李笑笑，孫東曉，張祎，孫為正

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

大豆蛋白具有優(yōu)異的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性，是人類(lèi)膳食中重要的蛋白來(lái)源[1,2]。還因其優(yōu)良的功能特性如乳化性、持油性、持水性、發(fā)泡性等在食品工業(yè)生產(chǎn)中有著廣泛應(yīng)用[2,3]。由于商業(yè)大豆分離蛋白（SPI）在提取工藝中經(jīng)過(guò)濕熱處理、加熱滅酶處理等過(guò)程，導(dǎo)致蛋白嚴(yán)重變性，進(jìn)而影響其功能性質(zhì)[4]，這很大程度上限制了SPI營(yíng)養(yǎng)和功能特性的開(kāi)發(fā)利用。因此，通過(guò)改性處理以改善商業(yè)SPI的功能特性并提高其生物有效利用率已成為行業(yè)的研究熱點(diǎn)之一。其中，物理改性是一種綠色、成本低、效率高的食物蛋白改性方式。近年來(lái)，許多超聲波技術(shù)的應(yīng)用研究表明，超聲能夠顯著改變SPI的結(jié)構(gòu)，并且進(jìn)一步起到改善其功能特性的作用[3,5,6]。但同一處理?xiàng)l件，蛋白濃度不同，改善效果也存在一定差異。湯虎等人[7]的研究發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)的小麥面筋蛋白經(jīng)過(guò)超聲后溶解度有顯著差異。Gordon[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的蛋白經(jīng)超聲處理后，其顆粒大小與濃度顯著相關(guān)。Tang等人[9]在研究中采用高壓處理三種濃度的大豆分離蛋白（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為1%（W/V）、3%（W/V）、5%（W/V）），結(jié)果表明大豆分離蛋白經(jīng)過(guò)高壓處理后各項(xiàng)理化性質(zhì)如表面疏水性、游離巰基含量、熱力學(xué)性質(zhì)、蛋白溶解性、乳化性質(zhì)和熱致凝膠性都與蛋白濃度有著密切的關(guān)系。Boulet等人[10]的研究表明β-乳球蛋白在一定pH和溫度條件下，聚集體的粒徑大小取決于蛋白濃度大小，聚集程度和體積濃度的增大呈現(xiàn)對(duì)數(shù)增加現(xiàn)象。

因此，本文選取兩個(gè)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)（3%（W/V）和5%（W/V））商業(yè)SPI進(jìn)行超聲波處理，研究SPI經(jīng)超聲處理后的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而研究其結(jié)構(gòu)變化與溶解性改善作用的關(guān)系，研究結(jié)果將對(duì)食品工業(yè)超聲預(yù)處理參數(shù)選擇提供方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 原料

商業(yè)SPI采購(gòu)自廣州合誠(chéng)實(shí)業(yè)有限公司，經(jīng)凱氏定氮法測(cè)得其蛋白含量為88.74%。

1.2 試劑與設(shè)備

1.2.1 試劑

電泳預(yù)制膠（濃縮膠4%，分離膠12%）、分子量標(biāo)準(zhǔn)品（PM2510，10 ku~180 ku）、樣品緩沖液等購(gòu)買(mǎi)自碧云天生物技術(shù)有限公司。其余常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純且購(gòu)買(mǎi)自廣州叢源科技儀器有限公司。

1.2.2 主要儀器設(shè)備

凱氏定氮儀KND-103F，上海纖檢儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)CR22N，日本日立公司；pH計(jì)pHS-3E，北京雷磁儀器有限公司；激光衍射粒度儀Mastersizer 2000，英國(guó)Malvern公司；PowerPacTM Basic電泳儀，美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司；細(xì)胞破碎儀JY92-Ⅱ DN，寧波新芝生物科技股份有限公司；磁力攪拌器JB-1，上海雷磁新涇儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀Thermo Scientific 3001，芬蘭Thermo Fisher科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲處理大豆分離蛋白

