王瀚 馬紫童 唐秀鳳 高瑩瑩 楊麗平 劉仁慧

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接方法，系統(tǒng)挖掘淫羊藿治療哮喘的關(guān)鍵靶標(biāo)及作用機(jī)制。方法：利用多種數(shù)據(jù)庫(kù)尋找淫羊藿的活性成分與作用靶標(biāo)，建立預(yù)測(cè)模型并利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行篩選與驗(yàn)證;查找疾病數(shù)據(jù)庫(kù)得到哮喘相關(guān)靶標(biāo);構(gòu)建靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵靶標(biāo);利用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析;構(gòu)建生物網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治?。結(jié)果：通過(guò)篩選得到白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（Vascular Endothelial Growth Factor A，VEGFA）等10個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)，富集的通路有IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible Factor，HIF）-1信號(hào)通路等66條，功能信息共得到446條，包括參與炎癥反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡等。結(jié)論：淫羊藿中的活性成分靶標(biāo)及作用通路在對(duì)抗炎癥反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)氣道重塑方面均表現(xiàn)出顯著富集，與治療哮喘的作用機(jī)制相符合，在哮喘防治方面具有廣闊的發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接;淫羊藿;哮喘;關(guān)鍵靶標(biāo);信號(hào)通路;炎癥反應(yīng);氣道重塑

Study on the Key Targets and Mechanism of Epimedii Folium in the Treatment

of Asthma Based on the Network Pharmacology

WANG Han1，MA Zitong1，TANG Xiufeng1，GAO Yingying1，YANG Liping2，LIU Renhui1

（1 School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100069，China; 2 Wangjing Hospital，

China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100102，China）

Abstract Objective：To explore the key targets and the mechanism of Epimedii Folium for the treatment of asthma based on the method of the network pharmacology and molecular docking.Methods：A variety of database was used to find the active ingredients and the targets of Epimedii Folium; a prediction model was established and molecular docking technology was used to screen and verify the targets; disease database was searched to obtain asthma-related targets; a protein-protein interaction network was built to screen key targets; the database was used to conduct GO functions enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis; the biological network for topology analysis was constructed.Results：Through screening，10 key targets，such as IL-6，TNF，and VEGFA，were obtained.A total of 66 pathways were enriched，including IL-17 signaling pathway，TNF signaling pathway，and HIF-1 signaling pathway and 446 functional information was obtained，including participating in inflammation response，regulating cell proliferation and apoptosis.Conclusion：The active component targets and action pathways in Epimedii Folium show significant enrichment in fighting inflammation and reversing airway remodeling，which are consistent with the mechanism of action for the treatment of asthma，and have broad development prospects in the prevention and treatment of asthma.

Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Epimedii Folium; Asthma; Key targets; Signaling pathway; Inflammation; Airway remodeling

中圖分類號(hào)：R285;R242文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.05.012

哮喘（Asthma）是一種下呼吸道常見(jiàn)慢性病，病因包括呼吸道病毒感染、過(guò)敏原、非甾體抗炎藥的長(zhǎng)期應(yīng)用及環(huán)境變化等，臨床上患者常反復(fù)出現(xiàn)喘息、咳嗽、胸悶、呼吸短促等癥狀[1-2]。隨著當(dāng)今城市空氣質(zhì)量的下降、居民生活壓力增大及吸煙人群數(shù)目增多，哮喘的發(fā)病率正逐年增加，如何有效地預(yù)防與治療哮喘正受到越來(lái)越多專家學(xué)者的重視。皮質(zhì)類固醇藥物因其強(qiáng)大的抗炎作用在臨床上被廣泛應(yīng)用于對(duì)抗哮喘的炎癥反應(yīng)，然而其并不能有效改善氣道細(xì)胞反復(fù)損傷、氣道細(xì)胞增殖引發(fā)的氣道重塑，在治療的同時(shí)還伴隨糖尿病、骨質(zhì)疏松等并發(fā)癥[3]。近年來(lái)，中藥因其多成分、多靶向、作用溫和等特點(diǎn)在治療與輔助治療支氣管哮喘中體現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其中淫羊藿（Epimedii Folium）為臨床常用的補(bǔ)腎中藥之一[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿能夠通過(guò)影響哮喘大鼠JAKs/STATs通路等炎癥介質(zhì)的表達(dá)、誘導(dǎo)肺組織細(xì)胞凋亡等方式參與慢性支氣管哮喘的治療，效果顯著[5-6]，但其中治療哮喘的有效成分、作用機(jī)制尚未全面研究。本研究以此出發(fā)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)淫羊藿治療哮喘的關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行篩選并挖掘出顯著富集的功能與通路，為其作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件 Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）;DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）;SymMap（https：//www.symmap.org/）;Herbal Ingredients Targets Database（HIT，http：//lifecenter.sgst.cn/hit/）;Pharmmapper（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）;RCSB Protein Data Bank（http：//www.rcsb.org/）;Discovery Studio 4.5（http：//www.discoverystudio.net/）;AutoDock 4.2（http：//autodock.scripps.edu/）;UniProt（http：//www.uniprot.org/）;National Center for Biotechnology Information Gene Database（NCBI Gene Database）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）;STRING（http：//string-db.org/）;Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG，http：//www.genome.jp/kegg/）;DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）;Cytoscape 3.7.1（http：//www.cytoscape.org/）;R 3.6.1（https：//www.r-project.org）;Bioconductor（http：//www.bioconductor.org/）。

