盧義博，曾軍杰，陳思，王瑞瑞，張小軍

（1.浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316021）（2.浙江省海洋水產研究所，浙江舟山 316021）

（3.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江舟山 316021）

暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）主要分布在中國近海和長江中下游，其肉質鮮美，營養(yǎng)價值豐富，但是野生河豚魚體內均含有河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）可致人死亡。TTX是一種強效的海洋神經毒素，由Yoshizumi Tahara在1909年首次發(fā)現(xiàn)[1]，在1964年由Woodward、Hirata Yoshimasa和TsudaKyosuke同時確證了河豚毒素的正確結構[2]。TTX作為一種高度選擇性的鈉通道阻滯劑，可與肌肉或神經細胞的細胞膜上受體結合，從而使鈉離子通道關閉，降低Na+通道傳導性，阻斷動作電位，抑制神經和肌肉之間的興奮傳導，導致肌肉和神經麻痹，情況嚴重時，可致人死亡[3]。河豚毒素的毒性屬于劇毒物質，人體的最小致死量為0.5 mg[4]。目前，已在多種海洋生物和陸地生物種檢測出河豚毒素，日本[5]、中國[6]、泰國[7]、巴西[8]等多個國家發(fā)現(xiàn)多起河豚毒素中毒事件。

目前，關于河豚毒素的起源仍存在爭議。Yasumoto[9]和Noguchi[10]認為河豚魚可能并不能夠產生河豚毒素，而是通過食物鏈獲得毒素。Matsui等[11]、Yamamori等[12]、Honda等[13]、Kono等[14]發(fā)現(xiàn)，經過長期人工養(yǎng)殖和培育的河豚魚其體內不含有河豚毒素，但是通過投喂含有河豚毒素的飼料后又重新獲得毒性。因此，河豚魚必然存在相應的耐受機制來應對河豚毒素的蓄積。肝臟作為生物體內中最重要的代謝器官，其組織中含有大量豐富的代謝酶。谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）是肝臟生化反應中不可或缺的催化劑，是肝功能測試的重要指標[15]。堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）在機體生長代謝和生理健康過程中起發(fā)揮重要作用，同時是檢測機體受到損傷的重要指標[16]。乳酸脫氫酶（LDH）參與多種供能反應，在能量代謝過程當中發(fā)揮重要作用[17]。

本實驗選擇國內開放養(yǎng)殖的暗紋東方鲀?yōu)檠芯繉ο?，采用口服灌喂河豚毒素的方法，利用超高效液相色譜串聯(lián)質譜法（UPLC-MS/MS）測定河豚毒素在不同時間的組織含量，分析暗紋東方鲀體內的河豚毒素分布轉移規(guī)律，為河豚魚養(yǎng)殖提供指導建議，同時測定肝臟組織中五種代謝酶的活力，初步探討了暗紋東方鲀對河豚毒素的耐受性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼養(yǎng)

實驗動物采購地點為福建省漳州市東坂村，品種為暗紋東方鲀，實驗魚個體平均體長15.4±0.7 cm，平均體重232±25 g。采用GB 5009.206-2016方法對實驗魚進行UPLC-MS/MS檢測得出本批次實驗魚各組織中均不含有TTX。

將暗紋東方鲀體長置于120 L淡水（鹽度8‰~10‰）中，每個水箱10尾，溫度22~25 ℃。溶氧量大于6 mg/L，氨氮量小于1 mg/L，增氧機24 h全開，自然光照。在進行灌喂實驗之前，配合飼料喂養(yǎng)7 d。每天投喂1次，投喂量根據(jù)魚重（濕重）3%計算。

1.2 實驗餌料準備

健馬牌鰻魚配合飼料，粉末狀，水分含量小于10%，粗蛋白含量大于43%，粗纖維含量小于4%，氨基酸含量大于2.1%，粗灰分含量下小于18%，總磷含量大于1%。

河豚毒素粗提取物由本實驗室從河鲀肝臟中提取純化獲得，濃度為8.5 μg/mL。將飼料、水與河豚毒素粗提取物充分混合均勻，使其TTX的含量為850 ng/mL。

1.3 試劑與材料

河豚毒素標準品，純度≥98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈均為色譜純，德國Merck公司；甲酸、氯化鈉（NaCl）、二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、氫氧化鈉（NaOH），上海國藥集團；甲酸、醋酸銨均為色譜純，美國Sigma公司；實驗用水為超純水；河豚毒素免疫親和柱，北京美正生物科技有限公司，柱容量：1000 ng；總蛋白定量測試盒、乳酸脫氫酶測試盒、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶測試盒、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶試劑盒，訂購于南京建成生物工程研究所。

