陶宏兵，楊 娟，鄧小鋒，葉子翠，施慶珊，謝小保，黃小茉*

1.廣東迪美新材料科技有限公司,廣東 肇慶 526238;2.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510070

龍膽草(Gentiana Scabra Bge)又名龍膽、地龍膽、草龍膽，為龍膽科植物。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，龍膽“主骨間寒熱，驚癇邪氣，定五臟，殺蠱毒?！?015版《中國(guó)藥典》一部明確，龍膽草“清熱燥濕，瀉肝膽火”。我國(guó)龍膽產(chǎn)業(yè)規(guī)?；?、產(chǎn)品系列化正在形成，傳統(tǒng)產(chǎn)品形式主要為藥用，起到抗菌、抗炎、健胃等功效[1,2]。近年隨著化妝品原料越來越崇尚天然，龍膽在化妝品中的應(yīng)用越來越多[3]。目前國(guó)內(nèi)化妝品植物原料應(yīng)用的較多的是以提取物形式加入，由于工藝的限制，提取物有效成分含量低，功效無法保證，且提取過程會(huì)添加較多醇類，違背了天然原料的初衷[4,5]。

本研究以龍膽草為發(fā)酵底物，利用微生物的發(fā)酵代謝作用，以龍膽苦苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)龍膽草進(jìn)行深層次的加工制備成龍膽酵素，采用自由基清除和透明質(zhì)酸酶抑制試驗(yàn)，驗(yàn)證其功效，為豐富龍膽草資源的化妝品應(yīng)用及酵素新產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍膽草：產(chǎn)自云南昆明；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC 2.3853:廣東省微生物菌種保藏中心；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CICC 21790：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose，YPD)，LB培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WJS1222F榨汁機(jī)，美的電器公司；UV200紫外分光光度計(jì)，廣州昂科生物科技有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋，上海琪特分析儀器有限公司；IS-RDS4恒溫?fù)u床，廣州儀新生物科技有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，上海恒科儀器有限公司，LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1龍膽酵素的制作

制作工藝：選取新鮮龍膽草，粉碎，按照料液比1∶10加入YPD培養(yǎng)基后滅菌，接入菌種發(fā)酵，靜置澄清，上清離心過濾得到龍膽酵素。

1.3.2龍膽酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

考慮各因素之間的交互影響，選擇L9(33)正交表，以A菌株菌株組合(釀酒酵母，植物乳桿菌，釀酒酵母+植物乳桿菌)、B發(fā)酵溫度(28 ℃，30 ℃和32 ℃)、C發(fā)酵時(shí)間(24 h，48 h和72 h)，設(shè)計(jì)3個(gè)因素3水平正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)后龍膽酵素中的龍膽苦苷含量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.3龍膽苦苷含量測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》2015版[6]，通過高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱Aglient TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)；流動(dòng)相：水-甲醇(75∶25V/V)，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器。

1.3.4透明質(zhì)酸酶抑制試驗(yàn)[7]

取0.1 mL 0.25 mmol/L CaCl2溶液和0.5 mL透明質(zhì)酸酶37 ℃保溫培養(yǎng)20 min，加入樣品液0.5 mL，37 ℃保溫培養(yǎng)20 min，加入0.5 mL透明質(zhì)酸納液，37 ℃保溫培養(yǎng)30 min，常溫放置5 min；加入0.1 mL 0.4 moL/L NaOH溶液和0.5 mL乙酰丙酮溶液，置于沸水中加熱15 min后立即用冰水冷卻5 min，加入埃爾利希試劑1.0 mL，放置20 min顯色，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值。

1.3.5自由基清除試驗(yàn)[8]

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

配置0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，用蒸餾水稀釋樣品成不同體積分?jǐn)?shù)(4%～28%)的待測(cè)樣。在酶標(biāo)板上，加入100 μL DPPH溶液和100 μL梯度樣品溶液，混勻，室溫避光靜置30 min，于λ=517 nm處測(cè)OD值。以無水乙醇作為空白對(duì)照，Vc(0.01 mg/mL～0.07 mg/mL)為陽性對(duì)照。

1.3.5.2 ·OH清除能力

對(duì)于范疇中心成員的確定，研究者有著不同的見解，其中宗守云(2011)在對(duì)“副”對(duì)名詞性成分的選擇和量詞范疇化的中心成員的研究中，得到中心成員的確定有著下四個(gè)特征標(biāo)準(zhǔn)：(1)中心成員類別的出現(xiàn)頻率很高；(2)從語言發(fā)展上看，中心成員類別在歷史上出現(xiàn)最早；(3)從性質(zhì)上看，它們是最簡(jiǎn)單最和諧的相配，具有簡(jiǎn)單性、具體性和客觀性特征，在認(rèn)知上處于中心地位；(4)從交際上看，范疇中心所代表的事物都是穩(wěn)固的，常用的事物，在思維上具有優(yōu)先性特征。這四個(gè)特征皆是從具體語料出發(fā)，從歷時(shí)和共時(shí)兩個(gè)維度結(jié)合人的認(rèn)知方式概括得出。因此，范疇中心是一個(gè)范疇最本質(zhì)的特征，有了這些特征才能開始去研究其擴(kuò)展和非典型成員。

