劉 佳，卜子晨，費 蘇，夏永軍，艾連中，王光強

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)是專性異型發(fā)酵乳酸桿菌，天然存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內(nèi)。其對腸黏膜具有很強的黏附能力，具有抑制病原菌，調(diào)節(jié)腸道菌群，增強宿主機體免疫功能等諸多優(yōu)良益生功能，對宿主腸道上皮組織再生和修復(fù)具有重要意義[1-5]。大量研究表明，益生菌發(fā)揮益生功效的關(guān)鍵在于其能夠黏附于宿主腸道粘膜細(xì)胞表面[6]。因此，篩選黏附力強的菌株，對其在宿主體內(nèi)的有效定植具有重要意義[7-8]。研究結(jié)果表明，可通過測定乳酸菌細(xì)胞表面理化性質(zhì)指標(biāo)(例如疏水性、自聚集能力和表面電荷量等)來反映其黏附能力的強弱[9]。VADILLO-RODRGUEZ V等[10]研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)ATCC4356和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)ATCC393的疏水性和黏附能力之間具有相關(guān)性。但不同菌株之間存在較大差異，黏附能力強弱與細(xì)胞表面理化性質(zhì)之間的相關(guān)性也存在很大差別。

目前評價乳酸菌黏附能力的模型當(dāng)中，使用最為廣泛的是體外細(xì)胞黏附模型。采用體外細(xì)胞模型來模擬人體腸道上皮細(xì)胞，常用的有CaCo-2、HT-29和IPEC-J2等[11-14]。HUANG 等[15]研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌MJLA1和乳酸桿菌BDBB2對C2BBe1的黏附能力與對Caco-2的黏附能力相似。薛超輝等[16]研究發(fā)現(xiàn)，所考察的5株益生菌可以競爭、排除和取代三種方式抑制腸道致病菌粘附HT-29。其中副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)M7的抑制效果最好，對3株致病菌的競爭性抑制粘附抑制率分別為93%、83%和87%。研究表明，通過菌株自身的凝聚力、細(xì)胞表面的疏水性以及與大腸桿菌的共聚性等指標(biāo)，能夠初篩出具有良好黏附性的菌株。因此，本文選擇常用的HT-29細(xì)胞評估模型，測定了羅伊氏乳桿菌的自聚能力、表面疏水性、與大腸桿菌的共聚性及對HT-29細(xì)胞黏附能力等指標(biāo)，并進(jìn)一步分析了這4個指標(biāo)之間的相關(guān)性，以篩選出黏附能力較強的羅伊氏乳桿菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

使用菌株為28株羅伊氏乳桿菌，編號為R1～R28，均通過小鼠糞便篩選獲得。

1.1.2試劑

甲醇、二甲苯均為國產(chǎn)分析純試劑；培養(yǎng)液胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶均購自GIBCO公司(紐約，美國)；二甲亞砜(Sigma，美國)；細(xì)胞孔板及細(xì)胞爬片購自耐思生物科技有限公司(無錫，中國)；革蘭氏染色試劑盒購自國藥(北京，中國)；HT-29細(xì)胞(上海蘭茉生物醫(yī)藥科技有限公司，上海)。

1.1.3培養(yǎng)基及緩沖液

固體MRS培養(yǎng)基和液體MRS培養(yǎng)基的配制參見文獻(xiàn)[12]。

PBS緩沖溶液：NaCl 8 g，Na2HPO41.56 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g，去離子水定容至1 000 mL，調(diào)pH至7.4，115 ℃滅菌20 min。

D-Hanks緩沖液：氯化鉀0.40 g、氯化鈉8.00 g、磷酸二氫鉀0.06 g、碳酸氫鈉0.35 g、十二水磷酸氫二鈉0.08 g，添加去離子水溶解并定容1 000 mL，調(diào)節(jié)溶液pH至7.2，滅菌條件：121 ℃滅菌15 min。滅菌后存放于細(xì)胞操作室。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，北京)；紫外分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司，上海)；超低溫冰箱(Thermo Scientific，美國)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Memmert，德國)；Bioscreen C全自動生長曲線分析儀(Oy Growth Curves Ab公司，芬蘭)。

1.3 方法

1.3.1乳桿菌的分離

從-80 ℃冰箱中取出28株羅伊氏乳桿菌R1～R28和植物乳桿菌AR326的保藏液，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一代，再挑單菌落液體活化一代后得到種子液。將種子液以1%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2羅伊氏乳桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

用NCBI的Blast程序?qū)?6S rRNA序列進(jìn)行相似性搜索，獲取相似性最高的典型菌株序列，然后用Clustal W對所得序列進(jìn)行比對，最后用MEGA7軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌自聚能力測定