1.2 研究路線與方法 見(jiàn)圖1。

1.3 淫羊藿中活性化合物的篩選與ADME參數(shù)的確定 進(jìn)入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以“yinyanghuo”作為檢索對(duì)象搜索得到淫羊藿中全部成分及其ADME信息。本研究采用藥物口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）與類藥性（Drug Likeness，DL）兩大指標(biāo)作為衡量化合物藥效的依據(jù)，參照TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)“parameter information”中的篩選建議，確定篩選的閾值條件為OB≥30%，DL≥0.18，篩選出的分子作為淫羊藿中的活性成分進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4 構(gòu)建淫羊藿已知的活性成分-靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù) 建立淫羊藿的“活性化合物-靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)”。在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中搜索得到1.3中淫羊藿活性成分的對(duì)應(yīng)靶標(biāo)，對(duì)其中經(jīng)DrugBank平臺(tái)驗(yàn)證的靶標(biāo)信息進(jìn)行保留。隨后利用SysDT模型對(duì)藥靶相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)[7]，通過(guò)支持向量機(jī)（Support Vector Machine，SVM）五倍交叉驗(yàn)證與隨機(jī)森林算法（Random Forest Algorithm，RFA）分別進(jìn)行得分，將SVM_Score>0.8、RF_Score>0.7作為期望值進(jìn)行篩選。同時(shí)，利用SymMap平臺(tái)對(duì)淫羊藿相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行搜索，在結(jié)果中按照P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選并添加1.3中活性化合物的相關(guān)靶標(biāo)。此外，《中華人民共和國(guó)藥典》2015版（一部）[8]規(guī)定淫羊藿苷（Icariin，ICA）為藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，故研究將對(duì)這一重要化合物的靶標(biāo)信息加以補(bǔ)充，通過(guò)HIT數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ICA的已知靶標(biāo)進(jìn)行檢索。最終，將以上篩選出的所有化合物-靶標(biāo)信息去重整合到構(gòu)建好的活性化合物-靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.5 淫羊藿苷潛在藥靶篩選與分子對(duì)接驗(yàn)證 進(jìn)入PharmMapper平臺(tái)構(gòu)建ICA的藥效團(tuán)模型并對(duì)其潛在靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)，將整合得分（Norm Fit Score）≥0.95的靶標(biāo)作為候選進(jìn)行分子對(duì)接。在RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)下載候選靶標(biāo)的PDB蛋白晶體模型文件，將文件導(dǎo)入Discovery Studio 4.5中，隨后分離蛋白與之對(duì)應(yīng)的原配體結(jié)構(gòu)，利用AutoDock 4.2軟件重新進(jìn)行原位點(diǎn)對(duì)接，對(duì)接算法采用遺傳算法（Genetic Algorithm，GA），通過(guò)計(jì)算均方根差（Root Mean Square Displacement ，RMSD） 值以比較對(duì)接前后復(fù)合物的構(gòu)象差異：若RMSD>2 ，證明原靶蛋白與配體的對(duì)接效果不好，應(yīng)舍棄對(duì)應(yīng)靶蛋白;若RMSD≤2 ，則證明對(duì)接方法可靠并保留相應(yīng)靶蛋白以進(jìn)行后續(xù)操作[9]。將保留下來(lái)并去除原配體結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)重新導(dǎo)入AutoDock 4.2中，經(jīng)過(guò)分子加氫、除水、計(jì)算點(diǎn)電荷、添加原子類型等操作后，采用上述對(duì)接方法與ICA配體進(jìn)行對(duì)接。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]，研究假定結(jié)果中若蛋白與配體間的最小結(jié)合能（Minimum Binding Energy，MBE）≤-5.0 kJ/mol，則說(shuō)明淫羊藿苷能較好地與該蛋白進(jìn)行自發(fā)結(jié)合，并將其視作淫羊藿苷的潛在有效靶標(biāo)。

