劉 冰，胡詩藝，熊紫瑩，韋 雪，周化嵐，張建國

上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院 食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093

畢赤酵母(Komagataellaphaffii,曾命名Pichiapastoris) 是能夠利用甲醇作為唯一碳源生長的甲基營養(yǎng)型微生物，是目前一種重要的表達(dá)外源蛋白的工業(yè)微生物[1]。其過氧化酶體中的醇氧化酶1(AOX1)和醇氧化酶2(AOX2)將甲醇氧化為甲醛。醇氧化酶對甲醇和氧氣的親和力比較低[2,3]，因此，需要大量的醇氧化酶來代謝甲醇。但是PAOX1和PAOX2都受甲醇嚴(yán)格調(diào)控，調(diào)控機(jī)制相同[4,5]。畢赤酵母在含有葡萄糖、乙醇、甘油等碳源的培養(yǎng)基中生長時(shí)，PAOX1和PAOX2都被抑制，細(xì)胞中無法檢測到AOX1和AOX2的mRNA[2,6-7]。PAOX1和PAOX2在甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中表達(dá)。由于醇氧化酶2啟動(dòng)子(PAOX2)比醇氧化酶1啟動(dòng)子(PAOX1)弱，導(dǎo)致AOX2的含量只占總醇氧化酶量的5%[6,7]。AOX1的基因序列(aox1)和AOX2的基因序列(aox2)高度同源，但它們的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA序列沒有同源性。醇氧化酶啟動(dòng)子強(qiáng)度的差異是由醇氧化酶啟動(dòng)子上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列控制，若將aox2置于PAOX1控制下，重組菌株具有AOX1相似的活力。相反，若將aox1置于PAOX2控制下，AOX1的表達(dá)量顯著下降[6]。目前PAOX1因其調(diào)控嚴(yán)格，表達(dá)能力強(qiáng)等原因而被廣泛研究[8-14]，但是依然沒有明確其調(diào)控序列。而PAOX2的上游調(diào)控序列相關(guān)信息更少[15,16]。因此，突變PAOX2這樣的弱啟動(dòng)子會(huì)比強(qiáng)啟動(dòng)子PAOX1更容易實(shí)現(xiàn)外源蛋白表達(dá)量的升高[17]。而且，研究PAOX2的上游調(diào)控序列較易得到相關(guān)調(diào)控序列，有利于闡明醇氧化酶啟動(dòng)子的調(diào)控序列。OHI 等[15]對畢赤酵母PAOX2上游調(diào)控序列進(jìn)行敲除和插入序列，鑒定出PAOX2的一個(gè)上游激活序列(UAS)和兩個(gè)上游抑制序列(URS)。其中UAS與PAOX1的UAS相似。另外，戴秀玉[18]等從aox1基因缺陷菌株Muts中篩選得到Mut+表型突變體，經(jīng)過測序后發(fā)現(xiàn)PAOX2的突變增強(qiáng)了aox2基因的轉(zhuǎn)錄，因此可以通過改變PAOX2的上游調(diào)控區(qū)域來改善aox1基因缺陷菌株利用甲醇的能力,使其在基因工程藥物表達(dá)及產(chǎn)業(yè)化方面發(fā)揮重要作用。

本研究以GH11家族的黑曲霉木聚糖酶(Xylanase，xynB)[19,20]作為外源蛋白的模型，對PAOX2上游調(diào)控序列進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建了PAOX2突變型畢赤酵母文庫，根據(jù)表達(dá)木聚糖酶酶活的差別，篩選突變菌株并對其PAOX2進(jìn)行測序，最后分析突變位置對PAOX2表達(dá)能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

本研究實(shí)驗(yàn)的生化試劑盒、主要儀器見表1。

表1 試劑和儀器

1.2 載體及菌株

質(zhì)粒pPIC9K、pPIC9K-PAOX2-xynB由實(shí)驗(yàn)室保藏；大腸桿菌Top 10購自TaKaRa公司；畢赤酵母 GS115菌株由實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.3 培養(yǎng)基與溶液的配制