河豚毒素標準溶液配制：準確稱取河豚毒素標準品5.00 mg，使用0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈（1:1，V/V）的混合溶液充分溶解后準確定容至50 mL，4 ℃下避光儲存6個月，使用時用0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈（1:9，V/V）的混合溶液逐級稀釋。

0.05 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）：分別稱取NaCl 4.25 g、NaH2PO4·2H2O 1.09 g、Na2HPO4·12H2O 6.45 g，用超純水定容至500 mL，pH約為7。

1.4 儀器與設備

AcquityTM超高效液相色譜儀、Quattro Preemier XE串聯(lián)三重四級桿質譜儀，美國Waters公司；LPD2550型多管渦旋混合儀，萊普特科學儀器有限公司；Avanti JXN_30高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司；Nitrogen Evaporator 112型氮吹儀，美國Organomatio公司；超聲波清洗器，上海易凈超聲波儀器有限公司；固相萃取儀，上海那艾精密儀器有限公司；缸外過濾器HW-704B，森森水族公司；鹽度計，臺灣衡欣公司；交直流電增氧泵S-600BX、MK3微孔板酶標儀，美國ThermoLabsystems公司；可見風光光度計，美國瓦里安公司。

1.5 實驗設計與取樣

將暗紋東方鲀分成空白對照組和灌喂劑量組，空白對照組灌喂水與飼料混合液，灌喂劑量組灌喂含量為850 ng/mL的水、飼料、河豚毒素粗提取物的混合飼料。每組設三個重復組。實驗操作如下：取一根特氟龍管（外徑=3 mm，長度為70 mm）與5 mL注射器相連，將混合的飼料勻漿1 mL盡可能深地插入河豚魚的消化道，然后將1 mL含TTX的飼料勻漿擠入消化道，分別灌喂后，保持魚身直立3~5 min，觀察河豚魚是否通過鰓排泄飼料勻漿溶液。隨后將河豚魚放回暫養(yǎng)池中，實驗期間的投喂與管理與暫養(yǎng)期間相一致，每天觀察河豚魚的生理情況，及時清理水池污染物和補充新鮮干凈水體。

從實驗魚灌喂飼料勻漿前作為起始0 h同時進行計時觀察和記錄。實驗選擇在0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、168 h、336 h分別取樣，每次取3條河豚魚，同時記錄每條魚的體重。分別收集皮膚、肌肉、肝臟、血液（肝動脈取血）、腎臟、膽、脾、腸道、鰓各組織，將各組織用4 ℃的PBS緩沖鹽溶液沖洗雜質和血液。取1 mL血液和2 g肝臟儲藏在-60 ℃的冰箱中獨立儲存，其余樣品均質后放置-20 ℃冰箱中待測。

1.6 不同組織中河豚毒素的提取、凈化

河豚魚體內的河豚毒素提取參照國標GB 5009.206-2016并做出適當修改：稱量肌肉、皮膚、肝臟等器官均質樣品2 g（少于2 g的組織樣本全部稱量）或血液2 mL于50 mL具塞離心管中，使用10 mL 2%乙酸-甲醇提取，渦旋振蕩5 min，60 ℃水浴超聲提取15 min，分別在5 min和10 min時渦旋30 s。取出恢復常溫，8000 r/min離心7 min。取上清液5 mL與20 mL PBS緩沖鹽溶液混合均勻。加入適量1 mol/L NaOH溶液使pH至6.8~7.2之間，過柱待測。

1.7 TTX檢測方法

1.7.1 色譜條件色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH Amide柱（100×2.1 mm，1.7 μm）；進樣量5 μL；樣品室溫度10 ℃；柱溫40 ℃；流速：0.3 mL/min；流動相A：0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B：乙腈；梯度洗脫條件如下：0～1.5 min，90%～90% B；1.5～2 min，90%～40% B；2～4 min，40%～40% B，2～4 min，40%～90%，B。

1.7.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（electorspray ionization，ESI），正離子模式掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細管電壓：3.5 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：385 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔氣流量：55 L/h；檢測參數(shù)條件見表1。

表1 河豚毒素質譜檢測參數(shù)Table 1 Detection parameters of tetrodotoxin mass spectrometry

1.7.3 標準曲線的配制及回收率與精密度的考察

用0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈(1:9，V/V)的初始流動相稀釋TTX標準品使用液，配制成濃度為1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、20.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL的標準曲線。外用外標法定量，以TTX的物質含量為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標進行線性回歸。