1.6 構(gòu)建已知的哮喘疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù) 在NCBI Gene Database中選擇檢索項(xiàng)為“Gene”，輸入“Asthma”進(jìn)行已知哮喘基因的獲取，該數(shù)據(jù)信息來(lái)源于PubMed中的文獻(xiàn)報(bào)道記錄。隨后篩選出物種為智人（Homo Sapiens）的靶標(biāo)，并將其去重添加至“哮喘-靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)”。

1.7 靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵靶標(biāo)的篩選 查詢Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，將“活性化合物-靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)”與“哮喘-靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)”中的基因名稱轉(zhuǎn)換為Gene Symbol，將二者信息聯(lián)合進(jìn)一步篩選出淫羊藿與哮喘疾病的共同靶標(biāo)，在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中分析靶標(biāo)互作信息。為得到置信度較高的互作關(guān)系，本研究采用“High Confidence（0.700）”的條件對(duì)節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化展示，對(duì)生成的網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，按照?jié)點(diǎn)度（與該節(jié)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的邊的條數(shù)）由高到低的順序選擇前10個(gè)基因作為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶標(biāo)。

1.8 基因本體論、信號(hào)通路富集分析與生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行淫羊藿-哮喘共同靶標(biāo)基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析，其中在背景基因物種一欄選擇“Homo Sapiens”，輸出P<0.05的富集結(jié)果。此外，利用R 3.6.1中的“Cluster Profiler”插件（下載于Bioconductor平臺(tái)）關(guān)聯(lián)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信號(hào)通路的富集，將富集結(jié)果按照FDR<0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過(guò)濾。根據(jù)以上活性

化合物及其靶標(biāo)、通路的對(duì)應(yīng)關(guān)系，使用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建活性化合物-靶標(biāo)-通路-疾病生物層次網(wǎng)絡(luò)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)中重要節(jié)點(diǎn)的生物效應(yīng)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選結(jié)果 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出包括淫羊藿苷A（Yinyanghuo A）、淫羊藿苷E（Icariin E）、淫羊藿苷（Icariin）等在內(nèi)的23種活性成分。結(jié)果顯示，淫羊藿中活性成分主要包括黃酮類、多糖類、木脂素、甾醇類等，篩選結(jié)果詳見(jiàn)表1。

2.2 淫羊藿苷（ICA）潛在藥靶與分子對(duì)接預(yù)測(cè)結(jié)果 PharmMapper平臺(tái)構(gòu)建ICA的藥效團(tuán)模型并對(duì)其潛在靶標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接。見(jiàn)表2。經(jīng)預(yù)測(cè)得到Norm Fit Score≥0.95的ICA相關(guān)靶標(biāo)26個(gè)，對(duì)接后RMSD≤2 的靶標(biāo)21個(gè)，最終獲得ICA對(duì)接MBE值<-5.0 kJ/mol的潛在有效靶標(biāo)8個(gè)，包括CA2、PNP、HSD17B11等。見(jiàn)圖2。

2.3 淫羊藿化合物靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)篩選結(jié)果 此次研究共發(fā)現(xiàn)淫羊藿相關(guān)靶標(biāo)238個(gè)，哮喘相關(guān)靶標(biāo)919個(gè)，結(jié)果見(jiàn)表3。圖3表示化合物靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)交集結(jié)果，得到BCL2、TNF、STAT1、IL4等88個(gè)活性成分-哮喘共同靶標(biāo)。