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基：稱取1 g蛋白胨、0.5 g酵母粉、1 g氯化鈉，溶于100 mL去離子水水中，調(diào)整pH至7.0。如制作平板，則加入1.5 g瓊脂粉。121 ℃高壓滅菌15 min。

Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD)培養(yǎng)基：稱取1 g 酵母粉、2 g蛋白胨、2 g葡萄糖，溶于100 mL去離子水中。如需固體培養(yǎng)基，則加入1.5 g瓊脂粉。115 ℃高壓滅菌20 min。配置好的YPD培養(yǎng)基于室溫存放，平板置于4 ℃儲(chǔ)存。

Minimal Dextrose(MD)培養(yǎng)基：稱取1.34 g YNB、2 g葡萄糖、1.5 g瓊脂粉(配制平板時(shí)添加)溶解于100 mL去離子水中，115 ℃高壓滅菌20 min。使用前加入200 μL濃度為4×10-5g/L的無菌生物素。配置好的培養(yǎng)基于室溫存放，平板置于4 ℃冰箱存放。

磷酸鹽緩沖液 (PBS)：稱取8 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀、3.63 g十二水合磷酸氫二鈉、0.24 g磷酸二氫鉀，溶解于900 mL去離子水中，用鹽酸調(diào)整pH，室溫存放。

Buffered Glycerol-complex (BMGY)培養(yǎng)基：稱取酵母粉1 g、蛋白胨2 g溶解于70 mL 去離子水中，115 ℃高壓滅菌20 min。量取10 mL 1 mol/L PBS緩沖液(pH視情況調(diào)整)，115 ℃高壓滅菌20 min。稱取1.34 g YNB溶解于10 mL去離子水中，115 ℃高壓滅菌20 min。稱取1.26 g甘油溶解于9 mL 去離子水中，115 ℃高壓滅菌20 min。上述四種滅菌試劑于室溫存放，使用前將其混合到一起并加入200 μL無菌的 4×10-5g/L 生物素，充分混勻。

檸檬酸-磷酸緩沖溶液：稱取2.9244 g磷酸氫二鈉、2.04 g檸檬酸溶解于200 mL去離子水中，充分溶解混勻后則制成pH為5.0，濃度為50 mmol/L的檸檬酸-磷酸緩沖溶液，室溫存放。

木聚糖溶液：將1 g木聚糖溶解于100 mL pH為5.0，濃度為50 mmol/L的檸檬酸-磷酸緩沖溶液中，充分混勻制成1% 的木聚糖溶液。由于木聚糖溶液穩(wěn)定性不高，應(yīng)盡量在使用前配制，室溫存放。

木糖溶液：準(zhǔn)確稱量分析純的無水木糖100 mg(預(yù)先在105 ℃干燥至恒重)，加入少量去離子水溶解，定容至100 mL，充分搖勻后即獲得濃度為1 mg/mL的木糖溶液。

DNS：將1.071 g/mL的苯酚于50 ℃充分融化，稱取91.1 g酒石酸鉀鈉、3.15 g 3,5-二硝基水楊酸溶解于去離子水中，加入10.5 g氫氧化鈉和2.33 mL融化的苯酚，再加入2.5 g偏重亞硫酸鈉，將溶液定容至500 mL。配制好的溶液應(yīng)存放于4 ℃，并于配好后7 d使用，有效期為6個(gè)月。

1.4 PAOX2序列的隨機(jī)突變

以重組質(zhì)粒pPIC9K-PAOX2-xynB為模板，TB-AOX2-F/R (TB-AOX2-F：5′-tcgagatctgagctcgaattctttt-3′；TB-AOX2-R：5′-tctcatcgtttggatccttttctcagt-3′)為引物，利用Diversify?隨機(jī)突變試劑對PAOX2進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性30 s，54 ℃退火延伸96 s，共循環(huán)25次；最后再54℃延伸100 s，4℃冷卻。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳分析，并利用PCR清潔試劑盒對隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。

