王瀚 馬紫童 唐秀鳳 高瑩瑩 楊麗平 劉仁慧

摘要 目的：基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接方法，系統(tǒng)挖掘淫羊藿治療哮喘的關(guān)鍵靶標及作用機制。方法：利用多種數(shù)據(jù)庫尋找淫羊藿的活性成分與作用靶標，建立預測模型并利用分子對接技術(shù)對靶標進行篩選與驗證;查找疾病數(shù)據(jù)庫得到哮喘相關(guān)靶標;構(gòu)建靶標互作網(wǎng)絡篩選關(guān)鍵靶標;利用數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析;構(gòu)建生物網(wǎng)絡并進行拓撲分析。結(jié)果：通過篩選得到白細胞介素（Interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）、血管內(nèi)皮生長因子A（Vascular Endothelial Growth Factor A，VEGFA）等10個關(guān)鍵靶標，富集的通路有IL-17信號通路、TNF信號通路、缺氧誘導因子（Hypoxia-inducible Factor，HIF）-1信號通路等66條，功能信息共得到446條，包括參與炎癥反應、調(diào)控細胞增殖與細胞凋亡等。結(jié)論：淫羊藿中的活性成分靶標及作用通路在對抗炎癥反應、逆轉(zhuǎn)氣道重塑方面均表現(xiàn)出顯著富集，與治療哮喘的作用機制相符合，在哮喘防治方面具有廣闊的發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡藥理學;分子對接;淫羊藿;哮喘;關(guān)鍵靶標;信號通路;炎癥反應;氣道重塑

Study on the Key Targets and Mechanism of Epimedii Folium in the Treatment

of Asthma Based on the Network Pharmacology

WANG Han1，MA Zitong1，TANG Xiufeng1，GAO Yingying1，YANG Liping2，LIU Renhui1

（1 School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100069，China; 2 Wangjing Hospital，

China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100102，China）

Abstract Objective：To explore the key targets and the mechanism of Epimedii Folium for the treatment of asthma based on the method of the network pharmacology and molecular docking.Methods：A variety of database was used to find the active ingredients and the targets of Epimedii Folium; a prediction model was established and molecular docking technology was used to screen and verify the targets; disease database was searched to obtain asthma-related targets; a protein-protein interaction network was built to screen key targets; the database was used to conduct GO functions enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis; the biological network for topology analysis was constructed.Results：Through screening，10 key targets，such as IL-6，TNF，and VEGFA，were obtained.A total of 66 pathways were enriched，including IL-17 signaling pathway，TNF signaling pathway，and HIF-1 signaling pathway and 446 functional information was obtained，including participating in inflammation response，regulating cell proliferation and apoptosis.Conclusion：The active component targets and action pathways in Epimedii Folium show significant enrichment in fighting inflammation and reversing airway remodeling，which are consistent with the mechanism of action for the treatment of asthma，and have broad development prospects in the prevention and treatment of asthma.

Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Epimedii Folium; Asthma; Key targets; Signaling pathway; Inflammation; Airway remodeling

中圖分類號：R285;R242文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.05.012

哮喘（Asthma）是一種下呼吸道常見慢性病，病因包括呼吸道病毒感染、過敏原、非甾體抗炎藥的長期應用及環(huán)境變化等，臨床上患者常反復出現(xiàn)喘息、咳嗽、胸悶、呼吸短促等癥狀[1-2]。隨著當今城市空氣質(zhì)量的下降、居民生活壓力增大及吸煙人群數(shù)目增多，哮喘的發(fā)病率正逐年增加，如何有效地預防與治療哮喘正受到越來越多專家學者的重視。皮質(zhì)類固醇藥物因其強大的抗炎作用在臨床上被廣泛應用于對抗哮喘的炎癥反應，然而其并不能有效改善氣道細胞反復損傷、氣道細胞增殖引發(fā)的氣道重塑，在治療的同時還伴隨糖尿病、骨質(zhì)疏松等并發(fā)癥[3]。近年來，中藥因其多成分、多靶向、作用溫和等特點在治療與輔助治療支氣管哮喘中體現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，其中淫羊藿（Epimedii Folium）為臨床常用的補腎中藥之一[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿能夠通過影響哮喘大鼠JAKs/STATs通路等炎癥介質(zhì)的表達、誘導肺組織細胞凋亡等方式參與慢性支氣管哮喘的治療，效果顯著[5-6]，但其中治療哮喘的有效成分、作用機制尚未全面研究。本研究以此出發(fā)，通過網(wǎng)絡藥理學的方法對淫羊藿治療哮喘的關(guān)鍵靶標進行篩選并挖掘出顯著富集的功能與通路，為其作用機制的進一步研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）;DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）;SymMap（https：//www.symmap.org/）;Herbal Ingredients Targets Database（HIT，http：//lifecenter.sgst.cn/hit/）;Pharmmapper（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）;RCSB Protein Data Bank（http：//www.rcsb.org/）;Discovery Studio 4.5（http：//www.discoverystudio.net/）;AutoDock 4.2（http：//autodock.scripps.edu/）;UniProt（http：//www.uniprot.org/）;National Center for Biotechnology Information Gene Database（NCBI Gene Database）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）;STRING（http：//string-db.org/）;Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG，http：//www.genome.jp/kegg/）;DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）;Cytoscape 3.7.1（http：//www.cytoscape.org/）;R 3.6.1（https：//www.r-project.org）;Bioconductor（http：//www.bioconductor.org/）。