分別稱量陰性暗紋河豚魚肌肉、皮膚、肝臟、腸道、鰓2 g；血液2 mL；腎臟、膽、脾、性腺適量，添加一定量TTX標準品使用液，使其不同組織濃度分別為1.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL，平行樣本數(shù)量為3，計算回收率和相對標準偏差。

1.8 肝臟代謝酶的檢測

總蛋白的測定采用BCA法測定；AST和ALT均采用King氏法測其酶活性，單位定義為：25 ℃時，1 min內產生的丙酮酸與NADH發(fā)生氧化反應產生NAD+，使得吸光度下降0.001位時為1個活力單位。AKP和ACP的酶活力采取比色法測定，其活力單位為：100 mL血清在37 ℃與底物反應30 min生成1 mg酚為1個活力單位。LDH酶活力使用比色法測定，活力單位為：每克組織蛋白37 ℃與基質作用15 min，反應體系中產生1 μmol丙酮酸為1單位。

1.9 數(shù)據(jù)處理分析

實驗結果用SPPS 26.0統(tǒng)計與分析。相關性分析選擇皮爾遜系數(shù)，單因素方差分析采用鄧肯檢驗進行多重比較，p<0.05表示具有顯著差異性。Excel 2016作圖分析。

2 結果與討論

2.1 標準曲線及回收率與精密度

實驗數(shù)據(jù)顯示，TTX的濃度范圍在1.00 ng/mL~100.00 ng/mL時線性關系較好，回歸方程式為y=1375.18x-53.0638，r2>0.9999。

在本實驗條件下，肌肉、肝臟、皮膚、血液等不同組織中TTX的平均回收率均在75.37%~90.64%，實驗相對標準偏差為3.09%~8.08%，小于10%。結果表明本方法回收率和精密度可以滿足檢測分析要求，適用于河豚魚各組織中的河豚毒素檢測。

2.2 給藥方式及劑量選擇

目前關于河豚毒素的給藥方式主要分為三種，有毒飲食喂養(yǎng)（Toxic diet-feeding，TDF）、肌肉給藥（Intramuscular administration，IMA）和口服灌喂給藥（Oral gavage administration，OGA）[18]。有毒飲食喂養(yǎng)具有準確模擬自然界進食的特點，但是存在個體受藥不均勻的現(xiàn)象，投喂耗時長、魚體之間平行性較差的缺點。肌肉給藥方式可以快速準確定量給藥并且同時保證魚體平行性，但是肌肉注射破壞河豚魚的免疫防御系統(tǒng)，從而產生應激反應，導致體內酶活力的改變，從而難以區(qū)分河豚毒素帶來的分子差異。口服灌胃給藥方式綜合了有毒飲食喂養(yǎng)和肌肉給藥兩種方式的優(yōu)點，即耗時短，準確定量、平行性好，同時也能夠避免給藥方式對河豚魚帶來生理影響。

TTX毒性較強，研究表明，兔子的肌肉體內注射的最小致死量（MLD）為5.30 μg/kg，小鼠腹腔注射半數(shù)致死量（LD50）10.70 μg/kg[19]。綜合實驗室河豚毒素粗提取物的濃度以及暗紋東方鲀的狀態(tài)，選擇灌喂河豚毒素濃度為850 ng TTX/mL混合勻漿飼料1 mL，即850 ng河豚毒素。

2.3 TTX在暗紋東方鲀體內的轉移分布律

在不同轉移時間的條件下，排除無法定量的血液，暗紋東方鲀對河豚毒素吸收率如表2所示。

表2 暗紋東方鲀在不同轉移時間下TTX的吸收率Table 2 TTX absorption rate of Takifugu obscurus under different transfer time

數(shù)據(jù)顯示，灌喂2 h后河鲀魚對TTX的吸收率最高，隨后時間的增加而逐漸的減少，在48 h時，TTX的殘留量達到最低，為18.00%；隨后TTX的殘留量會出現(xiàn)低幅度的上調，在最長轉移時間內，殘留量大約穩(wěn)定31%。