超聲處理參照Hu等[11]方法并略有改動(dòng)。配制3%（W/V）和5%（W/V）的商業(yè)SPI分散液，調(diào)節(jié)pH至7.0。室溫下（25±1 ℃）磁力攪拌3 h使SPI充分溶解，置于4 ℃過(guò)夜水化。在超聲處理過(guò)程中保持樣品處于冰水浴中以防蛋白過(guò)熱。超聲儀工作電壓220 V，頻率50 Hz，變幅桿末端（超聲探頭）直徑6 mm。超聲功率分別為200 W、400 W、600 W、800 W，超聲時(shí)間均為15 min。未超聲處理樣品為Control。

1.3.2 溶解度測(cè)定

溶解度測(cè)定參照湯虎等[7]方法并稍加改動(dòng)。將樣品用去離子水稀釋至5 mg/mL，雙縮脲法測(cè)定蛋白含量。樣品離心（25 ℃，15 min，12000 r/min）后取上清液測(cè)定蛋白含量。蛋白質(zhì)溶解度即上清液中蛋白質(zhì)與總蛋白質(zhì)含量比值。

1.3.3 表面疏水性測(cè)定

由于蛋白質(zhì)溶解度較低，故采用溴酚藍(lán)（BPB）結(jié)合法來(lái)測(cè)定蛋白表面疏水性，步驟參考Shen等人[12]并略有改動(dòng)。SPI分散液稀釋到5 mg/mL，用雙縮脲試劑法測(cè)定蛋白含量。取1 mL稀釋后的SPI分散液加入200 μL溴酚藍(lán)溶液（1 mg/mL）渦旋混合，室溫下反應(yīng)10 min，作為樣品組。用1 mL去離子水代替1 mL稀釋后的SPI溶液和200 μL溴酚藍(lán)溶液渦旋混合，作為空白對(duì)照。樣品經(jīng)12000 r/min，25 ℃條件下離心15 min，上清液稀釋10倍，測(cè)定595 nm處吸光值。分別將樣品組和空白對(duì)照組記為Abs樣品和Abs空白。表面疏水性用溴酚藍(lán)結(jié)合量（BPB bound，μg）表示：

1.3.4 粒徑分布測(cè)定

SPI粒徑分布采用激光散射粒度分析儀測(cè)量，具體步驟參照Han等[13]的方法。測(cè)定時(shí)分散劑的折射率設(shè)為1.626，顆粒折射率為1.33，顆粒吸收率為0.001。所有測(cè)量重復(fù)3次。結(jié)果數(shù)據(jù)中D4,3指的是體積平均直徑，D3,2指的是表面積平均直徑。

1.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

分離膠的濃度是12%，濃縮膠的濃度是4%。詳細(xì)步驟參考陳曦等[14]并稍加改動(dòng)。用去離子水將樣品稀釋至5 mg/mL。分別取150 μL SPI分散液，加入50 μL樣品緩沖液（含二硫蘇糖醇），在沸水浴中處理10 min。然后離心（12000 r/min，10 min），取10 μL上清液進(jìn)樣。凝膠電泳結(jié)束后，用染色液將預(yù)制膠染色1 h。染色完成后脫色，脫色時(shí)間約20 h。染色液的成分主要是0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250、45%（W/V）乙醇和10%冰乙酸。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)采用Duncan's新復(fù)極差法比較3組實(shí)驗(yàn)均值在0.05水平上是否有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶解度

由表1知，未經(jīng)過(guò)超聲處理的3%（W/V）SPI溶解度為25.54%，5%（W/V）SPI的溶解度為24.22%；經(jīng)過(guò)超聲處理后，所有樣品的溶解度都有顯著性提升（p<0.05），3%（W/V）SPI超聲處理（200 W、400 W、600 W和800 W）溶解度分別提高了75.90%、87.40%、54.90%和35.70%，5%（W/V）SPI超聲處理后溶解度分別提高了68.20%、73.90%、65.00%和52.80%。而5%（W/V）SPI在同等功率超聲作用下所得的溶解度都小于3%（W/V）SPI。當(dāng)超聲功率達(dá)600 W后，兩種濃度的SPI溶解度較為接近。而在800 W超聲后，5%（W/V）SPI具有更高的溶解度。

