胡曉娟 許云娜 徐創(chuàng)文 楊鏗 文國樑 曹煜成

摘要：【目的】優(yōu)化解磷菌PSBHY-3的培養(yǎng)參數(shù)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖專用解磷菌的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供技術支持?！痉椒ā客ㄟ^單因素試驗篩選適合解磷菌菌株PSBHY-3生長的發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源及其含量;采用Plackett-Burman試驗篩選獲得對菌量影響最顯著的3個因子;通過最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗確定顯著因子的最佳水平，建立主要培養(yǎng)參數(shù)的回歸方程，得出優(yōu)化后顯著因子的最佳值及預測菌量;通過搖瓶試驗驗證，檢驗模型方程的準確性?！窘Y(jié)果】菌株PSBHY-3的最佳碳源、氮源分別為可溶性淀粉和蛋白胨—酵母膏（1∶1）。以溫度（A）、蛋白胨—酵母膏（B）和轉(zhuǎn)速（C）為因素變量，菌株PSBHY-3的菌量為響應值，擬合得到二次多元回歸方程Y=17.10-0.88A+0.55B+1.27C+0.24AB+0.34AC-0.24BC-3.57A2-2.78B2-6.13C2。優(yōu)化得到的解磷菌菌株PSBHY-3最佳發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)為：可溶性淀粉10.0 g/L，蛋白胨10.18 g/L，酵母膏10.18 g/L，氯化鈉3.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，pH 7，培養(yǎng)溫度35.54 ℃，轉(zhuǎn)速164 r/min，接種量1%，裝液量60%（V/V）。在最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件下，菌量實際值為1.81×109 CFU/mL，與理論菌量（1.72×109 CFU/mL）間無顯著差異（P>0.05），但顯著高于優(yōu)化前采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)的菌量（1.90×108 CFU/mL）（P<0.05）?！窘Y(jié)論】通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗等優(yōu)化了菌株PSBHY-3的發(fā)酵參數(shù)，顯著提高了目的菌量，回歸方程預測準確，優(yōu)化后的發(fā)酵參數(shù)可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖專用解磷菌的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。

關鍵詞： 解磷菌;解淀粉芽孢桿菌;發(fā)酵;培養(yǎng)參數(shù)

中圖分類號： S917.1;Q178.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）02-0475-08

Abstract：【Objective】The cultivation parameters of phosphate solubilizing bacteria PSBHY-3 were optimized， in order to provide technical support for its industrial fermentation production of phosphate solubilizing bacteria preparations for aquaculture. 【Method】Based on single-factor experiment， the optimal carbon and nitrogen source and their contents for the growth of phosphate solubilizing bacteria for phosphate solubilizing bacteria PSBHY-3 were screened. Then， three significant factors affecting the amount of bacteria were determined with the Plackett-Burman experiment. The optimal level of significant factors was determined with the steepest ascent and Box-Behnken experiment， the regression equation of culture parameters was established. Then the optimal values of the significant factors after optimization and the predicted bacterial amount were obtained. Finally， the validity of the model equation was verified with the shake flask experiments.【Result】The results showed that the optimal carbon source and nitrogen source of PSBHY-3 were soluble starch and pe-ptone-yeast extract（1∶1）， respectively. The temperature（A）， applied amount of yeast extract-peptone（B）， and rotation speed （C） were selected as the factor variables， and amount of strain PSBHY-3 was selected as the response variable. The quadratic multiple regression equation was proposed as follow：Y=17.10-0.88A+0.55B+1.27C+0.24AB+0.34AC-0.24BC-3.57A2-2.78B2-6.13C2. The optimum fermentation parameters of strain PSBHY-3 were as follows：soluble starch 10.0 g/L， peptone 10.18 g/L， yeast extract 10.18 g/L， sodium chloride 3.0 g/L， magnesium sulfate 1.0 g/L， pH 7， temperature 35.54 ℃， rotation speed 164 r/min， inoculum quantity 1%， liquid volume in flask 60%（V/V）. Under the above optimum conditions， the amount of bacteria was 1.81×109 CFU/mL， which was not significantly different with the theoretical prediction（1.72×109 CFU/mL）（P>0.05）. But it was significantly higher than that cultured by nutrient broth without optimization（1.90×108 CFU/mL）（P<0.05）. 【Conclusion】Through single-factor test， Plackett-Burman test， steepest ascent test and Box-Behnken test， the fermentation parameters of strain PSBHY-3 are optimized， which significantly increases the target bacterial amount. The prediction of regression equation is accurate. The optimized fermentation parameters can be used in the industrial fermentation of phosphorus preparation for aquaculture.