為了探討TTX的轉移規(guī)律，實驗分別對不同時間下暗紋東方鲀各組織中的TTX含量變化和各組織的相對毒素量(占投毒總量的百分比)進行分析，結果如圖1和圖2所示。在暗紋東方鲀中經灌喂給藥到腸道的TTX被吸收到體內，且主要轉移到肝臟、皮膚、肌肉和性腺。腸道中TTX相對毒物量隨著時間的增加而逐漸減少，這有可能是因為腸道可以作為吸收屏障阻礙TTX的吸收，或者是TTX迅速被腸道中的酶分解為本實驗未檢測出的代謝物[20]。在2 h時，鰓組織中的TTX含量濃度最高為31.75 ng/g，此時該組織的相對毒物量為12.44%。在實驗灌喂過程中發(fā)現(xiàn)暗紋東方鲀可以通過鰓將灌喂的TTX勻漿飼料排泄出來，說明暗紋東方鲀在口服灌胃給藥的方式下，鰓是最主要的排泄器官。

圖1 短期灌喂下暗紋東方鲀各組織中的TTX濃度變化Fig.1 Changes of TTX concentration in various tissues of Takifugu obscurus under short-term irrigation

圖2 2、48、336 h時暗紋東方鲀各組織中TTX相對毒素量Fig.2 The relative amount of TTX toxin in each tissue of Takifugu obscurus at 2 h, 48 h and 336 h

性腺組織TTX的濃度在整個轉移過程中一直處于較高水平，TTX的濃度隨著時間的增加而增加，相對毒物量由0.47%逐漸上升至1.43%，TTX含量從19.00 ng/g升到42.02 ng/g，蓄積率為121%。肝臟中的TTX濃度普遍低于性腺，但是均高于皮膚中TTX的濃度。Ryohei Tatsuno等[21]通過灌喂不同月齡的紅鰭東方鲀發(fā)現(xiàn)，6月齡的幼魚，毒素含量主要集中在皮膚，其次是肝臟，而15月齡的河豚魚其主要蓄積器官為肝臟，其次是皮膚和性腺。Vaishali Bane等[22]發(fā)現(xiàn)，發(fā)育成熟期的河豚魚，皮膚中的TTX逐漸轉移至肝臟，在性成熟時期，肝臟組織中的TTX逐漸轉移至性腺，主要是卵巢。本實驗選擇接近性成熟的暗紋東方鲀，肝臟發(fā)育完全，性腺接近成熟，因此性腺是本實驗的主要蓄積器官，肝臟次之。同時實驗發(fā)現(xiàn)，各臟器包括腎臟、脾臟、膽在轉移分布前期TTX的濃度呈先升后降的趨勢，作為生物代謝的主要反應器官，推測各組織參與了TTX前期的代謝和消除。肝臟中TTX的含量在48 h時降至最低為1.27 ng/g，相對毒物量為3.47%，但肝臟作為第二蓄積器官在48 h后組織中的TTX逐漸增加，在轉移后期相對毒物量均占比第一。

Takuya Matsumoto等[23]認為河豚魚可通過與特定的蛋白（PSTBP）相結合，從而降低與鈉離子通道的結合所帶來的神經毒性，以此來提高河豚魚對TTX的耐受性。此外，Mari Yotsu-Yamashita等[24]在2001年首次從豹紋東方鲀的血液中分離此蛋白，并且Mari Yotsu-Yamashita等[25]在2003年通過免疫組織化學染色法發(fā)現(xiàn)豹紋東方鲀中肝臟、腸道、皮膚和卵巢均含有PSTBP。本實驗發(fā)現(xiàn)皮膚和血液組織中的TTX含量在灌喂初期最高，分別為7.43 ng/g和11.44 ng/g，此后隨著時間的增加而逐漸降低，因此推測皮膚和血液可能通過PSTBP參與TTX的轉運過程。

2.4 五種肝臟代謝酶的活力變化

2.4.1 不同時間下暗紋東方鲀肝臟中乳酸脫氫酶（LDH）活力變化

隨著轉移時間的增加和肝臟中TTX的含量不斷改變，肝臟中的LDH活力變化如圖3所示。SPSS雙變量相關分析得出，LDH活力與TTX的含量的相關系數(shù)0.415，p=0.233（p>0.05），說明兩者之間相關不顯著。肝臟中的LDH活性呈波動性變化，首先在0~24 h時先升高后降低，在第6 h出現(xiàn)峰值，且峰值顯著性高于其它值（p<0.05）。其次在24 h后逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)，且無明顯差異（p>0.05），此時LDH活力高于0 h，即灌喂TTX后暗紋東方鲀肝臟中LDH活力略微升高。LDH是糖無氧酵解及糖異生反應中的重要參與酶，在生物氧化還原反應中發(fā)揮重要作用，JonnA.Berges等[26]研究發(fā)現(xiàn)LDH可以作為衡量無氧代謝水平的檢測指標之一。LDH活力升高說明灌喂TTX后河豚魚無氧代謝反應旺盛，糖酵解反應持續(xù)進行，可為組織器官轉移代謝河豚毒素提供了能量，提高了機體的耐受量。