2.4 淫羊藿靶標(biāo)-蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)?? 將88個(gè)活性成分-哮喘共同靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到構(gòu)建好的靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖4。圖中黃色節(jié)點(diǎn)代表節(jié)點(diǎn)度排名前10的關(guān)鍵靶標(biāo)，粉紅色表示其他靶標(biāo)。整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中共存在1 298條邊，即存在609條靶標(biāo)互作關(guān)系，其中邊的粗細(xì)反映置信度的高低。該網(wǎng)絡(luò)主要參數(shù)與關(guān)鍵靶標(biāo)的節(jié)點(diǎn)度信息見(jiàn)表4。觀察表中數(shù)據(jù)可知此網(wǎng)絡(luò)中的最短路徑數(shù)目達(dá)100%，節(jié)點(diǎn)間平均距離為1.747，意味著

該網(wǎng)絡(luò)為典型的小世界網(wǎng)絡(luò)[12]，其中任意2個(gè)靶標(biāo)只需要通過(guò)2.536個(gè)其他靶標(biāo)就可發(fā)生作用，網(wǎng)絡(luò)下靶標(biāo)之間的信息傳遞迅速且通暢。此外，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)目為29.5，表示每個(gè)靶標(biāo)平均與29.5個(gè)其他靶標(biāo)相連，網(wǎng)絡(luò)的整體密度為0.339，則意味著某個(gè)靶蛋白與其他任一靶蛋白發(fā)生相互作用的平均概率為33.9%，說(shuō)明各靶標(biāo)之間的信息交流密切，一定程度上反映淫羊藿中活性分子能夠通過(guò)靶標(biāo)之間穩(wěn)定緊密的調(diào)控作用，改變哮喘疾病機(jī)體的狀態(tài)。

2.5 GO與KEGG通路富集分析結(jié)果 對(duì)88個(gè)靶標(biāo)基因進(jìn)行GO分析共識(shí)別得到446條結(jié)果，其中發(fā)現(xiàn)358條生物過(guò)程（Biological Process，BP）信息，包括正調(diào)控血管生成、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)等功能;45條分子功能（Molecular Function，MF）信息，包括酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性、生長(zhǎng)因子活性等;43條細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）信息，包括細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、胞膜窖等，按照P由小到大的順序，每個(gè)部分前20條富集結(jié)果見(jiàn)圖5。

KEGG通路富集分析共識(shí)別到83個(gè)基因，除去寬泛的通路及哮喘以外的疾病通路，共得到66條結(jié)果，包括IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等，按照FDR由小到大排序，前20條通路結(jié)果見(jiàn)圖6。

2.6 生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 構(gòu)建好的活性化合物-靶標(biāo)-通路-哮喘的一級(jí)生物網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖7。整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點(diǎn)190個(gè)，節(jié)點(diǎn)的大小表示度的多少，中間的紅色菱形節(jié)點(diǎn)代表哮喘，23個(gè)粉紅色六角形節(jié)點(diǎn)代表活性化合物，88個(gè)綠色圓形節(jié)點(diǎn)代表靶標(biāo)，66個(gè)藍(lán)色方形節(jié)點(diǎn)代表信號(hào)通路，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)間共存在767條作用關(guān)系。

圖8表示在一級(jí)生物網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上提取出的10個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)及其關(guān)聯(lián)的活性化合物、信號(hào)通路所構(gòu)建的二級(jí)網(wǎng)絡(luò)，其中10個(gè)核心靶標(biāo)與17個(gè)活性化合物、63條信號(hào)通路關(guān)聯(lián)。網(wǎng)絡(luò)分析顯示，槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、木犀草素（Luteolin）與脫水淫羊藿素（Anhydroicaritin）等活性化合物能作用于網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)靶標(biāo)，而MAPK3、MAPK1、PRKCA與PTGS2等靶標(biāo)也能與多個(gè)成分、多條通路發(fā)生作用，證明淫羊藿能夠發(fā)揮多成分、多靶標(biāo)、多通路的協(xié)同作用對(duì)哮喘進(jìn)行全面系統(tǒng)的治療。

