梁永增+魏冬梅+王磊

摘要：采用單因素試驗分別探討溫度、pH值、接種量、碳源、氮源、無機鹽對魚類水霉病原真菌拮抗菌菌株生長的影響，并在單因素試驗結(jié)果的基礎上，利用正交試驗設計對培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，JL04最適培養(yǎng)溫度為 32 ℃，最適培養(yǎng)pH值為5，接種量對菌體生長的影響不顯著。由正交試驗結(jié)果得出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為胰蛋白胨 6 g/L、葡萄糖6 g/L、酵母提取物3.5 g/L、硝酸銨3.5 g/L、硫酸鎂2 g/L、氯化鈣3 g/L、硫酸錳1 g/L，最佳培養(yǎng)時間為18 h。在此優(yōu)化條件下，該菌株發(fā)酵培養(yǎng)達到對數(shù)生長末期的時間縮短了2 h，能較快進入菌體密度最大的時期，為該菌株的高密度生產(chǎn)提供了一定依據(jù)。

關鍵詞：魚??；水霉??；條件優(yōu)化；發(fā)酵；拮抗菌

中圖分類號： S941.43+1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0141-05

水霉?。⊿aprolegniasis）是嚴重威脅淡水養(yǎng)殖魚類的世界性病害。水霉病是繼發(fā)性感染疾病，流行很廣泛[1]，一年四季均可發(fā)病[2]，晚冬、初春季節(jié)尤為嚴重，對寄主無嚴格的選擇性，水產(chǎn)動物及卵均可被感染，對養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[3-4]。以生物拮抗為核心的生物防治方法具有綠色、環(huán)保、安全、高效的優(yōu)點，近年來水產(chǎn)領域水霉病生物防治研究進展較快[5]，代表了水霉病防控研究的主流方向。生態(tài)防治在控制病原菌數(shù)量、減少魚類疾病發(fā)生的同時還能改善養(yǎng)殖環(huán)境、維護微生態(tài)平衡；因此，水霉病生態(tài)防治拮抗菌的開發(fā)變得尤其重要，拮抗菌的發(fā)酵條件也成為重點研究課題。

對水霉病的治療現(xiàn)已進行了多種嘗試，最初采用孔雀石綠、氯化鈉、臭氧、福爾馬林[6]，其中孔雀石綠的治療效果最好，但由于孔雀石綠具有相當強的副作用并造成嚴重的污染，目前已被禁用[7]。在對水霉病各方面的研究中，一種更為有效的解決途徑是利用生物間的相互作用控制水霉。近年來，中外學者對水霉病生物防治的研究已取得了一定成果，張書俊等[8]、劉莉莉等[9]、趙春暉等[10]、Balcázar等[11]已篩選出對水霉具有較強抑制作用的拮抗菌，并對其拮抗物質(zhì)進行了初步的分離鑒定。筆者所在實驗室分離得到1株水霉病原真菌拮抗菌JL04，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，以下簡稱“JL04菌株”。以JL04菌株為研究對象，對其發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，為今后JL04菌株的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 供試菌種為水霉病原菌拮抗菌中具有廣譜抑菌性的菌株JL04，由筆者所在實驗室前期篩選得到。以LB斜面保存于4 ℃冰箱中。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（合成培養(yǎng)基，pH值7.0）用于水霉的培養(yǎng)和保存。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5.0 g/L）用于細菌的分離、培養(yǎng)、保存。LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，pH值7.0）用于細菌的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.1.3 試劑與儀器 主要試劑見表1，儀器設備見表2。

1.2 方法和步驟

1.2.1 水霉菌株及其拮抗菌株的培養(yǎng) 從長滿水霉菌絲的平板上切取直徑為1 cm的水霉瓊脂塊，接種于水霉培養(yǎng)基平板中央，于25 ℃下恒溫培養(yǎng)。將保存于4 ℃冰箱中的JL04菌株用接種環(huán)挑取菌落，在LB培養(yǎng)基平板上劃線，于37 ℃下恒溫活化培養(yǎng)?；罨蟮腏L04菌株用于發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 JL04菌株拮抗作用廣譜性 采用平板對峙培養(yǎng)法，分別對12株“1.2.1”節(jié)活化完成的水霉菌株進行拮抗廣譜性試驗。將直徑1 cm的水霉瓊脂塊接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，距水霉瓊脂塊一側(cè)25 mm處，接種20 μL發(fā)酵培養(yǎng)的拮抗菌JL04于滅菌濾紙片上，放置0.5 h，于25 ℃下恒溫倒置培養(yǎng)72 h，觀察拮抗效果。