圖3 灌喂TTX后不同時間下肝臟中LDH活力和TTX含量的變化Fig.3 Changes of LDH activity and TTX content in the liver at different times after feeding TTX

2.4.2 不同時間下暗紋東方鲀肝臟中轉氨酶活力變化

圖4 灌喂TTX后不同時間下肝臟中ALT（a）和AST（b）活力與TTX含量的變化Fig.4 Changes of ALT (a) and AST (b) activity and TTX content in the liver at different times after feeding TTX

肝臟中TTX含量及ALT和AST活性隨時間的變化趨向如圖所示。SPSS雙變量相關分析得出，ALT活性與TTX的含量的相關系數(shù)為0.109，p=0.765（p>0.05），說明兩者之間相關不顯著。AST活力與TTX的含量的相關系數(shù)為0.649，p=0.042（p<0.05），說明兩者之間顯著相關。

ALT和AST活力變化趨勢相似，呈先升高后降低最終趨于穩(wěn)定的趨勢。ALT和AST活力在6 h時達到最高點（p<0.05），在48 h后逐漸趨于穩(wěn)定（p>0.05），此時兩種酶活力的值均高于對照組。2010年Mari Yotsu-Yamashita等[27]發(fā)現(xiàn)，可通過改變河豚魚組織中鈉離子通道的氨基酸序列進而提高機體對TTX的耐受性。因此推測轉氨酶活力的提高有利于河豚魚體內蛋白質轉化為游離氨基酸，從而與LDH共同提供河豚魚轉運河豚毒素所需的能量以及增加鈉離子通道中氨基酸的豐富度。

2.4.3 不同時間下暗紋東方鲀肝臟中磷酸酶活力變化

圖5 灌喂TTX后不同時間下肝臟中AKP（a）和ACP（b）活力與TTX含量的變化Fig.5 Changes of AKP (a) and ACP (b) activity and TTX content in the liver at different times after feeding TTX

肝臟中TTX含量及AKP和ACP酶活性隨時間的變化趨向分別如圖所示。相關分析得出，AKP酶活力與TTX的含量的相關系數(shù)為0.718，p=0.019（p<0.05），說明兩者之間顯著相關。ACP酶活力與TTX的含量的相關系數(shù)為0.589，p=0.072（p>0.05），說明兩者之間相關不顯著。

磷酸化和去磷酸化是生物機體新陳代謝的過程，其中磷酸酶是該反應不可或缺的催化劑，其中AKP和ACP同時是機體判斷健康狀態(tài)和免疫功能的重要參數(shù)。在本實驗中，AKP活力和ACP活性變化趨向相近，呈先下降后上升最終趨于穩(wěn)定。AKP和ACP活力在4 h時降至最低水平（p<0.05），表明大量TTX的灌喂引起了暗紋東方鲀的應激反應，降低了魚體的免疫力。隨后，AKP和ACP活力逐漸上升，分別在12 h和48 h時達到最高點（p<0.05），在此過程中磷酸酶活力增加以增強河豚魚免疫防御能力，從而降低TTX對機體免疫系統(tǒng)的破壞。Takuya Matsumoto等[28]通過抑制性消減雜交技術檢測出河豚魚經肌肉注射后肝臟組織中在免疫因子表達上調，該實驗結果證實了本實驗的可能性。最后AKP和ACP分別在48 h和72 h后逐漸趨于穩(wěn)定（p>0.05）。

3 結論

實驗以暗紋東方鲀?yōu)檠芯繉ο?，采用口服灌喂河豚毒素的給藥方式，結合超高效液相色譜串聯(lián)質譜法分析河豚毒素在不同組織器官中的轉移分布規(guī)律，并同時對比分析肝臟組織中代謝酶活力的差異來探討河豚毒素的耐受機制。結果表明，性腺是河豚毒素首要蓄積器官，肝臟是第二蓄積器官且與腎臟、脾臟、膽同時參與河豚毒素的轉移代謝，皮膚和血液是參與河豚毒素的轉運分布的主要組織，鰓是河豚毒素主要的排泄器官，腸道是河豚毒素的直接接觸的器官。同時河豚魚可通過提高肝臟中乳酸脫氫酶、轉氨酶活性和調整不同時間下磷酸代謝酶活性，共同應對河豚毒素對機體的損傷。