3 討論

支氣管哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“哮證”范疇，其發(fā)病常以水濕內(nèi)盛、臟氣虧虛等為內(nèi)因，外以風(fēng)邪侵入機(jī)體，導(dǎo)致氣道受阻、痰濕蘊(yùn)肺、咳喘痰鳴[13]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為補(bǔ)虛固本、理氣祛痰是治療哮喘的關(guān)鍵，《景岳全書(shū)》[14]中曾指出：“痰為水，腎主水，痰之本在腎”，腎陽(yáng)乃體內(nèi)陽(yáng)氣之本源，陽(yáng)氣充盈，則肺氣充實(shí)，呼吸調(diào)暢;陽(yáng)氣不足，則肺氣瘀阻，氣喘乏力。淫羊藿作為重要的補(bǔ)腎陽(yáng)藥，對(duì)于腎虛型支氣管哮喘具有十分顯著的療效。其有效成分包括淫羊藿苷類、淫羊藿黃酮以及淫羊藿多糖等，針對(duì)哮喘的治療能夠發(fā)揮減輕支氣管炎癥反應(yīng)、抗氣道重塑、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答與減輕糖皮質(zhì)激素耐受性等藥理作用[15-17]。

氣道慢性炎癥反應(yīng)是哮喘的一個(gè)重要特征，主要表現(xiàn)為外界過(guò)敏原誘導(dǎo)的T輔助細(xì)胞向Th2型細(xì)胞極化，促使中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞增殖并釋放等細(xì)胞因子，引發(fā)I型超敏反應(yīng)。10個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)中節(jié)點(diǎn)度排在第1、2位的IL-6與TNF均為哮喘病程中的強(qiáng)炎癥介質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)IL-6可在多種炎性刺激和細(xì)胞因子的作用下參與JAK-STAT通路內(nèi)的炎癥反應(yīng)信號(hào)傳遞，導(dǎo)致Janus酪氨酸激酶家族的信號(hào)傳導(dǎo)因子（JAK1、JAK2等）及STAT1、STAT3等轉(zhuǎn)錄激活因子磷酸化，進(jìn)一步加重氣道炎癥反應(yīng)[18];TNF是引發(fā)哮喘炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白，在哮喘發(fā)病時(shí)可激活下游的核因子-κB等信號(hào)通路促使炎癥介質(zhì)的釋放與募集、炎性小體的形成，誘發(fā)炎癥介質(zhì)[19]。課題組前期研究證實(shí)中藥淫羊藿可下調(diào)JAKs/STATs蛋白磷酸化水平，減少IL-6等炎癥介質(zhì)釋放，從而與地塞米松協(xié)同改善哮喘炎癥反應(yīng)[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)肺組織損傷的模型大鼠經(jīng)淫羊藿苷干預(yù)后TNF-α表達(dá)量顯著減少，而觀察圖7生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚等活性成分與IL-6、TNF直接相連，因此推測(cè)淫羊藿中存在多種成分能夠降低TNF-α水平、減少IL-6等相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放以發(fā)揮哮喘抗炎作用[20]。

10個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)除IL-6、TNF外，其余大部分均為哮喘的重要炎性介導(dǎo)因子與趨化因子，如CXCL8、IL1B、CCL2等，其中尤其值得關(guān)注的是PTGS2（環(huán)加氧酶-2），其節(jié)點(diǎn)度在10個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)中排名第4，而結(jié)果顯示以PTGS2為靶標(biāo)的成分涵蓋了23個(gè)全部活性成分中的17個(gè)，即淫羊藿中大多數(shù)成分均能作用于此靶標(biāo)。比較于健康狀態(tài)，哮喘發(fā)生時(shí)氣道上皮和黏膜下層的PTGS2通過(guò)快速表達(dá)并釋放PGE（前列腺素E）等遞質(zhì)引發(fā)炎癥反應(yīng)加重[21]。據(jù)報(bào)道木犀草素、山柰酚可有效下調(diào)哮喘模型中的PTGS2表達(dá)量[22-23]，而上述2種天然化合物均為淫羊藿中的主要成分，同時(shí)存在于活性化合物-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以此說(shuō)明PTGS2可能為淫羊藿對(duì)抗炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要因子。

