李健維，謝宗玉

新生兒腦損傷(neonatal brain injury，NBI)可由多種因素導(dǎo)致，例如缺氧缺血(hypoxic-ischemic，HI)、宮內(nèi)感染以及圍產(chǎn)期出血等[1]。缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是由圍產(chǎn)期新生兒腦部HI導(dǎo)致復(fù)雜的生理、細(xì)胞和分子變化的一類(lèi)最常見(jiàn)NBI，在發(fā)達(dá)國(guó)家中發(fā)病率約為1.5%，而中低收入國(guó)家則高達(dá)1%～2%[2]。一旦新生兒發(fā)育大腦發(fā)生HI后，大量的未成熟神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺氧高度敏感，大面積腦區(qū)的神經(jīng)元會(huì)死亡，患兒急性死亡或者多種慢性終身疾病風(fēng)險(xiǎn)顯著提高，例如視力障礙、學(xué)習(xí)障礙、癲癇、智力低下、失明或者腦癱等并發(fā)癥。因此，探討HIE發(fā)病的分子機(jī)制，從分子機(jī)制角度探討臨床上安全有效的治療方案是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外治療HIE的熱點(diǎn)。

缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是機(jī)體面臨HI時(shí)的重要應(yīng)激信號(hào)。1992年，SEMENZA[3]首次證明HIF-1是與低氧反應(yīng)因子(hypoxia response element，HRE)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，增加了促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)的表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)的受HIF-1調(diào)控的基因約70余種，例如EPO、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitrogen oxide synthase，iNOS)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(glucose transporter 1，GLUT-1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-2(insulin like growth factor-2，IGF-2)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等，主要涉及紅細(xì)胞生成、血管發(fā)生、能量代謝、細(xì)胞凋亡和增殖等多個(gè)HIE相關(guān)過(guò)程[4]。因此，HIF-1及其相關(guān)通路參與哺乳動(dòng)物缺氧性特異應(yīng)答的基因表達(dá)調(diào)控，使機(jī)體對(duì)HI產(chǎn)生適應(yīng)反應(yīng)，在HIE的發(fā)病和進(jìn)展發(fā)揮重要作用。目前臨床上治療HIE的方法較多，在常規(guī)的對(duì)癥支持治療基礎(chǔ)上會(huì)結(jié)合活性氧自由基清除劑、凋亡抑制類(lèi)藥物、iNOS抑制類(lèi)藥物、鈣通道阻滯劑、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦細(xì)胞代謝激活劑或者亞低溫及高壓氧等方案[5]。本文介紹HIF-1α及其相關(guān)信號(hào)通路在HIE中的分子機(jī)制，并對(duì)可能的臨床治療策略進(jìn)行探討。

1 HIF-1通路的分子基礎(chǔ)和活性調(diào)控

HIF家族主要存在三種形式，包括HIF-1、HIF-2和HIF-3。該家族蛋白行使功能時(shí)需要2個(gè)亞基,包括具有活性功能的HIF-α亞型(包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)和組成表達(dá)的β亞基(HIF-1β)。HIF-1活性形式以HIF-1α和HIF-1β異二聚體蛋白復(fù)合物存在，屬于bHLH-PAS類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1α相對(duì)分子質(zhì)量為120 000，其表達(dá)隨著細(xì)胞氧氣濃度的降低而增加，在所有類(lèi)型組織均有表達(dá)。HIF-1β相對(duì)分子質(zhì)量為90 000,表達(dá)水平不受氧分子濃度調(diào)控，在常氧和缺氧條件下均在細(xì)胞核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。目前認(rèn)為HIF-1β的作用主要維持HIF-l異二聚體的穩(wěn)定性以及活性構(gòu)象轉(zhuǎn)變等結(jié)構(gòu)性功能。HIF-2α或稱(chēng)HRF/EPAS-1/HLF，是在克隆HIF-1α亞基的同源物時(shí)發(fā)現(xiàn)[6]。研究[7]表明，與HIF-1α的泛表達(dá)模式不同，HIF-2α主要局限在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和血管母細(xì)胞瘤中表達(dá)，HIF-3α的研究則相對(duì)有限。

