孫中石 范艷蕊 呂愛軍 胡秀彩 石洪玥 陳麗梅 孫敬鋒

摘要：【目的】研究錦鯉（Cyprinus carpio var. koi）腸道的菌群組成結(jié)構(gòu)及多樣性，為深入研究錦鯉腸道菌群的功能及腸道不同部位的生理功能的分化提供參考。【方法】收集錦鯉前腸、中腸和后腸的腸道細菌，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)，采用細菌微量生化鑒定管對腸道細菌進行各項生理生化指標的測定;分別提取3個腸段的腸道菌群基因組DNA，進一步采用16S rDNA高通量測序技術(shù)，分析3個腸段的菌群組成和生物多樣性?！窘Y(jié)果】前腸、中腸和后腸樣本測序后分別得到48659、47013和47819條有效序列，按97%相似性水平劃分OTU后，分別得到1555、1294和1423個OUTs。α多樣性分析結(jié)果顯示，后腸菌群樣本的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)最高。在門水平上，前腸、中腸和后腸豐度最高的5個菌門均是變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和黏膠球形菌門（Lentisphaerae），推測這些菌門是錦鯉腸道的核心細菌類群，但各菌門在不同部位的相對豐度有差異。構(gòu)建的物種豐度熱圖顯示相對豐度最高的前10類菌屬相同，但某些菌屬在腸道不同部位的相對豐度有較大差異，如代爾夫特菌屬（Delft）、弓形菌屬（Toxoplasma）。UniFrac分析顯示中腸和后腸的腸道菌群聚為一支，表明這2個部位菌群組成結(jié)構(gòu)相似度較高?！窘Y(jié)論】錦鯉腸道不同部位具有獨特的菌群結(jié)構(gòu)，可能會影響腸道不同部位功能的分化。

關(guān)鍵詞： 錦鯉;腸道菌群;多樣性;16S rDNA

中圖分類號： S917.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）02-0483-08

Abstract：【Objective】This study aimed to investigate the diversity and community of microflora from the three intestinal segments（foregut，midgut，and hindgut） of koi carp（Cyprinus carpio var. koi） and provide reference for further research on the function of koi carpintestinal flora and the differentiation of physiological functions in different parts of the intestine. 【Method】Microflora from the three intestinal segments， foregut，midgut，and hindgut， were collected， and? the physiological and biochemical indexes of intestinal bacteria through the bacterial microbiochemical identification tube were identified based on the traditional bacterial culture technique. Genomic DNA of intestinal microflora from the three intestinal segments was extracted，and 16S rDNA high-throughput sequencing technology was used to analyze the microflora composition and diversity. 【Result】The three microflora samples from the three intestinal segments（foregut，midgut，and hindgut） were sequenced to obtain 48659，47013，47819 effective tags， respectively. After dividing the OTUs based on 97% sequence similarity level，1555，1294， and 1423 OUTs were obtained， respectively. Alpha diversity analysis showed that the Shannon and Chao1 indexes of the hindgut flora samples were the highest. At the phylum level， the top five phyla with the highest abundance in the foregut，midgut，and hindgut were all Proteobacteria，F(xiàn)usobacteria，Bacteroidetes，F(xiàn)irmicutes and Lentisphaerae，which could be probably recognized as the core bacterial taxa in the koi carpintestine， but the relative abundance of each phylum was different in different parts. The species abundance heat map constructed showed that the top ten species with the highest relative abundance were the same， but the relative abundance of some species in different parts of the intestine was quite different， such as Delft and Toxoplasma. The UniFrac cluster heat map analysis showed that the intestinal flora of the midgut and hindgut were clustered into one group， indicating that the composition of the flora of these two parts was highly similar in structure. 【Conclusion】Unique microflora structures are formed in different parts of the koi carp intestinal tract， and may affect the functional differentiation of different parts of the intestinal tract.

