為制備相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型提供新思路。