HIF-1α的活性調(diào)控主要包括三個(gè)層次，即mRNA水平、蛋白質(zhì)水平以及高級(jí)結(jié)構(gòu)(二聚化)水平[8]。蛋白質(zhì)的水平調(diào)控主要通過(guò)HIF-1α蛋白的羥化、乙?；?、磷酸化等三種蛋白修飾方式完成[9]。在常氧條件下，脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylases，PHD)羥化HIF-1α的氧依賴(lài)性降解結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)脯氨酸，腫瘤抑制蛋白pVHL識(shí)別并結(jié)合羥基化的脯氨酸殘基，募集elongin C和elongin B等泛素蛋白形成泛素連接蛋白酶復(fù)合體，啟動(dòng)多泛素化降解途徑。除HIF-1α外，氧氣還通過(guò)天冬酰胺基羥化酶HIF-1抑制因子(factor inhibiting HIF-1，F(xiàn)IH)修飾HIF-1α的C端結(jié)構(gòu)，抑制其轉(zhuǎn)錄活性[10-11]。缺氧條件下，因PHD 和FIH均失活，導(dǎo)致HIF-1α的泛素化降解抑制和轉(zhuǎn)錄抑制均被解除，HIF-1α穩(wěn)定并在細(xì)胞內(nèi)積累，由核定位信號(hào)介導(dǎo)入核并與HIF-1β結(jié)合成具有活性的完整HIF-1復(fù)合物，識(shí)別缺氧反應(yīng)性DNA元件，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄共因子p300誘導(dǎo)低氧靶基因的轉(zhuǎn)錄。部分研究利用2-氧戊二酸類(lèi)似物、重金屬和鐵螯合劑等，抑制PHD和FIH活性，提高HIF-1α的穩(wěn)定性(或假性低氧)，從而模仿缺氧情況下的生物反應(yīng)。

2 HIF-1參與HIE的靶基因

缺氧條件下，HIF-1α易位至核后形成HIF異二聚體，結(jié)合至靶基因上游的HRE中的核心共有序列5′-(A/G)CGTG-3′。此外，靶基因的啟動(dòng)子還具有HIF輔助序列(HIF ancillary sequence，HAS)，序列為HRE的反向重復(fù)，即(5′-CAGGT-3′)。KIMURA等[12]通過(guò)定點(diǎn)誘變和熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，HAS序列缺失或者改變后VEGF和EPO報(bào)告基因的表達(dá)受阻。除缺氧外，還有許多非缺氧刺激能夠上調(diào)該轉(zhuǎn)錄因子，包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、自由基和激素等。目前發(fā)現(xiàn)約有70多種HIF的直接靶基因參與正常生理和疾病過(guò)程。按功能主要包括血管生成和氧氣供應(yīng)、細(xì)胞干性和自我更新、細(xì)胞增殖、上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、轉(zhuǎn)移和侵襲、氧化還原穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞凋亡(見(jiàn)表1)。本文重點(diǎn)探討EPO、VEGF、COX-2、GLUT-1與糖酵解酶類(lèi)等與HIE相關(guān)的靶基因。

表1 HIF的靶基因及參與生物過(guò)程

2.1 EPO EPO是發(fā)現(xiàn)的首個(gè)HIF靶基因，為一種激活紅細(xì)胞生成的激素類(lèi)糖蛋白[13]。缺氧情況下EPO的表達(dá)水平提高是形成紅細(xì)胞所必要條件，是在缺氧情況下機(jī)體提高輸氧能力的一種反應(yīng)[14-15]。EPO最初認(rèn)為是參與紅系祖細(xì)胞的成熟和增殖的關(guān)鍵基因，而后來(lái)的免疫組織化學(xué)研究表明，EPO廣泛存在于哺乳動(dòng)物的腦細(xì)胞中，而EPO受體也在包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等大多數(shù)腦細(xì)胞中廣泛表達(dá)[16]。KAWAKAMI等[17]發(fā)現(xiàn)，缺氧情況下HIF-1α能抑制谷氨酸等興奮性氨基酸的釋放，從而發(fā)揮腦保護(hù)的作用。KAWAKAMI等[17]以體外培養(yǎng)的小腦神經(jīng)元顆粒作為谷氨酸釋放源，加入EPO后谷氨酸釋放受到抑制且神經(jīng)元數(shù)目提高。KELLER等[18]在新生大鼠缺血缺氧模型中發(fā)現(xiàn)，EPO能抑制NMDA受體從而實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用。EPO促進(jìn)血紅蛋白合成,是血液系統(tǒng)在缺氧時(shí)的重要代償機(jī)制。但EPO的過(guò)量生成則會(huì)導(dǎo)致血小板黏附聚集增多，血容量和血液黏度提高，對(duì)HIE的恢復(fù)具有負(fù)面作用[15]。