1.2.3 拮抗菌株JL04生長曲線測定 將JL04菌株接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)12 h，用作種子液。取25個250 mL錐形瓶，每瓶裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基，以0.5%的接種量將菌懸液接入24個錐形瓶，以無菌LB液體培養(yǎng)基作為空白對照，均置于 37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)。分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h取樣，采用紫外分光光度計測定D值（λ=600 nm），每份樣品測定3次取平均值。如果菌懸液濃度過高，適當稀釋后再進行測定。以培養(yǎng)時間為橫坐標、D600 nm值為縱坐標，繪制拮抗菌JL04的生長曲線。

1.2.4 JL04菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.4.1 JL04菌株溫度條件的優(yōu)化 將拮抗菌JL04種子培養(yǎng)液按照0.5%的接種量接種至100 mL LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，均調(diào)pH值至7.0，分別置于27、32、37、42 ℃下以 120 r/min 搖床培養(yǎng)20 h，測定不同溫度下JL04菌株培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗設3個平行。

1.2.4.2 JL04菌株最適初始pH值的確定 采用1 mol/L HCl或NaOH將LB發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按0.5%的接種量將JL04種子培養(yǎng)液接種至不同pH值的培養(yǎng)液中，置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)20 h，測定不同pH值下JL04培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗設3個平行。

1.2.4.3 JL04菌株最佳接種量的確定 接種量設置梯度為1%、2%、3%、4%、5%。將拮抗菌接種于LB發(fā)酵培養(yǎng)液，在上述優(yōu)化后的pH值和溫度下發(fā)酵，制成種子菌液，以不同接種量接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)20 h，測定不同接種量發(fā)酵液的D600 nm值。每組試驗設3個平行。

1.2.5 JL04菌株培養(yǎng)基組分優(yōu)化

1.2.5.1 碳源優(yōu)化 以1%硫酸銨為氮源，選擇葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖、葡萄糖+胰蛋白胨（質(zhì)量比1 ∶1）、可溶性淀粉+胰蛋白胨（質(zhì)量比1 ∶1）替代LB基礎液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的胰蛋白胨制成培養(yǎng)基，用量均為1%，配成100 mL培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH值至7.0。將JL04菌株種子培養(yǎng)液按照0.5%的接種量接種至不同碳源的培養(yǎng)液中，置于 37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)20 h。測定不同碳源JL04培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗設3個平行。

1.2.5.2 氮源優(yōu)化 以1%蔗糖為碳源，選擇酵母提取物、尿素、牛肉膏、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀+酵母提取物（1 ∶1）、硝酸銨+酵母提取物（1 ∶1）、硫酸銨+酵母提取物（1 ∶1）、硝酸鉀+硫酸銨（1 ∶1）為氮源，分別以0.5%的量配成100 mL培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH值至7.0。將JL04培養(yǎng)液按照0.5%的接種量接種至不同氮源的培養(yǎng)液中，置于37 ℃、120 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)20 h。測定不同氮源JL04培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗設3個平行。

1.2.5.3 無機鹽優(yōu)化 以1%蔗糖為碳源、0.5%酵母浸膏為氮源，選擇氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳（質(zhì)量比2 ∶3 ∶1）代替LB液體培養(yǎng)基中的氯化鈉制成培養(yǎng)基，分別以1%的量配成100 mL培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH值至7.0。將JL04種子懸液以0.5%的接種量接種至不同無機鹽的培養(yǎng)液中，置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)20 h。測定不同無機鹽JL04培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗設3個平行。

1.2.6 正交試驗 正交試驗用以優(yōu)化培養(yǎng)基最佳用量配比。通過單因素試驗確定了JL04菌株發(fā)酵培養(yǎng)的最佳碳源、氮源、無機鹽。采用L9（33）正交表（表3）進行試驗，以0.5%的接種量接菌懸液，每個培養(yǎng)基組合設3個平行，共9組試驗。均置于37 ℃、120 r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)20 h，測定發(fā)酵液的D600 nm值，以確定最佳培養(yǎng)基組合。每組試驗設3個平行。

1.2.7 優(yōu)化后生長曲線的測定 將JL04菌株接種于100 mL優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩過夜培養(yǎng)，用作種子懸液。取25個250 mL錐形瓶，每瓶裝 100 mL 優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基，以0.5%的接種量將菌懸液接入24個錐形瓶，以無菌LB液體培養(yǎng)基作為空白對照，均置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)。分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h取樣，采用紫外分光光度計測定D600 nm值，每份樣品取樣3次并取測量結(jié)果的平均值。如果菌懸液濃度過高，適當稀釋后再進行測定。以培養(yǎng)時間為橫坐標、D600 nm值為縱坐標，繪制JL04菌株在優(yōu)化后培養(yǎng)基中的生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 JL04菌株對魚類水霉病病原菌水霉的拮抗效果