重組質(zhì)粒pPIC9K-PAOX2-xynB經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH 1和EcoR 1消化后，回收雙酶切位點(diǎn)BamH 1之間的片段(593 bp)以及酶切位點(diǎn)BamH 1和EcoR 1之間的片段(8 295 bp)，然后利用T4連接酶對以上兩個(gè)片段進(jìn)行連接(16 ℃連接4 h)。利用PCR清潔試劑盒對T4酶連接后的產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后利用In-fusion技術(shù)對純化后的連接產(chǎn)物與突變后的PAOX2片段進(jìn)行連接。然后將此連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP 10感受態(tài)中，并在含有氨芐的抗性平板上篩選。將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中12 h～16 h，待平板上長出單菌落之后挑取單菌落，以TB-AOX2-F/R為引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證并測序，測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.5 PAOX2突變型畢赤酵母的構(gòu)建和培養(yǎng)

PAOX2突變后的重組質(zhì)粒經(jīng)Sal1酶切線性化后，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母 GS115感受態(tài)細(xì)胞后涂MD平板培養(yǎng)基。MD平板培養(yǎng)基經(jīng)30℃培養(yǎng)至長出單菌落，分別挑取突變型畢赤酵母單菌落接種于50 mL YPD培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。將突變型畢赤酵母種子液按4%的接種量接種到20 mL BMGY培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)48 h，使其培養(yǎng)基中的甘油耗盡，此時(shí)添加1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，之后每隔24 h補(bǔ)加1%甲醇，共誘導(dǎo)96 h。在每次補(bǔ)加甲醇之前將發(fā)酵液充分吸打混勻，然后取樣。最后于4 ℃，12 000 g條件下離心發(fā)酵液10 min。收集上清，測定樣品中的木聚糖酶酶活。每株菌株的誘導(dǎo)設(shè)計(jì)三個(gè)平行樣。

1.6 木聚糖酶酶活力定義及測定方法

向2 mL 1% 的木聚糖溶液中加入20 μL 發(fā)酵液離心上清(空白對照組用去離子水代替)，迅速吸打混勻后，50 ℃水浴5 min。迅速加入2 mL DNS溶液和1 mL 水后吸打混勻，100 ℃水浴 10 min 顯色。然后迅速取出加入去離子水定容至20 mL。充分混勻后，利用酶標(biāo)儀在540 nm處測定光吸收值，最后計(jì)算每個(gè)樣品的酶活。每個(gè)反應(yīng)測定三個(gè)平行樣。木聚糖酶酶活力單位的定義為：在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每分鐘水解1%木聚糖形成1 μmol/L木糖(還原糖)所需酶量為1個(gè)酶活力單位[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAOX2的隨機(jī)突變及PAOX2突變型畢赤酵母的構(gòu)建

通過改變PCR反應(yīng)中Mn2+和dGTP的量來控制隨機(jī)突變水平，對PAOX2進(jìn)行隨機(jī)突變。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳分析顯示突變后的PAOX2大小約為1 550 bp(圖1-a)。重組質(zhì)粒pPIC9K-PAOX2-xynB被BamH 1酶和EcoR 1消化后，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析顯示酶切產(chǎn)物共有三個(gè)片段，大小分別約為 8 300 bp，1 500 bp和600 bp(圖1-b)。將雙酶切位點(diǎn)BamH 1之間的片段(593 bp)以及酶切位點(diǎn)BamH 1和EcoR 1之間的片段(8 295 bp)進(jìn)行T4連接，連接產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示其大小約為8 900 bp(圖1-c)。T4連接產(chǎn)物與突變后的PAOX2片段經(jīng)In-fusion技術(shù)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑取9株大腸桿菌進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖1-d所示，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示其大小約為1 600 bp。測序顯示其中4株菌株的PAOX2已經(jīng)發(fā)生突變，表示約有50%的片段已發(fā)生突變，說明成功構(gòu)建了pPIC9K-PAOX2-xynB啟動(dòng)子突變文庫。