Key words： phosphate solubilizing bacteria; Bacillus amylolyticus; fermentation; cultivation parameters

Foundation item： Basal Research Fund of Chinese Academy of Fishery Sciences（2020TD54）; Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund of South China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences（2019TS06）; Modern Agriculture Industry Technology System Construction Project（CARS-48）; Guangdong Provincial Special Fund for Modern Agriculture Industry Technology Innovation Teams（2019KJ149）

0 引言

【研究意義】磷元素既是養(yǎng)殖池塘微藻生長的必需元素之一，也是限制池塘初級生產(chǎn)力的重要元素之一（胡曉娟等，2010）。在養(yǎng)殖水體中，大量磷肥和含磷餌料進入池塘后多沉積于底泥中，轉(zhuǎn)化為難溶性磷，水體中可供浮游微藻利用的活性磷相對缺乏（胡百文等，2014），不僅易使水體呈磷限制潛在富營養(yǎng)化，還會導致水體營養(yǎng)失衡和池塘底質(zhì)污染等問題（劉孝竹等，2009）。研究表明，微生物可控制和影響池塘底泥的釋磷效應（Tomblom and Rydin，1998;吳鵬飛等，2008）。在種植業(yè)中常通過施用解磷菌（Phosphate solubilizing bacteria，PSB）來提高植物對磷肥的利用效率（Amanullah and Khan，2015;Bakhshandeh et al.，2015）。若能將解磷菌菌劑應用于養(yǎng)殖池塘中，既可促進底泥中沉積磷的轉(zhuǎn)化，滿足池塘微藻的生長需求，又能避免外源大量添加磷肥，還可促進池塘的物質(zhì)循環(huán)，減輕環(huán)境負荷。而在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中解磷菌菌劑產(chǎn)品較少見報道。【前人研究進展】胡曉娟等（2017a）研究發(fā)現(xiàn)對蝦養(yǎng)殖池塘的底泥中總磷濃度高，水體中活性磷濃度較低，水體和底泥中的解磷菌數(shù)量少;其后，通過多次的分離篩選，從池塘環(huán)境得到了一株解磷菌——解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）PSBHY-3，其對池塘底泥總磷具有較好的降解效果，可將其作為水產(chǎn)養(yǎng)殖用解磷菌菌劑的備選菌株（胡曉娟等，2018）。研究表明，培養(yǎng)條件對菌株濃度具有顯著的影響（楊鶯鶯等，2005;夏立群等，2013）。楊鶯鶯等（2015）研究解磷菌YC4在不同條件下的生長狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株YC4在溫度20～35 ℃、鹽度5～20、pH 6.0～8.5的條件下生長良好。而發(fā)酵培養(yǎng)的工藝水平?jīng)Q定了菌劑產(chǎn)品的菌體濃度及品質(zhì)（劉惠知等，2009;Behle and Jackson，2014）。鄭雙鳳等（2017）優(yōu)化枯草芽孢桿菌NTGB-178的發(fā)酵工藝，有效提高了發(fā)酵液中的生物量及芽孢產(chǎn)量，其芽孢產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了8.48倍。錢文靜等（2018）研究表明，解淀粉芽孢桿菌JT-84的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖17.51 g/L、酵母粉9.88 g/L和CaCl2 2.11 g/L。雖然胡曉娟等（2017b）、李莎莎等（2017）優(yōu)化了蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）的培養(yǎng)參數(shù)，顯著提高了蠟樣芽孢桿菌的菌量，但兩株蠟樣芽孢桿菌的發(fā)酵工藝和生態(tài)功能均不盡相同?！颈狙芯壳腥朦c】當前，有關解磷菌的研究主要聚焦于新菌株的篩選及其功能評價（Li et al.，2019;Ameni et al.，2020），而鮮見優(yōu)化解磷菌培養(yǎng)參數(shù)的相關報道?！緮M解決的關鍵問題】以解磷菌PSBHY-3為研究對象，通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗等優(yōu)化菌株PSBHY-3的發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)，獲得可用于發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)條件，為水產(chǎn)養(yǎng)殖專用解磷菌的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 菌株 解磷菌菌株PSBHY-3篩選自養(yǎng)殖池塘環(huán)境，該菌種已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏（編號為CCTCC NO：M2015260）。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 優(yōu)化前采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株PSBHY-3，24 h的菌量為1.90×108 CFU/mL。原發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，氯化鈉3.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，pH 7.2±0.2。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 單因素試驗 將保存的菌株PSBHY-3用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基活化。在原發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，選取不同的碳源（0.5%葡萄糖、1%葡萄糖、2%葡萄糖、0.5%可溶性淀粉、1%可溶性淀粉、2%可溶性淀粉、0.5%糖蜜、1%糖蜜、2%糖蜜、0.5%蔗糖、1%蔗糖、2%蔗糖）和氮源[0.5%蛋白胨—酵母膏（1∶1）、1%蛋白胨—酵母膏（1∶1）、2%蛋白胨—酵母膏（1∶1）、0.5%蛋白胨、1%蛋白胨、2%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%酵母膏、2%酵母膏]，其他成分不變。按1%的接種量將菌株PSBHY-3接種至不同培養(yǎng)基中，30 ℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，計數(shù)各組菌株PSBHY-3菌量。

