趙 昱，吳 軍，安 揚，常 青

嗎啡鎮(zhèn)痛耐受是指嗎啡的鎮(zhèn)痛效能進行性降低，只有不斷加大使用劑量才能維持同等鎮(zhèn)痛效果，其嚴重限制了嗎啡在臨床重度疼痛治療中的應用。相關研究[1]證實，脊髓內小膠質細胞激活導致的神經(jīng)炎性反應在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的形成中發(fā)揮重要作用。集落刺激因子1(colony-stimulating factor 1,CSF1)是一種對單核細胞的增殖、分化及維持活性發(fā)揮重要作用的細胞因子。研究[2]表明，使用CSF1受體(CSF1R)拮抗劑可以阻斷小膠質細胞的激活。神經(jīng)病理性疼痛的研究[3]發(fā)現(xiàn)，感覺神經(jīng)元中CSF1缺失可以完全阻斷神經(jīng)損傷誘導的機械性痛覺過敏，并抑制小膠質細胞活化和增殖，相反，鞘內注射CSF1可以誘發(fā)機械性痛覺過敏和小膠質細胞增殖。但在嗎啡耐受機制研究中對CSF1的研究仍較少，鑒于嗎啡鎮(zhèn)痛耐受和神經(jīng)病理性疼痛有著許多相同的神經(jīng)生物學機制，推測脊髓CSF1可能參與嗎啡耐受過程。因此，本文通過鞘內連續(xù)注射嗎啡建立嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的在體模型[4]，旨在探討嗎啡鎮(zhèn)痛耐受形成過程中大鼠脊髓CSF1的表達變化，以及CSF1R拮抗劑是否能夠抑制嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的形成，以期為闡明脊髓CSF1在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中的作用提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠，體質量(220±10)g，購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心。屏蔽系統(tǒng)環(huán)境：光照周期12 h，光照時間8:00-20:00，溫度(23±1)℃，所有操作和動物處理遵循國家衛(wèi)生機構制定的實驗室動物指南。

1.1.2 藥物與試劑 鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠，生產(chǎn)批號：120909)；CSF1R拮抗劑PLX3397(Selleck公司，美國)和IBA-1兔多克隆抗體(1∶400,Wako，日本)；熒光素標記羊抗兔二抗(1∶1 000，Millipore，美國)；CSF1小鼠單克隆抗體(1∶1 000，Millipore，美國)；β-Tubulin兔多克隆抗體(1∶1 000，Abcam，英國)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠鞘內置管術 腹腔注射苯巴比妥鈉(35～45 mg/kg)麻醉大鼠。以髂嵴連線確定第5腰椎間隙。切開L5背部皮膚，分離椎旁肌，鉗去L6腰椎部分脊突，暴露出第5腰椎間隙。用8號針頭傾斜60°角插入椎間隙。大鼠尾部或后肢突然抽動表明針頭進入蛛網(wǎng)膜下腔。退出針頭，將事先充滿0.9%氯化鈉溶液的microspinal導管插入第5椎間隙，管腔中有清亮液體反流表明導管進入蛛網(wǎng)膜下腔。將導管朝頭端方向插入2～2.5 cm，使導管末端位于脊髓腰骶部。封閉導管外口并把皮膚外的導管固定于腰部的皮膚。以4-0手術線分層縫合肌肉與皮膚。大鼠術后至少恢復4 d 后開始實驗。術后出現(xiàn)后肢或尾部癱瘓、運動功能障礙的動物從實驗中排除并立即注射過量苯巴比妥鈉注射致死。實驗結束取材時觀察導管位置，確定導管末端位置。位置不正確的大鼠行為學數(shù)據(jù)從該組中排除。

1.2.2 分組與給藥 成功鞘內置管SD大鼠60只，按隨機數(shù)字表法分為0.9%氯化鈉溶液組(NS組)、嗎啡組(MOR組)、CSF1R抑制劑組(PLX3397組)、CSF1R抑制劑+嗎啡組(PLX3397+MOR組)，各15只。其中NS組連續(xù)7 d鞘內及灌胃給予等容積0.9%氯化鈉溶液；MOR組連續(xù)7 d鞘內給予15 μg嗎啡(20 μL)；PLX3397組連續(xù)7 d鞘內給予等容積0.9%氯化鈉溶液，灌胃給予CSF1R抑制劑PLX3397(290 mg/kg)；PLX3397+MOR組連續(xù)7 d鞘內給予15 μg嗎啡(20 μL)，并灌胃給予CSF1R抑制劑PLX3397(290 mg/kg)[5]。分別于鞘內注射1、3、5、7 d進行大鼠疼痛行為學測量，并于注射嗎啡7 d后斷頭處死大鼠，Western blotting法測定腰段脊髓CSF1表達，免疫熒光染色法檢測腰段脊髓小膠質細胞活化情況。