Key words： koi carp（Cyprinus carpio var. koi）; intestinal microflora; diversity; 16S rDNA

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31972840）; Tianjin Natural Science Foundation （19JCZDJC34600）; Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Program of Tianjin（202010061061）

0 引言

【研究意義】腸道是動物消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，同時也參與機體的免疫防御過程。魚類腸道是一個十分復雜的生態(tài)系統(tǒng)，腸道內(nèi)生存著大量的微生物，其功能包括抵抗細菌感染、分解營養(yǎng)物質(zhì)以及為宿主提供酶、氨基酸和維生素等生命活動所必需物質(zhì)（Sugita et al.，1997）。因此，魚類腸道微生物與機體健康及生理狀況有著密切的關(guān)系（Ganguly and Prasad，2012）。腸道微生物組成結(jié)構(gòu)的變化能夠引起宿主生理狀態(tài)及免疫機能的改變，其微生態(tài)系統(tǒng)紊亂會增加宿主的患病風險（Nayak，2010;Brown et al.，2012），許多研究者使用益生菌來維持或改善魚類腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)，增強機體抗病力及抗應激能力（Verschuere et al.，2000）。因此，研究魚類腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)和多樣性是了解其與機體生理功能間相互關(guān)系的重要基礎?！厩叭搜芯窟M展】動物腸道微生物的研究方法總體上經(jīng)歷了3個階段，分別是依賴于人工培養(yǎng)的生理生化鑒定方法、傳統(tǒng)分子生物學方法及基于高通量測序的宏基因組學方法（許文濤等，2009）。依賴于細菌人工培養(yǎng)的生理生化鑒定方法成本低廉，但在培養(yǎng)過程中存在菌種比例發(fā)生變化、很多細菌無法培養(yǎng)等缺陷，這些因素導致無法準確了解腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)特征。傳統(tǒng)分子生物學方法主要有實時定量PCR（qPCR）和變性梯度凝膠電泳（DGGE）。應用qPCR方法每次只能鑒定一類微生物，存在通量低的缺陷;DGGE方法因受限于其較低的靈敏度，只能應用于腸道中較高豐度微生物的鑒定（李東萍等，2015）?；?6S rDNA高通量測序的細菌鑒定方法將16S rDNA在菌種鑒定方面的優(yōu)勢與高通量測序技術(shù)的特點相結(jié)合，實現(xiàn)了對腸道微生物的快速準確鑒定和定量（李東萍等，2015）。目前一些魚類腸道的菌群組成及多樣性已被報道，如羅非魚（Oreochromis mossambicus）（Giatsis et al.，2015）、黑頭軟口鰷（Pimephales promelas）（Narrowe et al.，2015）、錦鯉（Cyprinus carpio var. koi）（Han et al.，2018）。然而，高等動物腸道不同部位通常承擔不同的生理功能。在小鼠、豬和雞等高等動物中（Gu et al.，2013;Looft et al.，2014;Choi et al.，2015）已報道了不同腸段中微生物群組成及多樣性的差異。在魚類低等脊椎動物的研究中也證明腸道不同部位各種消化酶、水解酶、氧化酶等具有差異分布，揭示了魚類腸道不同部位在消化吸收、免疫防御功能上的分化（Wang et al.，2017）?！颈狙芯壳腥朦c】目前在魚類腸道菌群的研究中，通常將整個腸道的菌群進行鑒定分析，尚未見涉及腸道不同部位的菌群結(jié)構(gòu)差異，而研究魚類不同腸段微生物組成及多樣性，能夠更深入地了解魚類腸道菌群的功能和作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】錦鯉（Cyprinus carpio var. koi）是主要養(yǎng)殖觀賞魚種類之一，具有較高的觀賞價值。本研究利用16S rDNA高通量測序技術(shù)，研究錦鯉腸道3個腸段（前腸、中腸和后腸）的菌群組成及多樣性，分析其菌群組成結(jié)構(gòu)的差異，并應用基于傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的生理生化試驗方法對3個腸段的細菌進行鑒定，以期為深入研究錦鯉腸道菌群的功能及腸道不同部位的生理功能分化提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗所用健康錦鯉購自天津功旺錦鯉養(yǎng)殖基地，平均體長為32.60±1.66 cm，平均體重為398.90±19.71 g。錦鯉在實驗室暫養(yǎng)7 d后用于試驗，養(yǎng)殖期間水溫控制在20 ℃左右，連續(xù)曝氣充氧，每日飼喂2次魚體重1%的普通商業(yè)飼料。