圖1 PAOX2突變質(zhì)粒的構(gòu)建

將啟動(dòng)子突變型重組質(zhì)粒酶切后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，即獲得了PAOX2突變型畢赤酵母文庫(圖2)。

圖2 PAOX2突變型畢赤酵母

2.2 PAOX2突變型畢赤酵母的篩選

以野生型PAOX2為啟動(dòng)子的重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-PAOX2-xynB為對照組，挑取了850株P(guān)AOX2啟動(dòng)子突變型畢赤酵母進(jìn)行了培養(yǎng)。圖3展示了850株P(guān)AOX2突變型畢赤酵母表達(dá)木聚糖酶的活力，按照活力的高低分為6組。對照組酶活的0%～20%、20%～40%、40%～60%、60%～80%、80%～100%、100%～120%區(qū)間分別有207、58、43、44、260、238株突變型酵母菌。約有59%的突變菌株表達(dá)的木聚糖酶活力為對照組菌株的80%～120%，約有24%的突變菌株表達(dá)的木聚糖酶活力為對照組菌株的0%～20%，最后，約有17%的突變型菌株表達(dá)的木聚糖酶活力為對照組菌株的20%～80%，此區(qū)間內(nèi)的酶活顯著低于或稍微低于對照組菌株的酶活，這可能是由于突變造成了PAOX2表達(dá)木聚糖酶的能力下降。圖4展示了20%～40%、40%～60%和60%～80%三個(gè)組別的菌濃度，他們的OD600分別為29.45±2.24、30.02±4.22和28.79±3.44,菌濃度基本相同，說明此次PAOX2隨機(jī)突變對菌的生長沒有明顯影響。

圖3 不同表達(dá)量的菌株數(shù)量

圖4 20%～40%、40%～60%和60%～80%組別菌的濃度

2.3 畢赤酵母PAOX2上游調(diào)控序列分析

測序結(jié)果顯示共有兩株菌株(20-16和20-20)的PAOX2發(fā)生了突變，其與NCBI公布(模板質(zhì)粒的PAOX2已測序，顯示其與NCBI公布的PAOX2完全一致)的PAOX2序列比對結(jié)果(如圖5所示)。PAOX2共有1 550個(gè)堿基，突變型菌株20-16在702(即-849)位置發(fā)生堿基T的插入導(dǎo)致其表達(dá)木聚糖酶活力為對照組菌株的36%突變型菌株20-20在789(即-762)位置插入了堿基A，其表達(dá)木聚糖酶的酶活為對照組菌株的10%。OHI等[15]鑒定出一個(gè)上游激活元件(UAS)和兩個(gè)上游抑制元件(URS)。UAS位于PAOX2的-341至-273之間，其中，處于-337至-313位置的序列GATAGGCTATTTTTGTCGCATAAAT是PAOX2UAS的重要組成部分，且處于PAOX2的-293至-283之間的序列不參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，PAOX2不會(huì)因?yàn)榇似蔚娜笔Ф岣弑磉_(dá)能力。兩個(gè)URS分別位于PAOX2的-780至-342之間和-255至-215之間。本研究的結(jié)果表明在-849～-762之間的堿基序列也對PAOX2的轉(zhuǎn)錄有重要作用。

圖5 畢赤酵母PAOX2與測序菌株的PAOX2的比對結(jié)果

本研究中仍有大量未發(fā)生突變的PAOX2的片段導(dǎo)致木聚糖酶活力顯著下降，這可能由于大批量培養(yǎng)重組畢赤酵母可能會(huì)導(dǎo)致平行性出現(xiàn)較大差異，重組畢赤酵母表達(dá)木聚糖酶活力產(chǎn)生波動(dòng)。

3 結(jié)論

通過易錯(cuò)PCR的方式對PAOX2上游調(diào)控序列進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建了PAOX2突變文庫，篩選了850株重組菌。測序結(jié)果表明突變型菌株在-847插入堿基A或者-788插入堿基T分別使木聚糖酶活力下降為10%和36%。這說明-847 ～-788片段對PAOX2的轉(zhuǎn)錄有重要作用。