1.2 研究路線與方法 見圖1。

1.3 淫羊藿中活性化合物的篩選與ADME參數(shù)的確定 進入TCMSP數(shù)據(jù)庫，以“yinyanghuo”作為檢索對象搜索得到淫羊藿中全部成分及其ADME信息。本研究采用藥物口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）與類藥性（Drug Likeness，DL）兩大指標作為衡量化合物藥效的依據(jù)，參照TCMSP數(shù)據(jù)庫“parameter information”中的篩選建議，確定篩選的閾值條件為OB≥30%，DL≥0.18，篩選出的分子作為淫羊藿中的活性成分進行后續(xù)研究。

1.4 構(gòu)建淫羊藿已知的活性成分-靶標數(shù)據(jù)庫 建立淫羊藿的“活性化合物-靶標數(shù)據(jù)庫”。在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中搜索得到1.3中淫羊藿活性成分的對應靶標，對其中經(jīng)DrugBank平臺驗證的靶標信息進行保留。隨后利用SysDT模型對藥靶相關(guān)性進行評價[7]，通過支持向量機（Support Vector Machine，SVM）五倍交叉驗證與隨機森林算法（Random Forest Algorithm，RFA）分別進行得分，將SVM_Score>0.8、RF_Score>0.7作為期望值進行篩選。同時，利用SymMap平臺對淫羊藿相關(guān)靶標進行搜索，在結(jié)果中按照P<0.05的標準篩選并添加1.3中活性化合物的相關(guān)靶標。此外，《中華人民共和國藥典》2015版（一部）[8]規(guī)定淫羊藿苷（Icariin，ICA）為藥材質(zhì)量評價的重要指標，故研究將對這一重要化合物的靶標信息加以補充，通過HIT數(shù)據(jù)庫對ICA的已知靶標進行檢索。最終，將以上篩選出的所有化合物-靶標信息去重整合到構(gòu)建好的活性化合物-靶標數(shù)據(jù)庫。

1.5 淫羊藿苷潛在藥靶篩選與分子對接驗證 進入PharmMapper平臺構(gòu)建ICA的藥效團模型并對其潛在靶標進行預測，將整合得分（Norm Fit Score）≥0.95的靶標作為候選進行分子對接。在RCSB數(shù)據(jù)庫下載候選靶標的PDB蛋白晶體模型文件，將文件導入Discovery Studio 4.5中，隨后分離蛋白與之對應的原配體結(jié)構(gòu)，利用AutoDock 4.2軟件重新進行原位點對接，對接算法采用遺傳算法（Genetic Algorithm，GA），通過計算均方根差（Root Mean Square Displacement ，RMSD） 值以比較對接前后復合物的構(gòu)象差異：若RMSD>2 ，證明原靶蛋白與配體的對接效果不好，應舍棄對應靶蛋白;若RMSD≤2 ，則證明對接方法可靠并保留相應靶蛋白以進行后續(xù)操作[9]。將保留下來并去除原配體結(jié)構(gòu)的靶標重新導入AutoDock 4.2中，經(jīng)過分子加氫、除水、計算點電荷、添加原子類型等操作后，采用上述對接方法與ICA配體進行對接。通過查閱相關(guān)文獻[10-11]，研究假定結(jié)果中若蛋白與配體間的最小結(jié)合能（Minimum Binding Energy，MBE）≤-5.0 kJ/mol，則說明淫羊藿苷能較好地與該蛋白進行自發(fā)結(jié)合，并將其視作淫羊藿苷的潛在有效靶標。

1.6 構(gòu)建已知的哮喘疾病靶標數(shù)據(jù)庫 在NCBI Gene Database中選擇檢索項為“Gene”，輸入“Asthma”進行已知哮喘基因的獲取，該數(shù)據(jù)信息來源于PubMed中的文獻報道記錄。隨后篩選出物種為智人（Homo Sapiens）的靶標，并將其去重添加至“哮喘-靶標數(shù)據(jù)庫”。