1. 2 腸道菌群樣品制備

取5尾錦鯉進行麻醉，以70%的酒精棉球擦拭魚體表，并用無菌手術(shù)剪將腸道從腹腔中分離，按照解剖學特征將其分為3段，分別是前腸、中腸和后腸（Wallace et al.，2005）。將3個腸段的內(nèi)容物分別擠出后收集，然后剖開腸道，刮取腸粘膜。將5尾魚3段腸道分離出的內(nèi)容物及腸黏膜分別放入3個50 mL離心管，混勻，-80 ℃保存?zhèn)溆?。前、中、?段腸道的菌群樣本分別命名為QC、ZC、HC。

1. 3 基于培養(yǎng)技術(shù)的生理生化方法鑒定腸道細菌

1. 3. 1 細菌培養(yǎng) 從前腸、中腸和后腸的腸道樣本中各取0.1 g用于腸道細菌培養(yǎng)。用無菌生理鹽水對0.1 g樣品進行倍比稀釋，得到各梯度稀釋細菌懸液（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）。分別取100 ?L細菌懸液涂布于LB固體培養(yǎng)基，每個稀釋度涂布3個平板，隨后在28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)18 h。選取菌落清晰、分散良好且菌落數(shù)為30～100的培養(yǎng)平板進行菌落計數(shù)及形態(tài)觀察。在挑選的培養(yǎng)平板中，隨機選取前腸、中腸和后腸樣本的各50個菌落作為待測菌株，依次編號，進行增殖培養(yǎng)，純化后的菌液與15%甘油1∶1混合后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3. 2 生理生化試驗 生理生化試驗鑒定項目包括革蘭氏染色、細菌動力試驗、細菌氧化酶試驗、細菌氧化發(fā)酵試驗、細菌需鈉試驗等。參照《一般細菌常用鑒定方法》（中國科學院微生物研究所細菌分類組1978）和《伯杰氏細菌鑒定手冊 第9版》（英文版）（Garrity 2005）的方法，在屬水平上對各菌株進行分類鑒定。

1. 4 16S rDNA高通量測序方法鑒定腸道細菌

1. 4. 1 腸道菌群基因組DNA的提取 取剩余的前腸、中腸和后腸的腸道菌群樣品，參照Han等（2018）的方法進行腸道微生物基因組DNA提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行16S rDNA高通量測序。

1. 4. 2 16S rDNA高通量測序 設計針對細菌16S rDNA V3～V4區(qū)的引物進行PCR擴增，上游和下游引物：341F（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）;805R（5'-GACTG GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTA CHVGGGTATCTAATCC-3'）。PCR反應體系50.0 μL：10×PCR Buffer 5.0 μL、dNTP（10 mmol/L）0.5 μL、DNA 10 ng、Bar-PCR primer F（50 μmol/L）0.5 μL、Primer R（50 μmol/L）0.5 μL、Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL，加ddH2O補足至50.0 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min;5次循環(huán)（94 ℃ 30 s，45 ℃20 s，65 ℃ 30 s），20次循環(huán)（94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s）;72 ℃延伸5 min。用SanPrep柱式DNA凝膠提取試劑盒（Biotech，美國）純化PCR擴增產(chǎn)物。最后，利用Illumina MiSeq平臺對PCR產(chǎn)物進行測序。

1. 5 數(shù)據(jù)分析

采用Cutadapt、Pear、Prinseq軟件處理原始數(shù)據(jù)。首先去除引物接頭序列，將成對的核苷酸單鏈拼接成一條序列，然后按照標簽序列識別區(qū)分不同樣品，得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行質(zhì)控過濾，得到各樣本的有效數(shù)據(jù)。將得到的序列在97%的相似水平下聚類成操作分類單元（OTUs）。根據(jù)OTU分類計算樣本的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)。將得到的OTU序列利用BLASTn與對應數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選出OTU序列的最佳比對結(jié)果，將樣本中物種豐度前50以外的物種全部合并為other。將有效序列進行系譜分類，并在不同分類水平統(tǒng)計腸道菌群優(yōu)勢細菌類群及其相對豐度。最后，基于UniFrac分析通過各樣本基因序列間的進化信息比較樣本在特定的進化譜系中是否有顯著的微生物群落差異。

