朱禮坪，黃澤彬，李 東，黃小茉,3*，謝小保,3

1.廣東迪美生物技術(shù)有限公司，廣東廣州 510663；2.廣東省防霉抗菌工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510070；3.廣東省微生物研究所省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070

苯氧乙醇從20世紀(jì)80年代中期開始廣泛應(yīng)用于化妝品配方中，是一種高沸點(diǎn)、低揮發(fā)性溶劑，還是一種高效、低致敏、廣譜的殺菌防腐劑。苯氧乙醇與常見化妝品防腐劑或抗氧劑復(fù)配使用可有效地抑制或殺滅銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌、黑曲霉和大腸桿菌等[1]。羥肟酸類化合物是一種對(duì)金屬離子具有高效選擇性的螯合劑，而辛酰羥肟酸在化妝品中可與原料或水中有害的金屬離子絡(luò)合，能抑制這些金屬離子的活性，防止對(duì)產(chǎn)品或原料造成渾濁、氧化、變色等不良影響，有利于延長(zhǎng)化妝品原料或成品的保質(zhì)期[2]。近年來，由于辛酰羥肟酸在眾多國(guó)家中安全性及其在全球化妝品法規(guī)管理中除澳大利亞NICNAS專門對(duì)辛酰羥肟酸在最大使用濃度不超過0.3%的情況外，其他國(guó)家對(duì)它的使用并無使用限制說明[3-5]。專利號(hào)CN102920612A[6]報(bào)道，苯氧乙醇與辛酰羥肟酸復(fù)配時(shí)更可達(dá)廣譜抑菌殺菌效果。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范[S]北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2015年第4版》中苯氧乙醇的含量測(cè)定方法為：流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸二氫鈉+甲醇+乙腈(50+35+15)，加氯化十六烷三甲胺至最終濃度為0.002 mol/L，并用磷酸調(diào)pH至3.5，該方法需要用到緩沖鹽使其操作復(fù)雜、損耗色譜柱使色譜柱壽命降低且檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)?，F(xiàn)如今對(duì)于辛酰羥肟酸的檢測(cè)方法中，廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院莫庭源等研究報(bào)道的方法為：甲醇+0.1%甲酸水溶液(55+45體積比)，該方法需要使用緩沖鹽同理不推薦[7]。還有廣州立白企業(yè)集團(tuán)有限公司、廣州芭薇生物科技有限公司對(duì)化妝品中辛酰羥肟酸含量進(jìn)行了分析，方法中分別以乙腈∶水=55∶45(體積比)、乙腈∶水=45∶55(體積比)進(jìn)行檢測(cè)分析[8、9]。經(jīng)驗(yàn)證，該方法在化妝品中辛酰羥肟酸出峰時(shí)間會(huì)與苯氧乙醇出峰時(shí)間完全一致或有重疊峰而造成干擾，會(huì)影響目標(biāo)物質(zhì)的定性和定量。因此，開發(fā)不使用緩沖鹽，可以減少其對(duì)色譜柱的損耗且檢測(cè)效率提高，并使化妝品中辛酰羥肟酸和苯氧乙醇峰型分離度高，簡(jiǎn)單可靠，線性范圍寬，抗干擾能力強(qiáng)，具有良好的精確度和精密度的檢測(cè)方法具有重要市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。

本方法選用甲醇/乙腈/水為流動(dòng)相，擬建立起同時(shí)精確檢測(cè)化妝品中苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的含量，并對(duì)其線性范圍、精確度、回收率和兩種成分的抑菌防腐性能作分析研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

儀器：HPLC-20A高效液相色譜儀、SPD-M20A 230V型光電二極管陣列可見光檢測(cè)器(日本島津公司)；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XW-80A旋渦混合器(上海淇特分析儀器有限公司)；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；超純水機(jī)；ME204E/02型萬分之一電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