1. 2. 2 Plackett-Burman試驗 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取可能影響菌株PSBHY-3生長的7個因子（可溶性淀粉、蛋白胨—酵母膏、溫度、pH、轉(zhuǎn)速、接種菌量、裝液量）作為因素，另外再設置4個虛擬因素以減少系統(tǒng)誤差，每個因素設置高、低值2個水平，菌量為響應值Y（表1）。共設置12組試驗，試驗后通過方差分析篩選得到對菌株PSBHY-3菌量影響最顯著的3個因子。

1. 2. 3 最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗 選取Plackett-Burman試驗得出的3個影響因子進行最陡爬坡試驗，確定顯著因素的最佳區(qū)域與水平，建立擬合方程。然后開展Box-Behnken試驗對顯著因子進行3因素3水平分析。試驗共包括17個組合（中心試驗5個和析因試驗12個）。試驗后，以菌量為響應值，對17個組合的響應值進行回歸分析，建立主要發(fā)酵參數(shù)的回歸方程。

1. 2. 4 驗證試驗 采用搖瓶試驗對優(yōu)化后顯著因子的最佳值及預測菌量進行驗證，檢驗模型方程準確性。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0檢驗不同碳源及氮源對菌株PSBHY-3菌量影響的顯著性，采用Design-Expert 8.0.6對Box-Behnken試驗結(jié)果進行多元回歸分析及回歸方程的方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗結(jié)果

2. 1. 1 不同碳源對菌株PSBHY-3菌量的影響 由圖1可看出，在碳源篩選試驗中，可溶性淀粉組的菌量最高，在1.04×109～1.62×109 CFU/mL，尤以1%可溶性淀粉組最高，顯著高于其他組（P<0.05，下同）。因此，后續(xù)選擇1%可溶性淀粉組作為菌株PSBHY-3發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

2. 1. 2 不同氮源對菌株PSBHY-3菌量的影響 由圖2可看出，在氮源篩選試驗中，1%和2%蛋白胨—酵母膏組的菌量最高，在4.15×108～4.26×108 CFU/mL，因此，后續(xù)選擇1%蛋白胨—酵母膏組作為菌株PSBHY-3發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2. 2 Plackett-Burman試驗結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果（表2）及回歸方程方差分析（表3）可知，7個潛在因子對菌株PSBHY-3菌量影響的排序為：溫度>蛋白胨—酵母膏>轉(zhuǎn)速>接種菌量>可溶性淀粉>pH>裝液量。因此，在后續(xù)試驗中，選擇溫度、蛋白胨—酵母膏和轉(zhuǎn)速3個因子作為影響菌株PSBHY-3菌量的顯著因素。

2. 3 最陡爬坡試驗結(jié)果

菌株PSBHY-3的菌量隨溫度、蛋白胨—酵母膏及轉(zhuǎn)速3個因素水平的升高呈先升高后降低的變化規(guī)律，在第7組試驗時菌量達最大（表4），即該組試驗因素水平的菌量接近最大值，因此，將第7組的因素與水平設定為Box-Benhnken試驗的中心點。

2. 4 Box-Behnken試驗結(jié)果

以最陡爬坡試驗確定的中心點設計Box-Behnken試驗（表5），并對試驗結(jié)果（表6）進行回歸分析，得到溫度（A）、蛋白胨—酵母膏（B）和轉(zhuǎn)速（C）與菌株PSBHY-3菌量（Y）的回歸方程：

Y=17.10-0.88A+0.55B+1.27C+0.24AB+0.34AC-0.24BC-3.57A2-2.78B2-6.13C2

回歸方程方差分析的結(jié)果（表7）顯示，回歸系數(shù)模型的P=0.0024（P<0.01），說明二次回歸模型顯著，模型建立有意義;方程失擬項P=0.0898（P>0.05），失擬不顯著，說明試驗數(shù)據(jù)與模型不相符情況不顯著，該模型方程可靠性良好;相關系數(shù)R2=0.9334（R2>0.9），說明模型擬合度較好。此外，溫度（A）、蛋白胨—酵母膏（B）和轉(zhuǎn)速（C）3個變量的二次項對菌量影響顯著。