2 結(jié)果與分析

2. 1 基于培養(yǎng)技術(shù)的生理生化試驗鑒定結(jié)果

接種稀釋菌液培養(yǎng)18 h，根據(jù)出現(xiàn)的菌落數(shù)計算得出，前腸、中腸和后腸的細菌含量分別為8.28×106、2.91×106和2.68×106 CFU/g。通過生理生化試驗在屬水平上3個腸段的菌群共鑒定到9個類群，其中氣單胞菌屬（Aeromonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）和弧菌屬（Vibrio）在3段腸道中均為優(yōu)勢菌。前腸豐度最高的類群為腸桿菌屬（24%），中腸豐度最高的類群為氣單胞菌屬（58%），后腸豐度最高的類群為弧菌屬（52%）。除此之外，還檢測出不動桿菌屬（Acinetobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、棒桿菌屬（Corynebacterium）及葡萄球菌屬（Staphylococcus）（表1）。

2. 2 16S rDNA高通量測序分析

2. 2. 1 菌群OTU聚類及多樣性分析 由前腸、中腸和后腸的3個樣本分別得到48659、47013和47819條原始序列，經(jīng)過質(zhì)量控制、除去嵌合體與非靶區(qū)域序列后，得到的序列數(shù)目分別為47673、46465和47099（表2）。以97%相似性水平為標準劃分OTU，所有序列被分為3698個OTUs（圖1），其中，前腸、中腸和后腸樣品的OTU數(shù)分別是1555、1294和1423，所占比例分別為42.05%、34.99%和38.48%。α多樣性分析結(jié)果顯示，3個腸段菌群共有的OTUs為196個，占總數(shù)的5.30%。前腸、中腸和后腸菌群樣品的香農(nóng)指數(shù)分別為3.01、2.83和3.11（圖2），Chao1指數(shù)分別為10983.61、10881.23和12519.16（圖3）。

2. 2. 2 菌群組成結(jié)構(gòu)分析 在門分類水平上，前腸、中腸和后腸豐度最高的5個菌門依次是變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和黏膠球形菌門（Lentisphaerae）（圖4）。上述5個菌門在前腸中依次占其菌群總數(shù)的56.28%、21.07%、12.41%、7.28%和1.44%，在中腸依次占其菌群總數(shù)的45.77%、19.58%、20.91%、11.31%和1.85%，在后腸中依次占其菌群總數(shù)的40.25%、19.54%、22.45%、11.43%和4.84%（表3）。

在屬分類水平上，前腸、中腸和后腸豐度最高的前10個類群依次是氣單胞菌屬（Aeromonas）、鯨桿菌屬（Cetobacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、弧菌屬（Vibrio）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、沼桿菌屬（Paludibacter）、厭氧球形菌屬（Anaeroglobus）、Leeia、霍爾德曼氏菌屬（Holdemania）和寡球菌屬（Oligosphaera）（圖5）;豐度最高的前10個菌屬在前腸、中腸和后腸樣品中分別占菌群總數(shù)的84.23%、92.23%和89.28%（表4）。在不同腸段中還存在豐度差異的其他菌屬，如代爾夫特菌屬（Delftia）和弓形桿菌屬（Arcobacter）在前腸中的豐度較高，梭狀芽孢桿菌（Clostridium）在前腸中的豐度較低，Lawsonia在后腸中的豐度較高（圖6）。

2. 2. 3 相似性分析 通過UniFrac分析構(gòu)建聚類熱圖展現(xiàn)樣本間的距離關(guān)系。如圖7所示，中腸與后腸的腸道菌群聚為一支，表明二者菌群結(jié)構(gòu)相似度較高;前腸與中腸、后腸菌群結(jié)構(gòu)差異較大。

3 討論

動物腸道菌群的形成受生長環(huán)境、飼料營養(yǎng)成分及遺傳等因素的多重影響（Ley et al.，2006），菌群組成結(jié)構(gòu)是外界環(huán)境、宿主腸道內(nèi)環(huán)境和微生物之間選擇和共同進化的結(jié)果（Ley et al.，2008）。本研究中，α多樣性分析顯示錦鯉后腸的微生物多樣性最高，前腸次之，中腸最低。在不同的分類水平下，前腸、中腸和后腸大部分細菌類群的豐度存在差異。湯伏生等（1994）曾報道，普通鯉魚前腸細菌大部分靠吸收宿主營養(yǎng)而生存，中腸和后腸細菌主要靠吸收食物中的養(yǎng)分而生存，表明中腸和后腸細菌在營養(yǎng)獲取方式上與前腸細菌具有明顯區(qū)別。本研究中，錦鯉前腸與中腸和后腸的菌群組成結(jié)構(gòu)差異性較大，中腸與后腸的菌群組成結(jié)構(gòu)相似度更高。該現(xiàn)象可能與細菌營養(yǎng)獲取方式不同有關(guān)，另外，很多魚類前腸具有特異的解剖學特征（Wallace et al.，2005），這些特征使前腸的細菌譜系獲得不同的選擇壓力（Lan and Love，2012），從而形成了較為獨特的菌群結(jié)構(gòu)。