試劑：乙腈、甲醇，色譜純，上海安譜廣州分公司；苯氧乙醇、辛酰羥肟酸原料(市售)。

1.2 儀器工作條件

島津InertSustain C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫40 ℃；流動(dòng)相∶甲醇∶乙腈∶水=35∶15∶50，流速：1 ml/min；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；柱溫：40 ℃。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別準(zhǔn)確稱量取苯氧乙醇、辛酰羥肟酸，用甲醇溶解，定容到100 mL容量瓶。配置成濃度為1.0×10-3mol/L的儲(chǔ)備液，放置于4 ℃冰箱中保存。將苯氧乙醇和辛酰羥肟酸儲(chǔ)備液用HPLC級(jí)甲醇稀釋，并配制成含有苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液。苯氧乙醇濃度分別為1.0×10-5mol/L、5.0×10-5mol/L、1.0×10-4mol/L、5.0×10-4mol/L和1.0×10-3mol/L;辛酰羥肟酸濃度分別為5.0×10-5mol/L、1.0×10-4mol/L、5.0×10-4mol/L、1.0×10-3mol/L和5.0×10-2mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 提取

水樣、面膜液、護(hù)理液、膏霜試驗(yàn):稱取0.5 g(精確到0.001 g)試驗(yàn)置于15 mL尖底離心管中，用甲醇定容至10 mL，于旋渦振蕩器上振蕩均勻后，超聲提取40 min,繼續(xù)旋渦振蕩器上振蕩均勻后于離心機(jī)以10 000 r/min離心10 min。上機(jī)分析前使用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾，濾液作為待測(cè)樣液備用。

1.5 樣品微生物防腐性能實(shí)驗(yàn)測(cè)試

分別在面膜液、護(hù)理液、膏霜三種化妝品中添加1 000 mg/kg苯氧乙醇和500 mg/kg辛酰羥肟酸，然后按廣東省日化商會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/GDDC 010-2019《化妝品防腐挑戰(zhàn)測(cè)試方法》測(cè)試產(chǎn)品的防腐功效。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

苯氧乙醇和辛酰羥肟酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1，由圖可見，苯氧乙醇的峰保留時(shí)間于5.0 min左右，而辛酰羥肟酸的峰保留時(shí)間于6.3 min左右，兩原料的出峰時(shí)間相差較大，無出現(xiàn)重疊干擾。

圖1 苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的色譜圖

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)與方式選擇

取配置好的苯氧乙醇和辛酰羥肟酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在190 nm～500 nm檢測(cè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，測(cè)定苯氧乙醇和辛酰羥肟酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外-可見吸收光譜(如圖2和圖3所示)，苯氧乙醇、辛酰羥肟酸分別在215 nm、200 nm附近有強(qiáng)吸收峰，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)分析采用210 nm可以獲得較高靈敏度，干擾較少。因此選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

圖2 苯氧乙醇光譜圖

圖3 辛酰羥肟酸光譜圖

2.3 流動(dòng)相選擇

分別考察了甲醇/水、乙腈/水、甲醇/乙腈/水溶液等多種流動(dòng)相中苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的分離情況。結(jié)果表明，采用甲醇/水為流動(dòng)相，只有苯氧乙醇出峰；選擇乙腈/水溶液為流動(dòng)相時(shí)，其體積比不同分離度差別較大，在乙腈流動(dòng)相大于50%時(shí)，苯氧乙醇和辛酰羥肟酸峰型完全重疊，小于50%時(shí)，分離度會(huì)高一點(diǎn)，但是有重疊峰造成干擾,因此,乙腈/水流動(dòng)相影響目標(biāo)物質(zhì)的定性和定量；使用甲醇/乙腈/水的流動(dòng)相，目標(biāo)物質(zhì)分離效果好且獲得最佳UV響應(yīng)，最佳分離條件為甲醇∶乙腈∶水=35∶15∶50等梯度洗脫。

2.4 檢出限與定量限

取一定濃度的混合對(duì)照品溶液用液相色譜儀進(jìn)行測(cè)試，記錄色譜圖，根據(jù)其峰信號(hào)，將信噪比為3∶1時(shí)的進(jìn)樣量為檢出限，測(cè)得苯氧乙醇的檢出限為5 mg/L、辛酰羥肟酸的檢出限為10 mg/L。信噪比為10∶1時(shí)的進(jìn)樣量為檢出限，測(cè)得苯氧乙醇的定量限為15 mg/L、辛酰羥肟酸的檢出限為50 mg/L。