氣道重塑是哮喘的另一個(gè)顯著特征，指的是哮喘發(fā)病時(shí)氣道內(nèi)多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能上的惡性變化，如氣道上皮細(xì)胞衰老與脫落、氣道平滑肌異常增殖與增厚等。本研究的GO與KEGG通路結(jié)果提示，核因子-κB信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡與衰老等信號(hào)通路廣泛參與了氣道重塑的發(fā)展過(guò)程，包括調(diào)節(jié)氣道細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、衰老、凋亡與自噬等生物進(jìn)程。作為關(guān)鍵靶標(biāo)的CASP3是細(xì)胞內(nèi)源性凋亡信號(hào)的發(fā)起者之一，被激活后可介導(dǎo)下游凋亡與自噬反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)還可與抑制因子X(jué)IAP（X-linked Inhibitors of Apoptosis Proteins）發(fā)生拮抗以共同維持凋亡活性穩(wěn)態(tài)[24]，與此類似的還有Bcl-2/Bax凋亡平衡體系，Bcl-2可在核因子-κB等信號(hào)通路的誘導(dǎo)下，與凋亡的正調(diào)控因子Bax協(xié)同調(diào)控凋亡活性[25]。前期研究結(jié)果顯示，哮喘大鼠經(jīng)淫羊藿干預(yù)后肺組織凋亡活性上調(diào)，使氣道重塑癥狀得到緩解[6]。此外，VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-α）、EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）也是本研究結(jié)果的關(guān)鍵靶標(biāo)，前者可促使血管生成與血管壁增厚，后者與多種氣道細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)調(diào)控有關(guān)[26-27]。以上證明，淫羊藿通過(guò)作用于CASP3、VEGFA、EGFR等關(guān)鍵蛋白與多條相關(guān)通路，進(jìn)而改變不同氣道細(xì)胞的不同生長(zhǎng)狀態(tài)以改善氣道重塑。

此次淫羊藿中的關(guān)鍵靶標(biāo)和通路結(jié)果顯示其在抗炎與抗氣道重塑兩方面的顯著活性，從宏觀的角度為進(jìn)一步深入研究淫羊藿的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供了參考依據(jù)，然而單純地基于網(wǎng)絡(luò)模型、藥靶對(duì)接與數(shù)據(jù)分析無(wú)法完全評(píng)價(jià)藥物在體內(nèi)的具體代謝過(guò)程，故仍需借助進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

[1]Hadjigol S，Netto KG，Maltby S，et al.Lipopolysaccharide induces steroid-resistant exacerbations in a mouse model of allergic airway disease collectively through IL-13 and pulmonary macrophage activation[J].Clinical & Experimental Allergy，2020，50（1）：82-94.

[2]Mims，James W.Asthma：definitions and pathophysiology[J].International Forum of Allergy & Rhinology，2015，5（S1）：S2-S6.

[3]Heffler E，Lorena NGM，F(xiàn)errando M，et al.Inhaled Corticosteroids Safety and Adverse Effects in Patients with Asthma[J].J Allergy Clin Immunol Pract，2018，6（3）：776-781.

[4]萬(wàn)亞寧，李雙蕾，蔣云霞，等.淫羊藿及其復(fù)方制劑治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2019，25（5）：713-716.

[5]唐秀鳳，李曉曦，年宏蕾，等.淫羊藿女貞子影響激素干預(yù)哮喘大鼠與炎性因子相關(guān)的pJAKs/pSTATs的研究[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2018，11（2）：172-177.

[6]馬紫童，唐秀鳳，高瑩瑩，等.淫羊藿女貞子配伍協(xié)同激素對(duì)哮喘大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2019，28（6）：941-944，957.

[7]Zhang W，Xue K，Gao Y，et al.Systems pharmacology dissection of action mechanisms of Dipsaci Radix for osteoporosis[J].Life Sci，2019，235：116820.

[8]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：327-328.

[9]王強(qiáng).基于網(wǎng)絡(luò)藥理及分子對(duì)接探討斷藤益母湯靶向MAP3K2治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2019.

[10]劉錢，賀楨翔，楊慧，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接法探索肺毒清治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的潛在活性成分[J].中草藥，2020，51（7）：1713-1722.

[11]袁文鋒，涂銘揚(yáng)，陳超，等.基于分子對(duì)接及生物網(wǎng)絡(luò)功能模塊識(shí)別的復(fù)方丹參滴丸的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2017，52（9）：743-749.