2. 5 優(yōu)化驗證試驗結(jié)果

通過Design-Expert 8.06得到的2.4所述回歸方程，在試驗因素水平范圍內(nèi)預測菌株PSBHY-3的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為：可溶性淀粉10.0 g/L，蛋白胨 10.18 g/L，酵母膏 10.18 g/L，氯化鈉3.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，pH 7，培養(yǎng)溫度 35.54 ℃，轉(zhuǎn)速164 r/min，接種量1%，裝液量60%（V/V）。優(yōu)化后菌株PSBHY-3的理論菌量為1.72×109 CFU/mL。經(jīng)驗搖瓶試培養(yǎng)24 h的結(jié)果顯示，菌量實測值為1.81×109 CFU/mL，與理論值差異不顯著（P>0.05）。表明該模型方程預測準確，可用來指導水產(chǎn)養(yǎng)殖專用解磷菌PSBHY-3的發(fā)酵生產(chǎn)。

3 討論

芽孢桿菌屬菌株是解磷細菌的常見菌屬之一，且作為解磷菌在水域環(huán)境中廣泛存在（Golterman，1996）。Jana（2007）認為芽孢桿菌對磷酸鈣和磷礦粉等難溶性磷酸鹽有很好的溶解作用。Sahu和Jana（2000）將解磷菌應用于養(yǎng)殖魚池時所使用的解磷細菌為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和多粘芽孢桿菌（B. polymyxa）。芽孢桿菌因其可產(chǎn)生芽孢，既易存活與繁殖，又易于發(fā)酵生產(chǎn)，使其成為微生物產(chǎn)品的重要菌種之一（王星云等，2007）。本研究中，選用從養(yǎng)殖池塘中分離得到的高效解磷菌株——解淀粉芽孢桿菌PSBHY-3作為優(yōu)化發(fā)酵工藝的研究對象。

碳氮源是微生物必需的基礎營養(yǎng)物質(zhì)，其為微生物的生長提供原材料和所需的能量（趙能等，2016）。宋瑛瑛等（2016）認為由于菌株存在種屬特異性，不同種類的菌株生長代謝所產(chǎn)生酶的種類及活性有所不同，這樣菌株可以選擇性地吸收碳氮源。因此，篩選適合芽孢桿菌生長的最佳碳氮源可有效提高菌株的產(chǎn)菌量（李莎莎等，2017）。本研究選取不同添加量的葡萄糖、可溶性淀粉、糖蜜和蔗糖作為備選碳源，選取不同添加量的蛋白胨、酵母膏和蛋白胨—酵母膏作為備選氮源，進行篩選優(yōu)化，結(jié)果表明，菌株PSBHY-3的優(yōu)選碳氮源為1%可溶性淀粉和1%蛋白胨—酵母膏。經(jīng)鑒定，菌株PSBHY-3即為解淀粉芽孢桿菌，其對可溶性淀粉良好的利用效果體現(xiàn)了該類菌株特性。而蛋白胨和酵母膏作為常用的氮源，不僅能促進細菌的生長，還有利于其代謝產(chǎn)物的生成（許翠等，2015）。

最陡爬坡試驗結(jié)果表明，溫度和轉(zhuǎn)速也是影響菌株PSBHY-3菌量的關鍵因素。孫鎮(zhèn)平等（2014）的研究表明解淀粉芽孢桿菌固體發(fā)酵的最適溫度約為38 ℃;單哲等（2015）采用智能溫控發(fā)酵系統(tǒng)發(fā)酵解淀粉芽孢桿菌，可使其保持在最適宜的生長溫度范圍（35±0.2）℃內(nèi)。本研究得到優(yōu)化后的培養(yǎng)溫度35.54 ℃與上述研究結(jié)果基本一致。菌株PSBHY-3的發(fā)酵屬于需氧型發(fā)酵，可通過改變轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)培養(yǎng)系統(tǒng)的通氣量，如果轉(zhuǎn)速過慢，通氣量小，不利于細菌生長;但若轉(zhuǎn)速過快，可能會引起菌體自溶，致使菌量減少（劉惠知等，2009）。根據(jù)本研究對溫度、氮源和轉(zhuǎn)速3個因素的參數(shù)值進行優(yōu)化分析，最終得到菌株PSBHY-3的最佳培養(yǎng)參數(shù)為：可溶性淀粉10.0 g/L，蛋白胨10.18 g/L，酵母膏10.18 g/L，氯化鈉3.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，pH 7，培養(yǎng)溫度35.54 ℃，轉(zhuǎn)速164 r/min，接種量1%，裝液量60%（V/V）。在上述培養(yǎng)條件下，菌株PSBHY-3的菌量實測值為1.81×109 CFU/mL，顯著高于優(yōu)化前采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)的菌量（1.90×108 CFU/mL）。由此說明優(yōu)化后的菌株PSBHY-3發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)可顯著提高目的菌量，可為水產(chǎn)養(yǎng)殖專用解磷菌的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗等優(yōu)化了菌株PSBHY-3的發(fā)酵參數(shù)，顯著提高了目的菌量，回歸方程預測準確，優(yōu)化后的發(fā)酵參數(shù)可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖專用解磷菌的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。

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（責任編輯 鄧慧靈）