采用平板對峙培養(yǎng)法，由試驗結(jié)果（圖1）可知，JL04菌株對12株水霉病原真菌均有拮抗性，JL04菌株是生物防治水霉病的1株理想菌株，因此對具有廣譜抑菌性的JL04菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化尤為重要。

2.2 生長曲線測定

拮抗菌JL04菌株在LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線見圖2。該菌株在LB培養(yǎng)基中0～4 h處于潛伏期，菌體生長量少；4 h后進入對數(shù)生長期，菌體數(shù)量急劇增加；于20 h達到生長高峰；20～36 h進入穩(wěn)定期。試驗結(jié)果表明，JL04菌株在液體培養(yǎng)基中的增殖情況符合細菌的一般生長規(guī)律，經(jīng)歷了延遲期、 對數(shù)期、 穩(wěn)定期、衰亡期。在20 h后JL04菌株生長進入了穩(wěn)定期，細菌增殖不明顯；因此，在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵20 h為拮抗菌JL04菌株對數(shù)生長的末期，此時期內(nèi)收集的菌液適合作為種子懸液。

2.3 JL04菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 JL04菌株溫度條件的選擇 溫度對蛋白質(zhì)及生物酶的活性影響很大，而蛋白質(zhì)和生物酶又是生物代謝過程中的重要物質(zhì)，因此溫度對于微生物的生長具有很大影響。培養(yǎng)溫度過低或過高均會造成微生物生長緩慢，甚至導致微生物死亡。由圖3可知，32 ℃條件下JL04菌株長勢最好，與其他溫度相比差異顯著，因此拮抗菌JL04的最適生長溫度應在 32 ℃ 左右。試驗結(jié)果表明，JL04菌株對溫度比較敏感，在進行培養(yǎng)時，32 ℃是比較理想的溫度。

2.3.2 最適初始pH值的確定 pH值能影響微生物細胞膜表面電荷及膜的通透性，進而影響對物質(zhì)的吸收能力。另外，pH值還能改變酶活性、酶促反應的速率及代謝途徑。過堿性或過酸性的環(huán)境會導致微生物生長緩慢，甚至導致細菌死亡。

細菌在生長過程中所產(chǎn)生的胞外物質(zhì)會改變發(fā)酵液的pH值，因此僅能控制其初始pH值。由圖4可知，拮抗菌JL04在初始pH值為5～6時長勢最好，與其他組相比差異顯著，可見拮抗菌JL04更適合在略偏酸性的環(huán)境中生長。試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基的初始pH值為5～6時更適合JL04菌株的生長。

2.3.3 接種量的選擇 接種量是與培養(yǎng)基的利用率直接相關的量。接種量太大則菌種吸收不到足夠多的營養(yǎng)，菌數(shù)不高且造成浪費；接種量太小對營養(yǎng)利用不充分，且細菌發(fā)酵周期延長，增加染菌概率。分別以不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%）接種于培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，以培養(yǎng)得到的拮抗菌株發(fā)酵液的D600 nm值表示菌量。由圖5可知，接種量在3%時拮抗菌JL04的長勢最好。單因素方差分析表明， 5個接種量之間沒有顯著性差異，因此接種量對拮抗菌JL04的發(fā)酵生長影響不大。

2.4 JL04菌株培養(yǎng)基組分優(yōu)化

2.4.1 碳源優(yōu)化 根據(jù)微生物所能產(chǎn)生的酶系不同，不同微生物可利用不同的碳源。碳源對微生物生長代謝的作用主要是提供細胞的碳架，提供細胞生命活動所需的能量，提供合成產(chǎn)物的碳架。碳源在制作微生物培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)基時具有重要作用，為微生物或細胞的正常生長、分裂提供物質(zhì)基礎。由圖6可知，以10 g/L胰蛋白胨+葡萄糖（1 ∶1）為碳源的發(fā)酵液D600 nm值最高，與其他單一碳源相比差異顯著；其次為胰蛋白胨+可溶性淀粉（1 ∶1），再次分別為葡萄糖、可溶性淀粉；而果糖、麥芽糖、蔗糖作為碳源時發(fā)酵液的D600 nm值均低于原培養(yǎng)基，因此選用胰蛋白胨+葡萄糖（1 ∶1）作為碳源。