將樣品稀釋成不同體積分?jǐn)?shù)(8%～56%)的待測(cè)樣。取50 μL 6 mmol/L FeSO4溶液，50 μL 6 mmol/L H2O2溶液，200 μL 龍膽酵素溶液，搖勻，靜置10 min，再加入50 μL 6 mmol/L水楊酸溶液，50 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，搖勻，37 ℃反應(yīng)30 min。于λ=510 nm處測(cè)OD值。用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇調(diào)零，Vc(0.01 mg/mL～0.07 mg/mL)為陽性對(duì)照。

將樣品稀釋成不同體積分?jǐn)?shù)(10%～70%)的待測(cè)樣，取0.5 mL樣品溶液與1.5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCI緩沖液(pH 8.2)混合，25 ℃水浴20 min，然后加入0.2 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚，反應(yīng)4 min，取濃鹽酸0.25 mL終止反應(yīng)。于λ=325 nm處測(cè)OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同發(fā)酵條件對(duì)龍膽酵素中龍膽苦苷含量的影響

為確定龍膽酵素發(fā)酵的各個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，選擇菌株組合(A)、發(fā)酵溫度(B)及發(fā)酵時(shí)間(C)，進(jìn)行3因素3水平L9(33)正交試驗(yàn)，以龍膽苦苷含量作為龍膽酵素發(fā)酵工藝參數(shù)的評(píng)判指標(biāo)，結(jié)果見表1。

表1 龍膽酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

菌株組合、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間這3個(gè)因素對(duì)應(yīng)的極差(R)為RC>RB>RA，從而得知影響龍膽酵素發(fā)酵的主次因素為發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度>菌株組合。由極差分析可知，龍膽酵素發(fā)酵的最佳方案為A3B2C2，即發(fā)酵菌株為釀酒酵母+植物乳桿菌、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為72 h。在此條件下重復(fù)驗(yàn)證3次，結(jié)果表明，龍膽酵素的龍膽苦苷含量達(dá)(1 823±21)μg/mL，此條件下的酵素營(yíng)養(yǎng)、抗敏舒緩效果更佳。

2.2 龍膽酵素對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制作用

圖1 龍膽酵素對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制作用

透明質(zhì)酸酶是能特異性分解透明質(zhì)酸(HA)的一種蛋白水解酶。HA是構(gòu)成細(xì)胞外和細(xì)胞間基質(zhì)的主要成分，被分解后會(huì)引起細(xì)胞脫顆粒和介質(zhì)滲漏，導(dǎo)致速發(fā)型過敏反應(yīng)的發(fā)生。龍膽酵素可以抑制透明質(zhì)酸酶活性，減少HA的分解，具有一定的抗敏止癢的功效[9]。

2.3 抗氧化能力

2.3.1DPPH清除能力

DPPH是一種穩(wěn)定的氮中心自由基，在517 nm處有較強(qiáng)吸收值，通常被用來評(píng)估檢測(cè)物質(zhì)的抗氧化性[10]。IC50指自由基清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品濃度，該值與物質(zhì)的抗氧化能力呈反比關(guān)系。圖2為不同濃度的龍膽酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力。龍膽酵素對(duì)DPPH自由基清除率從23.5%上升到77.5%。經(jīng)計(jì)算，龍膽酵素DPPH自由基的IC50為5%。PHILIPPE M等[11]研究表明，發(fā)酵物質(zhì)對(duì)自由基清除率表現(xiàn)出差異受原料、微生物和發(fā)酵液代謝產(chǎn)物的影響。

圖2 龍膽酵素對(duì)DPPH自由基清能力

圖3 龍膽酵素對(duì)·OH自由基清能力

圖4 龍膽酵素對(duì)自由基清能力

在體外抗氧化能力試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，龍膽酵素的抗氧化活性較好。這可能是因?yàn)?，在發(fā)酵過程中，龍膽酵素本身含有抗氧化成分如Vc等。除此之外，發(fā)酵過程中微生物使原料中的功能成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化，多種功能成分的協(xié)同作用使其總抗氧化活性增強(qiáng)，但其具體的生理作用仍需進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論