按1%接種量將乳桿菌的種子液分別接種入新鮮MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。取5 mL菌液，8 000 r/min離心10 min，用滅菌后的PBS緩沖溶液重懸菌體，洗滌三次，然后在8 000 r/min下離心10 min。用PBS緩沖液重懸菌體，在波長600 nm處測吸光度A0。菌液常溫靜置5 h再次測吸光值A(chǔ)t。

自聚性(%)=[1-(At/A0)]×100%

1.3.4羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌表面疏水性測定

按上述方法準(zhǔn)備菌懸液，用PBS洗滌三次并重懸。調(diào)整菌液濃度后在波長600 nm處測吸光度A0。取2 mL菌懸液與2 mL二甲苯混合，渦旋震蕩2 min，室溫靜置1 h，測定水向的吸光度At。

表面疏水性(%)=[1-(At/A0)]×100%

1.3.5羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌與大腸桿菌共聚性測定

按1%的接種量接種到培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，得到羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌的菌懸液。大腸桿菌用LB培養(yǎng)液培養(yǎng)20 h，得到大腸桿菌菌懸液。8 000 r/min離心10 min獲得羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌和大腸桿菌的菌體，分別用滅菌后的PBS緩沖溶液洗滌三次并重懸，調(diào)整羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌菌液的吸光度Aprobio，大腸桿菌菌液的吸光度為Apat；取等體積的乳桿菌和大腸桿菌菌液2 mL，混勻，37 ℃培養(yǎng)5 h，然后測定混合液的吸光度Amix。

共聚性(%)=[((Aprobio+Apat)/2-Amix)/(Aprobio+Apat)/2]×100%

1.3.6羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌對HT-29細(xì)胞的黏附性測定

HT-29細(xì)胞水浴解凍，8 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，加入5 mL完全培養(yǎng)液，吸出上清，保留細(xì)胞沉淀。加入3 mL無菌D-hanks緩沖溶液輕輕吹吸混勻。重復(fù)操作2次，加入1 mL完全培養(yǎng)液輕輕吹吸，混勻并移至培養(yǎng)皿中。放置于37 ℃培養(yǎng)，每隔2 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞培養(yǎng)皿上HT-29的覆蓋率達(dá)到80%后，可進(jìn)行黏附實驗。

將細(xì)胞爬片放置12孔板內(nèi)，取HT-29細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約為5×105cells/mL，置37 ℃培養(yǎng)12 h。加入羅伊氏乳桿菌R21-R28和植物乳桿菌AR326菌懸液各1 mL，再次放置于37 ℃孵育2 h。取出后用PBS緩沖溶液輕輕洗滌三次。每孔加入1 mL甲醇固定20 min，再用PBS緩沖溶液洗滌一次，用革蘭氏染色試劑盒染色，鏡檢計數(shù)。計算每100個細(xì)胞周圍黏附的乳桿菌數(shù)量。黏附實驗重復(fù)三次。

1.3.7羅伊氏乳桿菌R28的耐酸耐膽鹽測定

將羅伊氏乳桿菌R28的種子液分別接入pH3.0、pH4.0、pH 5.0、膽鹽含量0.1%、0.2%和0.3%和不含膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，取200 μL加入生長曲線孔板，利用Bioscreen C全自動生長曲線分析儀測定乳桿菌在不同pH和膽鹽濃度下的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(mean±SD)表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析并計算皮爾遜(Pearson)線性相關(guān)性系數(shù)，結(jié)果圖采用Origin8.0和GraphPad16.0繪制制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅伊氏乳桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹分析

對28株羅伊氏乳桿菌株進(jìn)行16S rRNA分析，利用鄰接法構(gòu)建發(fā)育樹。分析表明R1與R8之間差異性較小，表明這2株菌具有親緣關(guān)系。R13、R5、R7、R10這4株親緣關(guān)系明顯，與R1、R8親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。R28、R20與大部分羅伊氏乳桿菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 基于16S rRNA構(gòu)建的28株羅伊氏乳桿菌的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 乳桿菌自聚性、細(xì)胞表面疏水性、與大腸桿菌共聚性分析

如表1所示，所有考察的乳桿菌的自聚率范圍分布在4.27%～52.1%。羅伊氏乳桿菌菌株R2、R5、R8自聚性均小于10%，自聚能力較低。植物乳桿菌AR326的自聚性為39.77±8.47%。而羅伊氏乳桿菌菌株R22和R10的自聚性均高于40%，自聚效果明顯。所考察菌株的細(xì)胞表面疏水性范圍為1.35%～88.51%。其中羅伊氏乳桿菌菌株R1、R2、R3、R5、R6、R8、R9、R10、R12和R21的細(xì)胞表面疏水性較弱，均低于10%。相比之下，菌株R24、R27和R28表面疏水性極強，分別可達(dá)88.51±7.81%、86.39±6.78%和75.53±4.09%。植物乳桿菌AR326的疏水性為16.30±3.64%。菌株R28與大腸桿菌共聚效果最佳(36.84%)，說明在這28株羅伊氏乳桿菌中，菌株R28在腸道定植后，能夠與致病菌很好的接觸聚合，發(fā)揮抑菌作用。對植物乳桿菌AR326而言，其與大腸桿菌共聚效果也較好(24.78%)。