1.7 靶標互作網(wǎng)絡與關(guān)鍵靶標的篩選 查詢Uniprot數(shù)據(jù)庫，將“活性化合物-靶標數(shù)據(jù)庫”與“哮喘-靶標數(shù)據(jù)庫”中的基因名稱轉(zhuǎn)換為Gene Symbol，將二者信息聯(lián)合進一步篩選出淫羊藿與哮喘疾病的共同靶標，在STRING數(shù)據(jù)庫中分析靶標互作信息。為得到置信度較高的互作關(guān)系，本研究采用“High Confidence（0.700）”的條件對節(jié)點數(shù)據(jù)進行過濾，將處理后的數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.1進行網(wǎng)絡可視化展示，對生成的網(wǎng)絡圖進行拓撲分析，按照節(jié)點度（與該節(jié)點相關(guān)聯(lián)的邊的條數(shù)）由高到低的順序選擇前10個基因作為網(wǎng)絡中的關(guān)鍵靶標。

1.8 基因本體論、信號通路富集分析與生物調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建 采用DAVID數(shù)據(jù)庫進行淫羊藿-哮喘共同靶標基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析，其中在背景基因物種一欄選擇“Homo Sapiens”，輸出P<0.05的富集結(jié)果。此外，利用R 3.6.1中的“Cluster Profiler”插件（下載于Bioconductor平臺）關(guān)聯(lián)KEGG數(shù)據(jù)庫進行信號通路的富集，將富集結(jié)果按照FDR<0.05的標準進行過濾。根據(jù)以上活性

化合物及其靶標、通路的對應關(guān)系，使用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建活性化合物-靶標-通路-疾病生物層次網(wǎng)絡，對網(wǎng)絡中重要節(jié)點的生物效應進行分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選結(jié)果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選出包括淫羊藿苷A（Yinyanghuo A）、淫羊藿苷E（Icariin E）、淫羊藿苷（Icariin）等在內(nèi)的23種活性成分。結(jié)果顯示，淫羊藿中活性成分主要包括黃酮類、多糖類、木脂素、甾醇類等，篩選結(jié)果詳見表1。

2.2 淫羊藿苷（ICA）潛在藥靶與分子對接預測結(jié)果 PharmMapper平臺構(gòu)建ICA的藥效團模型并對其潛在靶標進行分子對接。見表2。經(jīng)預測得到Norm Fit Score≥0.95的ICA相關(guān)靶標26個，對接后RMSD≤2 的靶標21個，最終獲得ICA對接MBE值<-5.0 kJ/mol的潛在有效靶標8個，包括CA2、PNP、HSD17B11等。見圖2。

2.3 淫羊藿化合物靶標與疾病靶標篩選結(jié)果 此次研究共發(fā)現(xiàn)淫羊藿相關(guān)靶標238個，哮喘相關(guān)靶標919個，結(jié)果見表3。圖3表示化合物靶標與疾病靶標交集結(jié)果，得到BCL2、TNF、STAT1、IL4等88個活性成分-哮喘共同靶標。

2.4 淫羊藿靶標-蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡?? 將88個活性成分-哮喘共同靶標導入STRING數(shù)據(jù)庫，得到構(gòu)建好的靶標互作網(wǎng)絡。見圖4。圖中黃色節(jié)點代表節(jié)點度排名前10的關(guān)鍵靶標，粉紅色表示其他靶標。整個網(wǎng)絡中共存在1 298條邊，即存在609條靶標互作關(guān)系，其中邊的粗細反映置信度的高低。該網(wǎng)絡主要參數(shù)與關(guān)鍵靶標的節(jié)點度信息見表4。觀察表中數(shù)據(jù)可知此網(wǎng)絡中的最短路徑數(shù)目達100%，節(jié)點間平均距離為1.747，意味著

該網(wǎng)絡為典型的小世界網(wǎng)絡[12]，其中任意2個靶標只需要通過2.536個其他靶標就可發(fā)生作用，網(wǎng)絡下靶標之間的信息傳遞迅速且通暢。此外，平均相鄰節(jié)點數(shù)目為29.5，表示每個靶標平均與29.5個其他靶標相連，網(wǎng)絡的整體密度為0.339，則意味著某個靶蛋白與其他任一靶蛋白發(fā)生相互作用的平均概率為33.9%，說明各靶標之間的信息交流密切，一定程度上反映淫羊藿中活性分子能夠通過靶標之間穩(wěn)定緊密的調(diào)控作用，改變哮喘疾病機體的狀態(tài)。