2.2 VEGF 血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及由不同細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)的多種基因產(chǎn)物。腦缺血后，HIF-1α可以激活VEGF，VEGFR-1和PAI-1等血管生成相關(guān)基因,驅(qū)動(dòng)生理和病理性血管生成，進(jìn)而改善腦缺血狀態(tài)[19]。MATSUDA等[20]在大鼠腦缺血模型的大腦表面轉(zhuǎn)染HIF-1α DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α和VEGF表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，同時(shí)側(cè)支循環(huán)數(shù)量顯著增加，表明HIF-1α顯著增加新生血管生成。缺氧程度對(duì)于VEGF的功能影響較大。當(dāng)缺氧程度為輕度或者中度時(shí)，HIF-1結(jié)合在VEGF的增強(qiáng)子區(qū)域的HRE序列增強(qiáng)VEGF表達(dá)，增強(qiáng)低氧區(qū)域周?chē)?xì)胞的存活率[21-22]。當(dāng)缺氧非常嚴(yán)重且持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，過(guò)量的VEGF則直接導(dǎo)致血管重塑，血腦屏障的通透性增加，引發(fā)和加重HIE引起的腦水腫等[23]。

2.3 iNOS和環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2) iNOS和COX-2在HIE中通過(guò)通過(guò)炎癥誘導(dǎo)導(dǎo)致腦損傷，均是HIF-1靶基因[24-25]。已證明COX-2的表達(dá)水平降低與新生兒腦損傷的減輕程度相關(guān)，而COX-2和iNOS的表達(dá)水平提高則伴隨HIE后神經(jīng)元的丟失[26]。COX-2抑制劑能改善新生兒腦損傷程度的減輕和神經(jīng)行為等預(yù)后的，并且效能持續(xù)性較強(qiáng)，表明可能實(shí)現(xiàn)了對(duì)神經(jīng)血管單位的有效保護(hù)。缺氧時(shí)，HIF-1參與內(nèi)皮細(xì)胞中COX-2的上調(diào)，從而催化類(lèi)花生酸的產(chǎn)生。在成年大腦中發(fā)生局灶性腦缺血后，HIF-1介導(dǎo)的iNOS明顯上調(diào)。但是，關(guān)于iNOS參與新生兒HII后神經(jīng)炎癥的研究卻存在明顯爭(zhēng)議。iNOS的主要細(xì)胞來(lái)源是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，它們都在新生兒HIE后被激活。報(bào)道發(fā)現(xiàn)缺氧缺血后P12大鼠僅iNOS的少量表達(dá)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在缺氧缺血后iNOS的表達(dá)沒(méi)有改變，或者在缺氧后在P0和P7年齡小鼠中iNOS mRNA的顯著下降[27]。

2.4 GLUT-1及糖酵解酶類(lèi) 編碼幾乎所有糖酵解酶的基因都直接被HIF上調(diào)[28]。研究[29]表明，低氧預(yù)處理能顯著增高新生大鼠的HIF-1α水平，同時(shí)GLUT-1以及多種糖酵解酶類(lèi)的活性提高，從而保證腦組織能量充分以減輕腦損傷。PAPANDREOU等[30]發(fā)現(xiàn)，在缺血缺氧情況下，HIF-1α能提高丙酮酸脫氫酶激酶-1的表達(dá)水平，同時(shí)抑制丙酮酸脫氫酶活性，緩解腦損傷。