關(guān)于陸生哺乳動物腸道菌群的研究表明，擬桿菌門和厚壁菌門是最主要的優(yōu)勢細菌門類（Bowman and McCuaig，2003;Qin et al.，2010）。在本研究結(jié)果中，錦鯉腸道中豐度最高的是變形菌門，其次是梭桿菌門。據(jù)報道，變形菌門細菌種類在水環(huán)境及海底沉積物等環(huán)境中廣泛存在（Ley et al.，2008）。魚類腸道微生物易受到外界養(yǎng)殖環(huán)境的影響（Tsuchiya et al.，2008），可能是變形菌門成為錦鯉腸道優(yōu)勢菌群的重要原因。不僅在錦鯉腸道，黃顙魚、斑馬魚和草魚腸道中也普遍存在變形菌門細菌類群（Han et al.，2010;Wu et al.，2010;Roeselers et al.，2011）。Roeselers等（2011）報道不同養(yǎng)殖區(qū)的魚類腸道中梭桿菌門類群的豐度差別很大。據(jù)此推測，養(yǎng)殖環(huán)境中較高豐度的梭桿菌門是其在錦鯉腸道中廣泛分布的重要原因。

腸道細菌在協(xié)助腸道發(fā)揮正常的生理功能方面具有重要意義。鯨桿菌屬細菌具有發(fā)酵多肽碳水化合物的能力，還可以產(chǎn)生維生素B12（Tsuchiya et al.，2008）;氣單胞菌和弧菌產(chǎn)生的胞外酶對淀粉和蛋白質(zhì)的消化起促進作用（Asfie et al.，2000;劉慧玲等，2012）;擬桿菌屬菌株（包括A型和B型）有水解淀粉和幾丁質(zhì)的能力（Turnbaugh et al.，2006）。與后腸相比，這些菌屬在錦鯉前腸和中腸豐度較高，推測與上述2個腸段具有較強的蛋白質(zhì)和糖類的消化功能有關(guān)（Sun et al.，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)魚類常見的一些條件性致病菌，如假單胞菌屬和黃桿菌屬（Wu et al.，2012）具有較低的豐度，其中一個重要原因是腸道微生物中一些正常類群，如鯨桿菌屬和擬桿菌屬的細菌類群可以抑制病原菌生長繁殖（Sugita et al.，1996，2002），這些菌群在一定程度上保護宿主免受病原菌侵害，起到屏障作用。

據(jù)研究報道，由于培養(yǎng)基的營養(yǎng)和生長環(huán)境因素的限制，動物腸道微生物中只有一小部分能夠在人工培養(yǎng)基上生長（Amann et al.，1995）。本研究中，與16S rDNA高通量測序的鑒定結(jié)果相比，應用傳統(tǒng)生理生化試驗鑒定出的優(yōu)勢菌屬較少。另外，一些細菌適合在培養(yǎng)基上生長，其數(shù)量往往會被高估（Langendijk-Genevaux et al.，1995），導致培養(yǎng)過程中各類細菌的數(shù)量及所占比例發(fā)生變化，所以生理生化試驗鑒定出的各菌屬的豐度與16S rDNA高通量測序的鑒定結(jié)果并不一致。即使菌落計數(shù)能夠得到3個腸段的細菌濃度，但其無法準確地反映腸道不同部位微生物豐度的差異。

4 結(jié)論

外部環(huán)境可能是影響魚類腸道菌群的重要因素，這使腸道不同部位中豐度最高的幾類菌門相同，也表明養(yǎng)殖水環(huán)境中的微生物組成可能對魚類的生理狀態(tài)有重要影響。在腸道形態(tài)和營養(yǎng)條件等選擇壓力的作用下，不同部位的菌群結(jié)構(gòu)又表現(xiàn)出不同程度的差異，最終使錦鯉腸道不同部位形成獨特的菌群結(jié)構(gòu)，并可能會影響腸道不同部位功能的分化。

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（責任編輯 鄧慧靈）