2.5 GO與KEGG通路富集分析結(jié)果 對88個靶標基因進行GO分析共識別得到446條結(jié)果，其中發(fā)現(xiàn)358條生物過程（Biological Process，BP）信息，包括正調(diào)控血管生成、細胞增殖的正調(diào)控、炎癥反應等功能;45條分子功能（Molecular Function，MF）信息，包括酶結(jié)合、細胞因子活性、生長因子活性等;43條細胞組分（Cellular Component，CC）信息，包括細胞外間隙、胞外區(qū)、胞膜窖等，按照P由小到大的順序，每個部分前20條富集結(jié)果見圖5。

KEGG通路富集分析共識別到83個基因，除去寬泛的通路及哮喘以外的疾病通路，共得到66條結(jié)果，包括IL-17信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路等，按照FDR由小到大排序，前20條通路結(jié)果見圖6。

2.6 生物網(wǎng)絡構(gòu)建結(jié)果 構(gòu)建好的活性化合物-靶標-通路-哮喘的一級生物網(wǎng)絡見圖7。整個網(wǎng)絡中共有節(jié)點190個，節(jié)點的大小表示度的多少，中間的紅色菱形節(jié)點代表哮喘，23個粉紅色六角形節(jié)點代表活性化合物，88個綠色圓形節(jié)點代表靶標，66個藍色方形節(jié)點代表信號通路，網(wǎng)絡節(jié)點間共存在767條作用關(guān)系。

圖8表示在一級生物網(wǎng)絡的基礎(chǔ)上提取出的10個關(guān)鍵靶標及其關(guān)聯(lián)的活性化合物、信號通路所構(gòu)建的二級網(wǎng)絡，其中10個核心靶標與17個活性化合物、63條信號通路關(guān)聯(lián)。網(wǎng)絡分析顯示，槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、木犀草素（Luteolin）與脫水淫羊藿素（Anhydroicaritin）等活性化合物能作用于網(wǎng)絡中的多個靶標，而MAPK3、MAPK1、PRKCA與PTGS2等靶標也能與多個成分、多條通路發(fā)生作用，證明淫羊藿能夠發(fā)揮多成分、多靶標、多通路的協(xié)同作用對哮喘進行全面系統(tǒng)的治療。

3 討論

支氣管哮喘屬于中醫(yī)學“哮證”范疇，其發(fā)病常以水濕內(nèi)盛、臟氣虧虛等為內(nèi)因，外以風邪侵入機體，導致氣道受阻、痰濕蘊肺、咳喘痰鳴[13]。中醫(yī)學認為補虛固本、理氣祛痰是治療哮喘的關(guān)鍵，《景岳全書》[14]中曾指出：“痰為水，腎主水，痰之本在腎”，腎陽乃體內(nèi)陽氣之本源，陽氣充盈，則肺氣充實，呼吸調(diào)暢;陽氣不足，則肺氣瘀阻，氣喘乏力。淫羊藿作為重要的補腎陽藥，對于腎虛型支氣管哮喘具有十分顯著的療效。其有效成分包括淫羊藿苷類、淫羊藿黃酮以及淫羊藿多糖等，針對哮喘的治療能夠發(fā)揮減輕支氣管炎癥反應、抗氣道重塑、抗氧化應激、調(diào)節(jié)免疫應答與減輕糖皮質(zhì)激素耐受性等藥理作用[15-17]。

氣道慢性炎癥反應是哮喘的一個重要特征，主要表現(xiàn)為外界過敏原誘導的T輔助細胞向Th2型細胞極化，促使中性粒細胞、嗜酸性粒細胞增殖并釋放等細胞因子，引發(fā)I型超敏反應。10個關(guān)鍵靶標中節(jié)點度排在第1、2位的IL-6與TNF均為哮喘病程中的強炎癥介質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)IL-6可在多種炎性刺激和細胞因子的作用下參與JAK-STAT通路內(nèi)的炎癥反應信號傳遞，導致Janus酪氨酸激酶家族的信號傳導因子（JAK1、JAK2等）及STAT1、STAT3等轉(zhuǎn)錄激活因子磷酸化，進一步加重氣道炎癥反應[18];TNF是引發(fā)哮喘炎癥反應的關(guān)鍵蛋白，在哮喘發(fā)病時可激活下游的核因子-κB等信號通路促使炎癥介質(zhì)的釋放與募集、炎性小體的形成，誘發(fā)炎癥介質(zhì)[19]。課題組前期研究證實中藥淫羊藿可下調(diào)JAKs/STATs蛋白磷酸化水平，減少IL-6等炎癥介質(zhì)釋放，從而與地塞米松協(xié)同改善哮喘炎癥反應[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)肺組織損傷的模型大鼠經(jīng)淫羊藿苷干預后TNF-α表達量顯著減少，而觀察圖7生物網(wǎng)絡結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚等活性成分與IL-6、TNF直接相連，因此推測淫羊藿中存在多種成分能夠降低TNF-α水平、減少IL-6等相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放以發(fā)揮哮喘抗炎作用[20]。