1.2.3 疼痛行為學測試 (1)甩尾潛伏期法(tail flick latency,TFL)：于給藥30 min后，用熱水(50±0.2)℃甩尾法測定甩尾閾值。待大鼠尾巴迅速甩離水面時用秒表記錄從大鼠尾部入水到開始甩尾的時間，此時間為大鼠熱水甩尾潛伏期(s)。大鼠尾部在熱水中停留最長時間為15 s(cut-off time)，以免對尾部造成損傷。給藥前為基礎甩尾潛伏期(basal tail flick latency，BL)，給藥后為實驗甩尾潛伏期(test tail flick latency，TL)。按照上述方法連續(xù)測定3次，每次間隔2 min。將3次潛伏期的平均值作為痛閾值?；A閾值3～5 s，閾值超過5 s的動物從實驗中排除。(2)機械縮足反射閾值法(mechanical withdrawal threshold,MWT)：用von Frey纖維絲以up-down法推算50%機械縮足反射閾值。將一有機玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)置于金屬篩網(wǎng)上，待大鼠在有機玻璃箱中適應15 min后，用von Frey纖維絲垂直刺激大鼠后肢足底中部，持續(xù)時間≤4 s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應，否則為陰性反應。測定首先從2 g開始，當該力度的刺激不能引起陽性反應，則給予相鄰大一級力度的刺激；如出現(xiàn)陽性反應則給予相鄰小一級力度的刺激，如此連續(xù)進行，直至出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應的騎跨，再連續(xù)測定4次。最大力度為15 g，大于此值時記為15 g。每次刺激間隔30 s。給藥前為基礎縮足反射閾值(BL)，給藥后為實驗縮足反射閾值(TL)。每次給藥前及給藥后30 min分別測定閾值，將所得的BL、TL帶入公式%MPE=(TL-BL)/(cut-off time-BL)×100%。以%MPETFL和%MPEMWT作為行為學結果。

1.2.4 Western blotting法檢測脊髓CSF1表達 戊巴比妥鈉腹腔注射深麻醉后斷頭處死大鼠(n=4)，迅速分離腰段脊髓(L4～L6節(jié)段)組織，液氮速凍后-80 ℃深低溫冰箱保存。提取蛋白時，將組織放入2 mL勻漿器中，按1 mL/100 mg比例加入預冷的蛋白提取液(KeyGEN全蛋白提取試劑盒)，充分勻漿后冰上裂解15 min，轉移至潔凈EP管后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液即為蛋白提取液。用BCA蛋白質測定試劑盒(Peirece，美國)進行蛋白定量。配制12% SDS-PAGE凝膠，每個泳道上樣量均為100 μg，120 V恒壓電泳70 min，待溴酚藍染料到達凝膠底部時停止電泳。80 V恒壓濕法轉膜80 min，將凝膠上的蛋白轉移至0.45 μm孔徑PVDF膜上，轉膜后使用封閉液室溫封閉1 h，一抗(CSF1小鼠單克隆抗體1∶1 000，β-Tubulin兔多克隆抗體1∶1 000)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記種屬特異性二抗(山羊抗小鼠及山羊抗兔抗體1∶5 000)室溫搖床孵育1 h，使用ECL化學發(fā)光液于熒光和可見光凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech)顯影并進行條帶灰度分析，通過計算目的蛋白條帶灰度值與內參照蛋白條帶灰度值的比值，半定量分析目的蛋白表達情況。

1.2.5 免疫熒光染色法檢測脊髓小膠質細胞激活 疼痛行為學測定結束后，戊巴比妥鈉腹腔注射深麻醉后斷頭處死大鼠(n=3)。用預冷的0.9%氯化鈉溶液100 mL和4%多聚甲醛400 mL經(jīng)左心室灌注固定。將腰段脊髓(L4～L6)即腰膨大取出，4%多聚甲醛后固定2 h后置入蔗糖溶液梯度脫水。冰凍切片機(LEICA)切片(片厚12 μm)。IBA-1兔多克隆抗體(1∶400)4 °C 孵育過夜，熒光素標記羊抗兔二抗(1∶1 000)37 °C避光孵育1 h，各步驟間用PBS沖洗3次，5分鐘/次，50%甘油封片后熒光顯微鏡拍片，并用Image pro-Plus 6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 CSF1R拮抗劑對嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的影響 MOR組和MOR+PLX3397組在嗎啡注射1 d時均產(chǎn)生最大鎮(zhèn)痛作用(P<0.05)，2組%MPETFL和%MPEMWT差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。注射嗎啡3 d時MOR組大鼠開始出現(xiàn)鎮(zhèn)痛耐受，至7 d時形成明顯耐受，MOR組%MPE進行性降低(P<0.05)。MOR+PLX3397組大鼠接受嗎啡注射后3、5、7 d時，與MOR組%MPE差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PLX3397組與NS組各時點%MPE差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 4組大鼠鞘內注射給藥后不同時點%MPETFL和%MPEMWT比較