表1 超聲處理前后商業(yè)SPI的溶解度變化Table 1 Protein solubility of ultrasound-treated and untreated comercial SPI in different concentration

溶解度是影響蛋白質(zhì)功能特性的主要指標(biāo)，是決定蛋白質(zhì)應(yīng)用的關(guān)鍵理化特性。200 W和400 W的超聲處理，使SPI溶解度升高，主要原因可能是蛋白分子聚合物被超聲波的空穴氣泡和湍流等打散。當(dāng)超聲波功率增大到600 W和800 W時(shí)，溶解度呈下降趨勢(shì)，其主要原因可能是過(guò)度展開(kāi)的SPI分子之間通過(guò)疏水相互作用，形成部分不溶性的聚集體，進(jìn)而導(dǎo)致溶解度的下降。湯虎等人[7]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)540~720 W改性小麥面筋蛋白，蛋白溶解度變化與超聲功率的提高呈正相關(guān)，但超聲功率大于720 W后，溶解度顯著下降，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其規(guī)律相類(lèi)似。超聲波的空穴效應(yīng)產(chǎn)生的如渦旋、局部高壓、湍流剪切力等使得較大顆粒的蛋白聚集體解聚成更小的蛋白顆粒。超聲波作用改變了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，增加了蛋白質(zhì)和水分子之間的相互作用[3,5,9,15]。

2.2 表面疏水性

蛋白質(zhì)分子的疏水相互作用在維持其三級(jí)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定的空間構(gòu)象等方面有著重要作用[16]，蛋白質(zhì)表面疏水性結(jié)果如表2所示，SPI經(jīng)超聲處理（200 W和400 W）后，蛋白分子聚集體被機(jī)械作用打散，粒徑減小，疏水性降低，溶解度升高。而超聲600 W和800 W后蛋白疏水基團(tuán)進(jìn)一步暴露，疏水性略有增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子形成部分聚集體，粒徑增大，溶解度降低。值得注意的是，5%（W/V）SPI溴酚藍(lán)結(jié)合量在800 W時(shí)有輕微減少，對(duì)應(yīng)溶解度有小幅度上升。Hayakawa和Nakai[17]研究表明蛋白質(zhì)的表面疏水性變化趨勢(shì)通常與其溶解性呈負(fù)相關(guān)。主要是由于蛋白疏水性殘基暴露增加蛋白質(zhì)的表面疏水性，蛋白分子表面疏水性基團(tuán)廣泛參與蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解性降低[18]。

表2 超聲波處理對(duì)兩種濃度的大豆分離蛋白表面疏水性的影響Table 2 Surface hydrophobicity of ultrasound-treated and untreated SPI of two different concentration

2.3 粒徑

經(jīng)超聲處理和未處理的SPI粒徑分布見(jiàn)圖1，平均粒徑見(jiàn)表3。在未經(jīng)超聲波處理的樣品中，3%（W/V）SPI平均粒徑和5%（W/V）SPI基本接近，由圖1和表3可知，所有功率的超聲波處理都使得SPI粒徑顯著降低（p<0.05）。但經(jīng)超聲波處理后，在200 W、400 W和600 W功率下，3%（W/V）SPI的平均粒徑均小于5%（W/V）SPI。而在800 W的超聲作用下，5%（W/V）SPI平均粒徑低于3%（W/V）SPI，這可能是800 W的超聲作用讓5%（W/V）SPI更早地進(jìn)入了重新解聚的過(guò)程。