10個關(guān)鍵靶標除IL-6、TNF外，其余大部分均為哮喘的重要炎性介導因子與趨化因子，如CXCL8、IL1B、CCL2等，其中尤其值得關(guān)注的是PTGS2（環(huán)加氧酶-2），其節(jié)點度在10個關(guān)鍵靶標中排名第4，而結(jié)果顯示以PTGS2為靶標的成分涵蓋了23個全部活性成分中的17個，即淫羊藿中大多數(shù)成分均能作用于此靶標。比較于健康狀態(tài)，哮喘發(fā)生時氣道上皮和黏膜下層的PTGS2通過快速表達并釋放PGE（前列腺素E）等遞質(zhì)引發(fā)炎癥反應加重[21]。據(jù)報道木犀草素、山柰酚可有效下調(diào)哮喘模型中的PTGS2表達量[22-23]，而上述2種天然化合物均為淫羊藿中的主要成分，同時存在于活性化合物-靶標調(diào)控網(wǎng)絡，以此說明PTGS2可能為淫羊藿對抗炎癥反應的一個重要因子。

氣道重塑是哮喘的另一個顯著特征，指的是哮喘發(fā)病時氣道內(nèi)多種細胞結(jié)構(gòu)和功能上的惡性變化，如氣道上皮細胞衰老與脫落、氣道平滑肌異常增殖與增厚等。本研究的GO與KEGG通路結(jié)果提示，核因子-κB信號通路、PI3K-Akt信號通路、p53信號通路、細胞凋亡與衰老等信號通路廣泛參與了氣道重塑的發(fā)展過程，包括調(diào)節(jié)氣道細胞的生長、增殖、分化、衰老、凋亡與自噬等生物進程。作為關(guān)鍵靶標的CASP3是細胞內(nèi)源性凋亡信號的發(fā)起者之一，被激活后可介導下游凋亡與自噬反應的發(fā)生，同時還可與抑制因子XIAP（X-linked Inhibitors of Apoptosis Proteins）發(fā)生拮抗以共同維持凋亡活性穩(wěn)態(tài)[24]，與此類似的還有Bcl-2/Bax凋亡平衡體系，Bcl-2可在核因子-κB等信號通路的誘導下，與凋亡的正調(diào)控因子Bax協(xié)同調(diào)控凋亡活性[25]。前期研究結(jié)果顯示，哮喘大鼠經(jīng)淫羊藿干預后肺組織凋亡活性上調(diào)，使氣道重塑癥狀得到緩解[6]。此外，VEGFA（血管內(nèi)皮生長因子-α）、EGFR（表皮生長因子受體）也是本研究結(jié)果的關(guān)鍵靶標，前者可促使血管生成與血管壁增厚，后者與多種氣道細胞的增殖和生長調(diào)控有關(guān)[26-27]。以上證明，淫羊藿通過作用于CASP3、VEGFA、EGFR等關(guān)鍵蛋白與多條相關(guān)通路，進而改變不同氣道細胞的不同生長狀態(tài)以改善氣道重塑。

此次淫羊藿中的關(guān)鍵靶標和通路結(jié)果顯示其在抗炎與抗氣道重塑兩方面的顯著活性，從宏觀的角度為進一步深入研究淫羊藿的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供了參考依據(jù)，然而單純地基于網(wǎng)絡模型、藥靶對接與數(shù)據(jù)分析無法完全評價藥物在體內(nèi)的具體代謝過程，故仍需借助進一步實驗加以證實。

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（2020-06-10收稿 責任編輯：芮莉莉）

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81873115）;國家中醫(yī)藥管理局全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設項目（國中醫(yī)藥人教函〔2018〕134號）

作者簡介：王瀚（1997.07—），男，碩士研究生在讀，研究方向：中藥及復方的藥效及作用機制研究，E-mail：wh_1_1@163.com

通信作者：楊麗平（1971.11—），女，本科，副研究員，研究方向：中藥網(wǎng)絡藥理學研究，E-mail：yanglpwj@163.com

;劉仁慧（1974.07—），女，醫(yī)學博士，教授，研究方向：中藥配伍機制研究，E-mail：gzblrh45@ccmu.edu.cn