2.4.2 氮源優(yōu)化 微生物生長和產(chǎn)物合成需要氮源，氮源主要用于菌體細胞物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物的合成。氮源是微生物必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，對微生物的生命活動意義重大。由圖7可知，JL04菌株在以酵母提取物+硝酸銨（1 ∶1）為氮源的培養(yǎng)基中長勢最好，其次為酵母提取物+硫酸銨（1 ∶1），再次分別為酵母提取物+硝酸鉀（1 ∶1）、酵母提取物、牛肉膏、硝酸鉀+硫酸銨（1 ∶1）、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素。該結(jié)果可能的原因是有機氮源與無機氮源相比更易被利用，因此有機氮源對菌體生長更加有利。試驗結(jié)果表明，選用酵母提取物+硝酸銨（1 ∶1）作為氮源有利于JL04菌株的發(fā)酵培養(yǎng)。

2.4.3 無機鹽種類的優(yōu)化 無機鹽是細胞的結(jié)構成分，參與并維持生物體的代謝活動，維持生物體內(nèi)的酸堿平衡及滲透壓。對微生物生長的重要性可見一斑。由圖8可知，以硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳（2 ∶3 ∶1）作為無機鹽的培養(yǎng)基發(fā)酵液D600 nm值最高；其次分別為氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳；而磷酸氫二鉀作為無機鹽時，發(fā)酵液的菌量均沒有原培養(yǎng)基效果好，因此選用硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳（2 ∶3 ∶1）作為培養(yǎng)基的無機鹽。

2.5 正交試驗結(jié)果

由表4可知，發(fā)酵培養(yǎng)基組分的最佳組合為A3B3C1，即拮抗菌JL04菌株的最佳培養(yǎng)基為6 g/L胰蛋白胨+6 g/L葡萄糖+ 3.5 g/L酵母提取物+3.5 g/L硝酸銨+2 g/L 硫酸鎂+3 g/L氯化鈣+1 g/L硫酸錳。極差分析表明，RA>RB>RC，即各因子對菌體濃度的影響大小依次為葡萄糖+胰蛋白胨>硝酸銨+酵母提取物>硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳。由表5可知，葡萄糖+胰蛋白胨差異顯著，而硫酸鎂+氯化鈣+硫酸鎂在統(tǒng)計學上沒有顯著性差異。

2.6 拮抗菌JL04在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長曲線的測定

由圖9可知，該菌株在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中0～4 h處于潛伏期，菌體生長量少；4 h后進入對數(shù)生長期，菌體數(shù)量急劇增加；18 h達到生長高峰；18～36 h進入穩(wěn)定期。在優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵18 h為拮抗菌JL04菌株對數(shù)生長的末期，此時期內(nèi)收集的菌液適合作為菌種液，能得到高濃度的菌體。

與優(yōu)化前的培養(yǎng)基相比，拮抗菌JL04在優(yōu)化后培養(yǎng)基中的對數(shù)生長末期提前了2 h，縮短了菌體發(fā)酵培養(yǎng)時得到最高濃度菌量的培養(yǎng)時間；而且優(yōu)化前后該菌達到對數(shù)生長末期時的菌量不同，優(yōu)化后對數(shù)生長末期菌量明顯增大，這對于大量產(chǎn)生菌體來抑制水霉病原菌具有一定意義。

3 結(jié)論與討論

通過單因素試驗和正交試驗，初步得到了實驗室條件下JL04菌株液體發(fā)酵的培養(yǎng)基優(yōu)化配方，即6g/L胰蛋白胨、6 g/L 葡萄糖、3.5 g/L酵母提取物、3.5 g/L硝酸銨、2 g/L硫酸鎂、3 g/L氯化鈣、1 g/L硫酸錳。發(fā)酵條件的研究結(jié)果表明，菌株JL04對溫度和pH值較為敏感，其生長最適溫度為32 ℃，最適pH值為5～6，接種量對菌體生長的影響不顯著。篩選后的培養(yǎng)基碳源、氮源、無機鹽明確，且菌株JL04在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中達到對數(shù)生長末期的時間縮短，能較快進入菌體密度最大期，為該菌株的高密度生產(chǎn)提供依據(jù)。

本試驗僅在實驗室條件下對發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及其培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，而拮抗菌制劑生防作用的發(fā)揮與制備工藝、使用方法以及菌劑使用時的溫度、濕度、pH值等環(huán)境因素密切相關。在拮抗菌制劑商業(yè)化過程中，一方面要繼續(xù)加強對拮抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵工藝、提取與純化方法等的研究，另一方面要加強對拮抗菌制劑發(fā)揮最佳作用條件的研究，需在發(fā)酵罐和水環(huán)境下進行驗證。本試驗對最佳碳源、氮源、無機鹽離子和正交試驗法優(yōu)化培養(yǎng)基配比進行了研究，僅以液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的總菌含量作為指標，并沒有其他與之相對應的篩選模型作為依據(jù)，因此可能對試驗結(jié)果造成一定誤差，但并不影響本研究所得結(jié)果。今后的研究中可設計類似試驗方案，以進一步驗證本試驗的準確性和完整性。

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