2.5 線性范圍考察

各梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后按“1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,每個(gè)濃度進(jìn)樣3次,取3次平均值,所得色譜峰對(duì)應(yīng)的濃度和對(duì)應(yīng)的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程,如表1所示。結(jié)果表明,苯氧乙醇和辛酰羥肟酸線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0。

表1 苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取面膜液、膏霜樣品各6份，每份約0.5g，按“1.4.1”項(xiàng)下操作,照“2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析,記錄峰面積并計(jì)算含量,結(jié)果面膜液和膏霜中苯氧乙醇和辛酰羥肟酸平均含量分別為0.1%,0.05%，RSD分別為0.23%，0.48%(n=6)，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別將待測(cè)樣品溶液在室溫下放置，分別在白天、夜間和第二天白天按照“2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析,記錄峰面積并計(jì)算含量,計(jì)算RSD。結(jié)果顯示,RSD均小于0.05%(n=6),表明兩種防腐劑在室溫下放置24 h的穩(wěn)定性好。

2.8 回收率和精密度試驗(yàn)

取液態(tài)水基、面膜液、護(hù)理液類、膏霜類4種空白基質(zhì)為加標(biāo)基質(zhì)，按“2.1”色譜條件下進(jìn)行低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平的回收率試驗(yàn)，結(jié)果顯示，苯氧乙醇的3個(gè)加標(biāo)水平回收率為97.2%～104.4%,辛酰羥肟酸的3個(gè)加標(biāo)水平回收率為98.2%～104.5%(n=6),表明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可滿足苯氧乙醇和辛酰羥肟酸含量測(cè)定的要求(見表2)。

表2 辛酰羥肟酸、苯氧乙醇的回收率和精密度(n=6)測(cè)定結(jié)果

2.9 實(shí)際樣品檢測(cè)

隨機(jī)抽取市售的水劑類、乳液類、膏霜類化妝品各10份,應(yīng)用本文建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，結(jié)果顯示，部分苯氧乙醇添加量為0.1%～0.3%，辛酰羥肟酸添加量為0.03%～0.08%。選取乳液類化妝品樣品色譜圖如圖4。

圖4 乳液類化妝品樣品色譜圖

2.10 樣品的抑菌防腐性能分析

含1 000 mg/kg苯氧乙醇和500 mg/kg辛酰羥肟酸的面膜液、護(hù)理液、膏霜對(duì)微生物防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果如圖5所示，在106CFU/g～107CFU/g高濃度菌種中加入樣品7 d內(nèi)，其菌落總數(shù)均降低至<10 CFU/g，而通過測(cè)試辛酰羥肟酸的最低抑菌濃度(MIC)，單獨(dú)辛酰羥肟酸對(duì)各常見菌種最低抑菌濃度均于800 mg/kg ～1 000 mg/kg，在化妝品中做防腐使用成本較高，而單使用苯氧乙醇作防腐劑不僅添加量大，且氣味大，因此，苯氧乙醇和辛酰羥肟酸復(fù)配作化妝品防腐劑是具有較高性價(jià)比、滿足市場(chǎng)需求的實(shí)用方案，而本文研究的檢測(cè)方法可以精確、快速同時(shí)檢測(cè)苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的含量，且避免兩成分在檢測(cè)中相互干擾，為市場(chǎng)化妝品中防腐劑成分含量檢測(cè)起重要作用。

圖5 面膜液、護(hù)理液、膏霜樣品微生物防腐挑戰(zhàn)測(cè)試結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過研究流動(dòng)相組成對(duì)兩種原料原料色譜保留性能的影響，克服峰重疊干擾問題，采用甲醇-乙腈-水溶液為流動(dòng)相，反相液相色譜法檢測(cè)化妝品中的苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的含量，檢測(cè)下限分別為5mg/L和20 mg/L。方法的回收率為97.2%～104.5%，RSD為1.5%～4.1%，說明該方法色譜峰分離度高且對(duì)稱，檢測(cè)方便快捷，結(jié)果精密度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。此外，本文提供化妝品中苯氧乙醇和辛酰羥肟酸復(fù)配的抑菌防腐性能活性含量分析結(jié)果，為滿足市場(chǎng)需求的使用提供參考方案。