[12]Zippo AG，Gelsomino G，Van Duin P，et al.Small-world networks in neuronal populations：a computational perspective[J].Neural Netw，2013，44：143-156.

[13]趙志翔，石克華，折哲，等.平喘湯聯(lián)合孟魯司特鈉治療支氣管哮喘慢性持續(xù)期療效觀察[J].河北中醫(yī)，2018，40（5）：737-740.

[14]李慧，周慶偉.溫補(bǔ)腎陽(yáng)法在支氣管哮喘減撤糖皮質(zhì)激素階段的應(yīng)用[J].中醫(yī)研究，2019，32（8）：6-9.

[15]Hu L，Li L，Zhang H，et al.Inhibition of airway remodeling and inflammatory response by Icariin in asthma[J].BMC Complement Altern Med，2019，19（1）：316.

[16]Qin T，Ren Z，Yi L，et al.Immunological modulation effects of an acid Epimedium polysaccharide on immune response in chickens[J].Int Immunopharmacol，2019，70：56-66.

[17]Sun S，Liu L，Tian X，et al.Icariin Attenuates High Glucose-Induced Apoptosis，Oxidative Stress，and Inflammation in Human Umbilical Venous Endothelial Cells[J].Planta Med，2019，85（6）：473-482.

[18]Jevnikar Z，stling J，Ax E，et al.Epithelial IL-6 trans-signaling defines a new asthma phenotype with increased airway inflammation[J].J Allergy Clin Immunol，2019，143（2）：577-590.

[19]Shi F，Zhang Y，Qiu C，et al.Effects of inhaled corticosteroids on the expression of TNF family molecules in murine model of allergic asthma[J].Exp Lung Res，2017，43（8）：301-310.

[20]鞠靜，彭玲玲，潘宇政，等.淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ對(duì)氣管切開(kāi)模型大鼠肺組織病理學(xué)及炎癥因子的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2019，27（3）：305-310.

[21]Yucesoy B，Kashon ML，Johnson VJ，et al.Genetic variants in TNFα，TGFB1，PTGS1 and PTGS2 genes are associated with diisocyanate-induced asthma[J].J Immunotoxicol，2016，13（1）：119-126.

[22]鄒華，王穎，秦曉宇，等.木犀草素通過(guò)抗氧化應(yīng)激和抑制COX-2信號(hào)通路抑制哮喘幼鼠氣道炎癥[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，2019，25（6）：634-636.

[23]Kang DR，Belal SA，Choe HS，et al.Effect of Kaempferol on Cyclooxygenase 2（Cox2）and Cytosolic Phospholipase A2（cPLA2）Protein Expression in BALB/c Mice[J].Iranian journal of allergy，asthma，and immunology，2018，17（5）：428-435.

[24]Yosefzon Y，Soteriou D，F(xiàn)eldman A，et al.Caspase-3 Regulates YAP-Dependent Cell Proliferation and Organ Size[J].Mol Cell.2018，70（4）：573-587.

[25]Mineev VN，Nesterovich II，Trofimov VI，et al.Evaluating the activity of the apoptosis-regulating genes from Bcl-2，Bax expression，and caspase-3 activity in bronchial epithelial cells in patients with asthma[J].Arkh Patol，2011，73（1）：11-14.

[26]Shen X，Pasha MA，Hidde K，et al.Group 2 innate lymphoid cells promote airway hyperresponsiveness through production of VEGFA[J].J Allergy Clin Immunol，2018，141（5）：1929-1931.

[27]朱婷，王瑾，陳海華，等.支氣管哮喘患者血清中VEGF、EGF等相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)及與臨床表型、肺功能以及病情程度相關(guān)性研究[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2017，24（12）：1345-1350.

（2020-06-10收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81873115）;國(guó)家中醫(yī)藥管理局全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目（國(guó)中醫(yī)藥人教函〔2018〕134號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：王瀚（1997.07—），男，碩士研究生在讀，研究方向：中藥及復(fù)方的藥效及作用機(jī)制研究，E-mail：wh_1_1@163.com

通信作者：楊麗平（1971.11—），女，本科，副研究員，研究方向：中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，E-mail：yanglpwj@163.com

;劉仁慧（1974.07—），女，醫(yī)學(xué)博士，教授，研究方向：中藥配伍機(jī)制研究，E-mail：gzblrh45@ccmu.edu.cn