2.2 CSF1R拮抗劑對脊髓小膠質細胞激活的影響 注射嗎啡7 d后，MOR組小膠質細胞標志物IBA-1在大鼠腰段脊髓背角表達較NS組增加(P<0.05)，MOR+PLX3397組大鼠IBA-1表達較MOR組減少(P<0.05)，NS組與PLX3397組大鼠腰段脊髓背角IBA-1表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 4組大鼠IBA-1陽性細胞比較

2.3 CSF1R拮抗劑對脊髓CSF1表達的影響 注射嗎啡7 d后，MOR組和MOR+PLX3397組大鼠腰段脊髓CSF1表達均較NS組增加(P<0.05)，MOR組和MOR+PLX3397組CSF1表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，NS組與PLX3397組CSF1表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表3)。

表3 4組大鼠脊髓CSF1蛋白表達比較

3 討論

本實驗結果證實，慢性嗎啡處理能激活大鼠脊髓CSF1的表達，而給予CSF1R拮抗劑，不僅可以明顯抑制嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的形成，還可以抑制脊髓背角小膠質細胞的激活。提示脊髓CSF1參與嗎啡鎮(zhèn)痛耐受形成。

嗎啡等阿片類藥物用于治療疼痛已有數(shù)千年歷史。嗎啡耐受是慢性嗎啡誘導的一種適應性過程，表現(xiàn)為μ阿片受體在分子水平以及突觸和細胞水平上的復雜變化?，F(xiàn)已證實，嗎啡可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎性反應[6]，這與嗎啡鎮(zhèn)痛的抑制以及嗎啡誘導的耐受性、依賴性和藥物濫用直接相關[7]。有研究[8]表明，激活的小膠質細胞和星型膠質細胞在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中發(fā)揮重要作用，而抑制膠質細胞激活可以降低嗎啡耐受發(fā)生。

有研究[9]發(fā)現(xiàn)，阻斷CSF-1R信號通路可以有效減輕坐骨神經(jīng)部分結扎引起的神經(jīng)病理性疼痛，并能夠抑制脊髓內小膠質細胞激活。CSF-1R是一種受體酪氨酸激酶，在巨噬細胞、破骨細胞、朗格漢斯細胞、非造血細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質細胞上均有表達，CSF-1R具有兩種同源配體，即CSF-1和IL-34，它們在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達區(qū)域呈現(xiàn)出不重疊性，調節(jié)小膠質細胞增殖和存活。CSF-1R的表達隨腦發(fā)育而顯著下降，而IL-34和CSF-1的表達則維持在較高水平。CSF-1又稱巨噬細胞集落刺激因子，是調控組織巨噬細胞和破骨細胞的主要生長因子。小膠質細胞是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞，是免疫防御的第一道防線，在炎癥反應中被激活。本研究選用的PLX3397是一種口服有效的CSF1R抑制劑，具有高度選擇性及能透過血腦屏障的特點，可用于特異性的小膠質細胞的消除[5]。

鑒于嗎啡鎮(zhèn)痛耐受和神經(jīng)病理性疼痛有著許多相同的神經(jīng)生物學機制，本研究發(fā)現(xiàn)，慢性嗎啡處理可以上調脊髓內CSF1表達，以及激活脊髓背角小膠質細胞，而CSF1R抑制劑PLX3397可以抑制嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的形成，及抑制脊髓背角小膠質細胞的激活，這些結果表明CSF1可能介導了嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的形成。在神經(jīng)病理性痛模型中，脊髓CSF1來源于受損感覺神經(jīng)元分泌已有報道[3]，但在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受模型中，導致脊髓內CSF1表達增加的細胞來源還有待實驗進一步證實。

綜上所述，CSF1介導了嗎啡耐受的形成。本文為深入闡明嗎啡耐受機制提供了新的實驗資料，為防治嗎啡耐受提供了新的研究方向。