3 HIF-1α與HIE中的細(xì)胞凋亡

HIF控制許多凋亡基因，包括Bcl-2、BNIP3、NIX(或BNIP3L)和NOXA。其中，已證明BNIP3通過(guò)不依賴(lài)caspase的細(xì)胞死亡機(jī)制促進(jìn)了發(fā)育中的皮質(zhì)中的細(xì)胞損傷[31-32]。盡管眾所周知，在新生兒大腦中，細(xì)胞凋亡的過(guò)程很大程度上依賴(lài)于caspase-3。針對(duì)兩種類(lèi)型的細(xì)胞凋亡是新生兒腦損傷的合理治療選擇。此外，對(duì)大鼠caspase 3/9啟動(dòng)子分析顯示了HIF-1結(jié)合元件[33]。

3.1 HIF-1參與細(xì)胞凋亡 新生兒HI期間和之后，神經(jīng)元細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡。HIF-1α參與缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要為兩種可能的途徑。首先，HIF-1α增加了腫瘤抑制蛋白p53的穩(wěn)定性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[34]。在皮質(zhì)神經(jīng)元中使用皰疹擴(kuò)增子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，表達(dá)能夠破壞缺氧依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄的顯性負(fù)性形式的HIF-1α，減少了因缺氧葡萄糖而導(dǎo)致的延遲性神經(jīng)元死亡。相反，耐缺氧的p53無(wú)效的原代培養(yǎng)物不受HIF-1α表達(dá)的保護(hù)[35]。此外，另一項(xiàng)體外研究[36]表明，在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α消除了p53的降解，抑制了p53的泛素化并阻止了p53的核輸出，從而導(dǎo)致了凋亡相關(guān)基因的表達(dá)增加。其次，HIF-1α的過(guò)表達(dá)還誘導(dǎo)BNIP3的表達(dá)增加，從而可以誘導(dǎo)新生大鼠腦細(xì)胞凋亡[31-32]。盡管HIF-1α可以增加p53和BNIP3的表達(dá)，但這些分子參與了兩個(gè)獨(dú)立的凋亡途徑。PEREIRA等[37]使用HeLa細(xì)胞進(jìn)行的體外研究結(jié)果表明，沒(méi)有HIF-1α的p53的過(guò)表達(dá)不能誘導(dǎo)BNIP3的轉(zhuǎn)錄，但是其機(jī)制尚不清楚。

3.2 HIF-1的抗細(xì)胞凋亡活性 HIF-1α也可能因?yàn)楦弑磉_(dá)而對(duì)缺氧誘導(dǎo)的凋亡具有更高的抵抗力[38]。在輕度低氧的大鼠模型中，大鼠腦中HIF-1α有明顯且持續(xù)的反應(yīng)，而未檢測(cè)到細(xì)胞凋亡。在急性缺氧體外模型中，與野生型細(xì)胞相比，具有HIF-1α蛋白組成型表達(dá)的細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗力更高?？沟蛲鲎饔玫脑敿?xì)機(jī)制尚不清楚。據(jù)推測(cè)，HIF-1α的持續(xù)表達(dá)通過(guò)在慢性低氧時(shí)增加EPO等抗凋亡因子的表達(dá)而具有抗凋亡作用，并在急性低氧時(shí)增加無(wú)氧代謝[33]。

由于HIF-1α參與促凋亡和抗凋亡過(guò)程，因此需要研究這兩種矛盾效應(yīng)之間的關(guān)系。新生兒腦細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)取決于缺氧的嚴(yán)重程度：在輕度缺氧條件下，p53水平較低，HIF-1α被HIF-1β磷酸化和二聚化，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活抗凋亡基因例如EPO的表達(dá)[34]。但是，更持續(xù)或更嚴(yán)重的缺氧條件會(huì)導(dǎo)致HIF-1α脫磷酸化并導(dǎo)致p53水平整體升高。這導(dǎo)致形成一種新的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，該復(fù)合體同時(shí)包含兩種與病理基因(如Bax)的反式激活有關(guān)的蛋白質(zhì)[39]。一項(xiàng)使用小鼠缺血模型的研究表明，腦缺血后HIF-1α激活有兩個(gè)階段[40]。第一階段發(fā)生在缺血后持續(xù)到24 h，并且與大多數(shù)促凋亡基因的上調(diào)相關(guān)；而在第二階段，HIF-1α激活從缺血后48 h至8 d，大部分是抗凋亡基因被誘導(dǎo)。