表3 超聲波處理對(duì)大豆分離蛋白粒徑的影響Table 3 Average SPI size after ultrasound treatment

圖1 超聲處理前后的大豆分離蛋白粒徑分布：3%（W/V）SPI（a）和5%（W/V）SPI（b）Fig.1 Size volume distribution of treated and untreated 3%(W/V) SPI (a) and 5% (W/V) SPI (b)

超聲波促使蛋白粒徑減小的原理是超聲波產(chǎn)生的空穴效應(yīng)和微流束現(xiàn)象，兩者的機(jī)械作用破壞了蛋白分子之間的相互作用[2,4]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集物或者大顆粒顯著減少。但在600 W和800 W處理時(shí)，SPI粒徑顯著增大，這可能是更高功率的超聲波使蛋白疏水基團(tuán)暴露，疏水性上升，導(dǎo)致蛋白發(fā)生了一定程度的重新聚合[5]。從圖表中可見(jiàn)，Control樣品主要分布在10~100 nm范圍內(nèi)，呈單峰狀態(tài)分布，分布較為均勻。200 W超聲處理后SPI粒徑顯著降低，呈雙峰分布，小粒徑的峰仍占主要部分。400 W超聲后粒徑進(jìn)一步減小，小粒徑顆粒所占比例增加，大粒徑分布減少。600 W超聲后粒徑分布接近400 W，雙峰向大粒徑方向偏移。800 W超聲后粒徑增大，仍呈雙峰分布。兩峰分布面積趨向于接近。造成這種現(xiàn)象的主要原因在低功率下，蛋白分子的聚集體在超聲波作用下解聚導(dǎo)致粒徑減小。但在達(dá)到一定功率后，在600 W以及800 W超聲波作用下，部分蛋白分子彼此聯(lián)接，重新產(chǎn)生聚合體，造成粒徑變大。

2.4 電泳（SDS-PAGE）

圖2 為超聲處理后大度分離蛋白的電泳圖。由圖2可知，還原條件下，商用大豆分離蛋白呈現(xiàn)清晰的7S和11S亞基。經(jīng)超聲處理后，3%（W/V）和5%（W/V）SPI的電泳條帶均表明大豆球蛋白的A亞基和B亞基和伴大豆球蛋白的β亞基、α′亞基和α亞基并未遭到破壞。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果和胡昊[5]、包中宇[3]等的研究結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，一定功率的超聲波處理并不會(huì)破壞大豆分離蛋白的亞基結(jié)構(gòu)，綜合溶解度和粒徑的結(jié)果分析，超聲波處理能顯著影響蛋白分子聚集體的解聚和重構(gòu)，在整個(gè)改性過(guò)程中也促使蛋白質(zhì)分子粒徑發(fā)生變化。

圖2 超聲處理前后3%（W/V）（a）和5%（W/V）（b）SPI電泳圖Fig.2 SDS-PAGE graph of treated and untreated 3% (W/V) SPI(a) and 3% (W/V) SPI (b)

3 結(jié)論

3.1 本文以商業(yè)SPI為原料，對(duì)兩種質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)（3%（W/V）和5%（W/V））的商業(yè)SPI進(jìn)行不同功率梯度（200 W、400 W、600 W、800 W）的超聲處理，研究對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響，解析結(jié)構(gòu)變化對(duì)溶解性的影響。

3.2 經(jīng)過(guò)超聲處理后，SPI的溶解性呈先增加后降低的趨勢(shì)，400 W的超聲處理可獲得最大溶解性；超聲處理對(duì)不同體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SPI溶解性具有不同的影響，低功率超聲處理（<400 W）可使3%（W/V）SPI獲得較好的溶解性，而高功率超聲處理（800 W）5%（W/V）SPI溶解性優(yōu)于3%（W/V）SPI。

3.3 超聲處理對(duì)不同體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SPI的表面疏水性、粒徑具有不同的影響，表明低強(qiáng)度的超聲處理可解聚SPI聚集體，而高強(qiáng)度超聲處理可使SPI形成新的聚集體且不會(huì)引起SPI亞基的變化。