表1 乳桿菌自聚能力、細(xì)胞表面疏水性、與大腸桿菌共聚性及細(xì)胞黏附結(jié)果

2.3 乳桿菌對HT-29細(xì)胞的黏附性分析

從表1可看出，細(xì)胞黏附性的測定結(jié)果與羅伊氏乳桿菌的自聚性，疏水性，與大腸桿菌共聚性的測定結(jié)果之間具有一定程度的相關(guān)性。R20和R28的細(xì)胞黏附效果極佳，高達(dá)每100個細(xì)胞附近黏附大于4 000個乳桿菌細(xì)胞。R2和R5的細(xì)胞黏附效果及前三項指標(biāo)數(shù)值都較低，R1、R3、R6、R7、R12和R15的黏附效果較差。

2.4 羅伊氏乳桿菌自聚能力、表面疏水性、與大腸桿菌共聚性及HT-29細(xì)胞的黏附性相關(guān)性分析

相關(guān)性分析采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)表示。r為皮爾遜相關(guān)系數(shù)值。一般的，當(dāng)|r|<0.2時，可認(rèn)為兩變量基本不相關(guān)；0.2≤|r|<0.4，認(rèn)為兩變量低度相關(guān)；0.4≤|r|<0.6，認(rèn)為兩變量中度相關(guān)；0.6≤|r|<0.8，認(rèn)為兩變量高度相關(guān)；|r|≥0.8，認(rèn)為兩變量間極高度相關(guān)。由圖2A可知，羅伊氏乳桿菌的自聚性與細(xì)胞黏附性之間基本不相關(guān)(r=0.263,P>0.05)；由圖2B可知，疏水性和細(xì)胞黏附性為中度相關(guān)(r=0.476,P<0.01)；由圖2C可知，菌株與大腸桿菌的共聚性和細(xì)胞黏附性之間具有高度相關(guān)性(r=0.792,P<0.001)。由圖3D、3E、3F可看出，羅伊氏乳桿菌自聚性與大腸桿菌共聚性之間，以及自聚性與菌株表面疏水性之間相關(guān)度低，因此表面疏水性及與大腸桿菌共聚性可作為評價菌株黏附能力的有效指標(biāo)。

圖2 乳桿菌自聚性、與大腸桿菌的共聚性、細(xì)胞表面疏水性和細(xì)胞黏附性之間的相關(guān)性分析

圖3 羅伊氏乳桿菌R28耐酸、耐膽鹽生長曲線

2.5 乳桿菌R28耐酸耐膽鹽結(jié)果

在37 ℃下，檢測了羅伊氏乳桿菌R28在pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0,膽鹽濃度0.1%、0.2%、0.3%及未添加膽鹽的常規(guī)MRS培養(yǎng)條件下的生長曲線。在pH值為3.0的條件下，均未見菌株生長的跡象。在pH 4.0和pH 5.0的條件下，隨培養(yǎng)時間延長，OD600明顯增加，生長曲線可大致分為3個階段(遲滯期、對數(shù)期與穩(wěn)定期)。當(dāng)膽鹽濃度高于0.1%時，R28生長受到抑制，OD600顯著低于常規(guī)MRS培養(yǎng)條件下的觀測值。當(dāng)膽鹽濃度高于0.2%時，未觀察到菌濃明顯增加的跡象。

3 結(jié)論

通過對28株羅伊氏乳桿菌的自聚能力、表面疏水性、與大腸桿菌的共聚性的測定發(fā)現(xiàn)：菌株R22的自聚效果最佳，為52.1%；R28的自聚能力為26.25%；R5的自聚能力最弱，僅為4.27%。疏水性指標(biāo)測定結(jié)果顯示：R28，R27，R24的表面疏水性極強。R28與大腸桿菌的共聚效果檢測值最高可達(dá)36.84%。益生菌的黏附性、疏水性及自凝集作用均存在菌種特異性。

通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌的細(xì)胞表面疏水性與大腸桿菌共聚性，以及細(xì)胞黏附能力之間具有高度相關(guān)性，說明細(xì)胞表面疏水性及與大腸桿菌的共聚性可作為篩選黏附性良好的羅伊氏乳桿菌的評價指標(biāo)。最終確定R28為黏附性最強的羅伊氏乳桿菌，可很好黏附于腸道細(xì)胞，是益生菌制劑開發(fā)應(yīng)用中的潛力菌株。