4 HIF-1α與壞死

細(xì)胞壞死是HIE后神經(jīng)元最早期的死亡途徑，在使用P7大鼠HI模型進(jìn)行的研究中，壞死性神經(jīng)元細(xì)胞的死亡主要集中在缺血核心，而凋亡性神經(jīng)元的細(xì)胞主要分布在缺血性損傷較輕的區(qū)域[41]。神經(jīng)元細(xì)胞是氧敏感細(xì)胞，這意味著細(xì)胞對(duì)缺氧有反應(yīng)，細(xì)胞質(zhì)游離鈣的增加是由于細(xì)胞外鈣的大量流入和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣的釋放共同引起的。鈣流入激活了與細(xì)胞壞死有關(guān)的幾種蛋白質(zhì)，例如鈣蛋白酶[42]。體外研究[43]表明，鈣蛋白酶的激活參與了調(diào)控HIF-1α的降解。這種降解是通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)鈣引起的，當(dāng)PHD活性被阻斷時(shí)，鈣蛋白酶途徑被激活。鈣蛋白酶介導(dǎo)的HIF-1α降解可能與了解鈣波動(dòng)引起的長(zhǎng)期和/或嚴(yán)重缺氧期間HIF-1α的低濃度有關(guān)。盡管鈣內(nèi)流激活鈣蛋白酶介導(dǎo)的HIF-1α降解，有研究表明在I型頸動(dòng)脈細(xì)胞中,缺氧期間細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加刺激了HIF-1α蛋白的翻譯[44]。也有學(xué)者[45]認(rèn)為HIF-1α的穩(wěn)定導(dǎo)致缺氧時(shí)細(xì)胞壞死。但是，這些作用可能僅限于腫瘤細(xì)胞，而在神經(jīng)元中，HIF-1α的穩(wěn)定可能導(dǎo)致存活[46]。盡管如此，HIF-1α與壞死之間的關(guān)系仍未完全闡明。

5 展望

HIF-1能通過(guò)調(diào)控多種靶基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)對(duì)于多個(gè)生命過(guò)程調(diào)控。HIF-1α在腦發(fā)育和缺氧缺血性腦損傷中起重要作用，并且該分子同時(shí)具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性特性[22]。HIF-1α表達(dá)的調(diào)節(jié)涉及多種因素。盡管最近對(duì)新生腦損傷中對(duì)HI應(yīng)答的分子機(jī)制的理解有了迅速的發(fā)展，但有關(guān)HIF-1α的許多問(wèn)題仍有待回答。

在神經(jīng)元細(xì)胞死亡或存活期間，HIF-1α表達(dá)的調(diào)節(jié)和HIF-1α的獨(dú)特作用尚不完全清楚，尤其是條件決定細(xì)胞死亡或存活的問(wèn)題。缺氧后HIF-1α是誘導(dǎo)促凋亡還是抗凋亡的決定可能取決于HI的持續(xù)時(shí)間，病理刺激的類(lèi)型和涉及的腦細(xì)胞類(lèi)型等[34]。

基于對(duì)HIF-1α信號(hào)通路的理解，我們可以探尋治療HIE的新途徑。首先，可以用PHD抑制劑調(diào)節(jié)HIF-1α的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)性靶基因(如EPO和VEGF)的表達(dá)[47]。其次，也可以通過(guò)抑制HIF-1α的去磷酸化或用抗氧化劑下調(diào)其表達(dá),例如p53和BNIP3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被阻斷[48]。第三，可以通過(guò)預(yù)處理提高HIF-1α的穩(wěn)定性，是預(yù)防HIE另一個(gè)重要方向。從治療的角度看，應(yīng)更加關(guān)注在新生兒HIE發(fā)生前未接受產(chǎn)前低氧預(yù)適應(yīng)的窒息新生兒。HIF-1α的大多數(shù)特性?xún)H通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，需要通過(guò)轉(zhuǎn)化性研究進(jìn)一步驗(yàn)證方案可行性[49]。